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化學發光法的基本原理范文1
【關鍵詞】 流動注射分析；水質監測；應用
1 流動注射分析法概況
流動注射分析技術（Flow Injection Analysis，FIA）是由丹麥技術大學的RUZICKA和HANSEN于1974年提出的。FIA是在物理不平衡以及化學不平衡條件下，進行動態分析測量的一種微分析技術。該技術的突出特點在于其精度高、分析速度較快、適用范圍廣、節省試劑和試樣、設備比較簡單、操作簡便、容易實現在線監測。該法是實現溶液的自動化分析的有效手段，很多的科研工作者也在不斷地推動FIA法作為標準分析方法。
2 FIA的基本工作原理
FIA是把一定體積的液體試樣間歇性地注入到一個密閉的、運動著的、由適當液體（水及反應劑）組成的連續載液之中，利用載流液體井試樣推入反應管道中，試樣以一定的流速度在反應管道中向前運動，依靠對流作用和擴散作用將試樣分散成為具有一定濃度梯度的試樣帶。在流動過程中，試樣帶與載流中的某些化學組成發生反應，生成可以被檢測的物質，載流液體將這些物質帶入到檢測器中并進行檢測，同時記錄儀將連續地記錄下檢測器的響應，從而進行定量分析。
在使用FIA分析的過程中，所有的試樣都要通過分析通道，并按順序以完全相同的方式進行分析處理，在這個過程中，每一種試樣的變化都完全相同。FIA化學反應實際上是試樣在試劑中的分散，這個過程是在形成試樣帶濃度梯度的同時發生的。FIA的采樣和進樣都是周期性嚴格重復的。
3 FIA在水質檢測中的應用
3.1 FIA分光光度法 最早與FIA法聯用的是分光光度法，兩者結合形成了FIA分光光度法。該方法有效地提高了分光光度法的檢測能力以及分析效率，在氣體擴散、溶劑萃取、膜滲析、離子交換以及停流技術等方面都取得了明顯效果。該法所使用的儀器設備較為簡單，價格低廉，操作簡單方便，能夠與信號處理系統很好地連接在一起，使用范圍較廣。趙云利用該法測定了廢水中揮發酚，測定結果較精確，且測定較迅速。FIA分光光度法采用N2將藥品間隔開，可以有效地防止各段樣品之間的混合，從而保證各段試樣到達理化平衡的時間均等，降低了樣品預處理和分析的難度，較大程度地提高了水質監測準確度和精密度。
3.2 FIA電化學法 電化學分析法是儀器分析法的重要組成部分，主要是以電位、電導、電流以及電量等參數與試樣的組成成分及濃度之間的關系作為計量基礎進行檢測。FIA和電化學法的聯合使用大大提高了電化學分析法的檢測靈敏度，并實現了水質檢測技術的在線監測。FIA電化學法操作簡單、選擇性及重現性較好，實驗儀器比較簡單，價格低廉，電極壽命較長，使用范圍較廣，可用于檢測水質中的Pb+及Ca2+等。
3.3 FIA化學發光法 化學發光（CL）法主要通過測量物質在化學反應過程中產生的光強度來對試樣進行定量分析，其分析過程不需要任何的光源，靈敏度高，但持續時間較短，隨著時間的推移，其發光強度的變化較大。通過與FIA的聯合使用，精確度、靈敏度以及線性范圍都較常規的化學發光法有了較大的改善，是目前應用較廣的痕量分析法。該方法的儀器設備較為簡單，操作簡便，適用于井水、河水以及自來水中痕量鐵的測定。
3.4 FIA原子吸收法 FIA與原子吸收法（AAS）的聯合使用可以大大減低試劑的用量，并且在進樣前對樣品進行預處理，可有效地提高測量方法的靈敏度和選擇性，應用較為廣泛。FIA-AAS法不僅可以檢測多種元素，還實現了對試樣的自動化分析及形態分析。圖2為利用FIA-AAS測定金屬離子的單FIA流路系統示意圖。
4 FIA的發展趨勢
FIA技術的使用范圍較廣、靈敏度高、測定快速且結果準確，通過與多種檢測方法聯合使用可大大提高其靈敏度和準確度。隨著FIA與化學計量學以及計算機在線測控技術等的結合，FIA正向著簡單化、微型化及智能化的方向發展。未來的FIA將成為常規的分析測試手段，并將廣泛運用到實驗室以及工業生產中，從而更好地為生產和科研服務。
化學發光法的基本原理范文2
關鍵詞：石化產品 痕量硫化物 測定 分析
石化產品中殘留過量的硫，除了對煉油設備、運輸設備造成腐蝕外，還會加速油品質變質，且燃燒后造成的二氧化硫會嚴重污染大氣環境。由此可見，強化石化產品中硫含量的控制，對其今后的使用有著極其重要的作用。就此，本文從石油產品中痕量硫化物含量測定原理、石油產品中痕量硫化物含量測定方法及石油產品中痕量硫測定方法的選擇等三個方面出發進行分析。
一.石油產品中痕量硫化物含量測定原理
作為石化產品中嚴格控制的指標之一，硫含量的測定、分析發揮著不可替代的作用。在痕量硫測定中，所測定的對象由原油與成品油、硫回收過程氣體及工業爐煙、大氣等三個方面組成。
在當前石化產品的生產制造中，硫含量作為衡量原油及其產品質量的重要指標之一，是整個石化產品分析內容的重要組成部分。受原油來源及加工方式的影響，其含有的硫可以是元素硫、硫化氫、硫醇類、硫醚類、二硫化物及其同系物等。硫在油品中的存在，一方面會對煉油裝置及油品運輸設備產生腐蝕，影響油品的安定性，另一方面煉廠及石化裝置排放氣中的硫化氫、燃氣機及鍋爐排放的二氧化硫可污染大氣，造成中毒事故。但在某些狀況下，硫的存在也有著一定優勢，如在改善油的性質中，需要加入適量的非活性含硫化合物，這些都對實話產品中硫含量的測定有著嚴格的要求。
二.石油產品中痕量硫化物含量測定方法
（一）庫侖滴定測定法
庫侖滴定法也叫庫化法，常用語輕質石油產品、原油及渣油中的總硫分析，其測量范圍約在百分之幾道千萬分之幾。在其使用中，國內的庫倫儀研制及生產已經具備相當高的水平，再加上成本低廉，在很大程度上取代了以往的管式爐法與燈法，成為當前國內石化產品硫含量分析的主要方法。
庫侖滴定的基本原理為將油品中的含硫化合物，在高溫含氧氣流中轉變成二氧化硫，并在氣流的引導下進入滴定池中，通過滴定池含有K1電解液生成三碘離子與進入滴定池的二氧化硫等當量反應，生成三氧化硫和1-，通過計算產生三碘離子所消耗的電量，便可計算樣品中的硫含量。
（二）XRF——X射線熒光法
XRF測定法在使用中，能夠對多種油品中的硫、鎂等輕元素及鐵、鈷、鎳、鈾等重元素進行測定，同時也適用于液體、固體、泥漿及粉末等樣品測定。XRF作為一種非接觸的無損測量方法，在適用中可以對樣品進行直接測量，且測量過后的試樣不會發生變化，測量誤差比較小。
XRF法在近幾年的適用中，憑借其操作簡單、成本低廉已成為石化生產中常見的油品元素分析方法。XRF檢測原理：用X射線源照射試盤內放好的試樣，使用檢測元件來感測這些X射線的強度，通過X射線的強度來識別硫元素，信號越強，則硫含量越多，信號越弱，則硫含量越少。
（三）醋酸鉛法
醋酸鉛硫分析法最初常用于大氣H2S含量的檢測，約在80年代，測量液態碳氫化合物的在線總硫量系統才得以推出使用。在當前使用的在線總硫量系統中，仍以Houston Atlas 公司生產的VII型總硫分析儀為主，且該分析儀除了具備獨特靈活的微處理體統外，在測量過程中不受外界環境的影響。VII型總硫分析儀在對氣體硫含量進行測量時，其最小量程為0——1μL/L，其檢測原理為：將大量的H2與檢測樣品混合，在經過一臺加氫反應器后，H2與樣品會在高溫條件下發生還原反應，并生成H2S，接著H2S與醋酸鉛接觸發生如下反應：
在經過一段時間的反應后，白色的帶子上會留下棕黑色的硫化鉛，測定人員這時應使用電光二極管及LED光源，通過極其靈敏的光線來測量顏色變化的速率，進而測得H2S的具體含量。但在實際使用中，針對高芳烴含量樣品的硫含量測量，測量人員可以使用氧化還原的方法對硫含量進行還原，即通過氧化還原的方式，先將樣品中的硫氧化為二氧化硫或三氧化硫，接著將其還原為H2S，最后通過醋酸鉛進行含量檢測。
（四）其他檢測方法
在上述的三種檢測方法中，醋酸鉛檢測方法常用語也太是有產品中硫含量的分析檢測，但從其實質來講，其更適用于檢測氣體硫含量，且成為檢測氣體硫含量的標準方法之一；X射線熒光法常用于液態石油產品中硫含量的測定，然而在使用過錯中容易受自身低靈敏度的影響，檢測結果存在較大誤差；火焰光度計與氣相色譜技術結合也可以精確地在線測量硫含量，但由于光度計的非當量化響應和對碳氫化合物影響的敏感度，只能做單一含硫化合物組分的分析，難以做總硫分析，因而其應用受到限制。
隨著近幾年科學技術的迅速發展，我國科研人員研制出了化學發光法總硫檢測儀，并將其應用到在線自動檢測液態樣品中硫化合物的含量檢測中。該檢測技術在做氣相單一硫化物含量分析時就已經證明其精度在很大程度上虞色譜技術不分上下，且該技術經過改造后，在原有的基礎上增加了一個整體式加熱噴射閥，這樣便能將液態樣品直接噴入檢測器，在實現所有含硫化合物檢測的同時，還能直接得出產品中的總含硫量。
三.石油產品中痕量硫測定方法的選擇
就石化產品來講，其種類十分眾多，除了包括燃料產品及液化產品外，還包括一些劑產品等化工原料，針對這些不同種類的石油產品，在檢測其硫含量時，所用的測定方法也不相同。再加上石油產品中含硫量的不同，又可將石化產品分為高硫石油產品、低硫石油產品及痕量硫石油產品三個種類，再加上不同石油產品含硫量測定方法對硫的檢出限有所不同，因而在很大程度上，不同的含硫量石油產品在檢測中會出現與之相符的差異性。此外，在痕量硫測定方法的選擇上，還應將檢測的工作效率及測試成本充分的考慮進去，在保證檢測結果準確無誤的同時，還能將成本降到最低。
在對石化產品痕量硫化物進行測定時，需要結合著石油產品的實際狀況選擇與之相對的檢測方式，這就要求測定人員在開展工作時：首先，結合著所選樣品的實際狀況，準確掌握其基本性質，結合著樣品所產生的工藝分析，對硫分的形態及含量范圍進行確定；其次結合著石油產品硫含量的測定目的、結果集用途，選擇適用范圍內更為經濟、高效、準確的測試方式。最后，在測量中，應將誤差控制在一定范圍內，確保測量結果的準確性與高效性。
總 結：
綜上所述，石化產品在我國社會發展中有著極其重要的作用，科學、準確的對測定石化產品痕量硫化物的含量，在實現石化產品最大經濟效益的同時，還能大大降低其對環境造成的污染程度，符合社會的環保需求。
參考文獻：
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化學發光法的基本原理范文3
【關鍵詞】HIV病毒；分子生物學檢測；進展
艾滋病病毒（HIV）主要侵襲人體免疫系統，導致人體免疫缺陷發生多種感染疾病或腫瘤。艾滋病的不可治愈及其快速傳播使患者不斷增多，2012年全球感染總人數已達3900萬人，中國近半艾滋病病毒感染者尚未發現，為了防止艾滋病的大規模流行，艾滋病的檢測工作越發重要。目前篩查的免疫學方法，由于靈敏度低，漏檢窗口期和新近感染病毒的感染者，而以核酸檢測為代表的分子生物學技術，靈敏度和特異性均顯著提高，明顯縮短檢出病原體的窗口期，是HIV診斷方法和診斷試劑持續發展的主要方向，對遏制艾滋病的傳播蔓延有重要意義。
1 HIV生物學特性
HIV呈圓形或橢圓形，直徑900～140nm，外層為類脂包膜，成分是外膜糖蛋白（gp120）和跨膜糖蛋白（gp41），核心由RNA逆轉錄酶、DNA多聚酶和結構蛋白等組成，基因組除了具有逆轉錄病毒的基本結構——基因長末端重復序列（LTR）、核心蛋白（gag）、聚合蛋白（po1）、包膜蛋白（env）gF，還有非常復雜的調控機制，包括tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等調節基因，其作用是在轉錄、翻譯、裝配等各個環節對病毒的生長和繁殖起調節作用。HIV基因組中存在3個gag-pol- env.Gag基因編碼的核心蛋白均位于病毒的核酸蛋白體上，P17位于白與殼層之間的基質上，包被于包膜蛋白的內部。核衣殼包被于內部核酸的，由主要的P24和P40及P55組成，其結構比較穩定，是HIV-1型的特異性蛋白。Env編碼包膜蛋白即gp120和gp41，起協助HIV進入宿主細胞的作用。聚合酶蛋白包括P66、P51和P31，它位于病毒的核區內，并與病毒核酸緊密相關[1]。
根據env基因V3段堿基排列的不同，HIV-1分為11個亞型即A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、M和0亞型，HIV-2分為6個亞型[2]，不同國家和地區有相對優勢亞型，HIV亞型在流行病學、診斷、臨床、試劑選擇、藥物篩選和疫苗研制上有著重要意義。
2 HIV-1的感染機制及感染標志
病毒侵入人體后，通過病毒表面gpl20在化學因子CCR5或CXCR4幫助下與細胞表面受體CD4分子結合，然后在gp41的協助下HIV的膜與CD4+細胞的細胞膜相融合，病毒核心蛋白及RNA進入胞漿。兩條RNA+在逆轉錄酶作用下成DNA-，在DNA多聚酶的作用下復制DNA，此DNA部分存留在胞漿內產生系列變化，然后在細胞膜上裝配成新病毒，再感染其它細胞。HIV感染后，首先能夠監測到病毒RNA，其次是p24抗原，最后是抗體[3]。
3 分子生物學檢測技術
隨著分子生物學檢測技術快速發展，HIV RNA或DNA檢測得到應用，核酸檢測已是艾滋病實驗室診斷的主要發展方向[4]，在HIV感染的監測、診斷、研究、療效觀察及預后判斷等方面均發揮著越來越大的作用，主要有定性和定量兩類。
3.2 定性檢測
3.2.1 原位雜交（insite hydzmion）
應用特定的標記探針以分子雜交法直接檢測標本中的HIV病毒靶核酸，起初標記探針是放射性標記，后來逐漸發展為酶標記或化學發光標記等等。原位雜交的陽性率比聚合酶鏈反應（PCR）略低，隨著核酸擴增技術的出現并廣泛使用，基因探針技術也就逐漸失去應用意義。
3.2.2 聚合酶鏈反應技術（PCR）
PCR是一種以核酸生物學為基礎的分子生物學診斷技術?；驹眍愃朴贒NA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構成?；颊吒腥綡IV 1～14d后血漿中能檢測出HIV RNA，可用于急性感染期患者、抗體檢測不確定等情況的輔助診斷或用于血液篩查，尤其在HIV陽性母親產下的嬰兒是否感染HIV的診斷中有著非常重要的意義，前病毒DNA PCR檢測法對出生48h內的嬰兒檢測敏感性為38%，出生14d的嬰兒檢測敏感性達93%[5]。
3.2.3 逆轉錄多聚酶鏈反應技術（RT-PCR）
RT-PCR技術通過對RNA逆轉錄酶的應用實現，即將病毒RNA逆轉錄DNA，接著進行PCR，指數擴增DN段，將放大產物變性并與多孔板結合，利用酶聯系統進行檢測。RT-PCR技術可在2h內擴增產物達到凝膠電泳或實時熒光法可檢測的水平，準確定量的RT-PCR方法已被許多商業實驗室證實，目前多種改良的快速RT-PCR檢測方法應用于HIV的快速臨床診斷[6，7]。
PCR靈敏度高、特異性強、操作簡便，但易污染出現假陽性結果；此外，HIV基因的多樣性，尚無一套引物能夠覆蓋所有的HIV序列，限制了檢測敏感性，因此，陽性結果還須核酸序列測定加以確認。HIV核酸定性檢測陽性結果可作為HIV 抗體窗口期的早期診斷的輔助指標，但不能單獨用于HIV感染的確診，成為限制PCR對于HIV感染診斷的臨床應用。
3.3 定量檢測
HIV核酸定量檢測即病毒載量測定，感染HIV后病情發展速度直接與血漿中病毒載量呈正比。在其他血清學和病毒學標志出現前檢出病毒核酸，使窗口期縮短6～11.5d，且慢性潛伏期也能檢出，便于早期輔助診斷；HIV病毒載量常用于用于評估疾病病程、監測抗病毒治療成效、選擇抗病毒治療方案；還可用于鑒定出生后18個月內的嬰兒血液中的HIV-IgG抗體是否來自于母體，嬰兒是否感染HIV（母嬰診斷）。當前，常用的定量檢測方法有較高的敏感性、特異性和可重復性。
3.3.1 分支DNA信號擴大系統（bDNA）
bDNA是指人工合成帶有側鏈的DN段標記被激發的標記物，利用發光強度與樣品中HIV RNA含量成比例，可通過發光強度來定量檢測血漿中HIV-1型RNA的一種方法。bDNA作為一種定量核酸檢測方法具有對檢測靶序列變異的更強識別能力，目前發展到靈敏度更好的、具有靶序列放大系統的第三代bDNA有數十個覆蓋整個基因組的探針，不僅可用于檢測HIV感染，可以方便地檢測HIV的部分變異株，且可用于療效觀察，文獻報道其為一種高靈敏度及特異性的方法[8，9]。與PCR相比bDNA不存在擴增物的交叉污染，但靈敏度不如PCR，提高bDNA的靈敏度仍是難點[10]。
3.3.2 核酸序列依賴的擴增系統（NASBA）
NASBA是以RT-PCR為基礎，由一對引物介導的、連續均一的、體外特異性核苷酸序列等溫擴增RNA的新技術，原理是提取病毒RNA，加入AMV逆轉錄酶、核酸酶H（Rnase H）、T7RNA聚合酶和引物進行擴增。NASBA無需熱循環裝置，只在一個溫度下進行（42℃），即可擴增大量拷貝的RN段。對不同條件的實驗室可以一次擴增足量的RNA用于多次研究和直接使用肝素抗凝的血漿樣品，適合凍存血漿的回顧性分析。其高效擴增的特性，能與多孔板酶介導的顯像技術及實時熒光檢測結合。因擴增產物的不穩定性特征，對傳染病病原的定性、定量檢測，減少了分子診斷實驗室擴增產物的交叉污染。但操作較繁瑣，不便于大批量處理，且擴增時退火溫度較低，容易引起污染，當前，NASBA已應用于HIV-1的分子診斷[10]。
3.3.3 轉錄介導的擴增系統（TMA）
TMA技術原理與NASBA大致相同，差別是TMA利用MMLV逆轉錄酶及T7 RNA聚合酶兩種酶，MMLV逆轉錄酶既有逆轉錄酶的活性又具有RNA酶H活性，反應溫度為41.5℃，1h內RNA模板擴增約109倍。相比p24抗原檢測，TMA技術可縮短窗口期6 d，比HIV抗體檢測縮短14 d [11]。
3.3.4 連接酶酶促鏈式反應 （LCR）
LCR法是基于靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連接的一種探針擴增技術，原理是由兩段數l0個核苷酸組成的單鏈DNA探針與目標序列雜交，將被檢測物中的特異性片段進行擴增，檢測擴增產物。LCR既可擴增，又可檢測DNA突變，對已知突變類型的基因診斷是一個切實有效可行的方法，是隨PCR后一種較有發展前景的體外擴增新技術。
3.3.5 實時熒光定量PCR技術
實時熒光定量PCR技術的應用使HIV核酸檢測技術又進入到一個新境界。原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。一般使用TaqMan探針或Sybr Green熒光染料。但Sybr Green染料不能區別目的產物和非目的產物，使結果有偏差，目前廣泛使用的是TaqMan探針技術。熒光實時PCR則可以進行實時檢測，改變了傳統的電泳終點檢測，得到相應的S型擴增曲線，其不但可以進行定性檢測，更重要的是可以進行定量檢測。與常規相比，具有特異性強、自動化程度高、有效解決污染問題等特點，能夠檢測血漿中的病毒載量及血液中單個核細胞的前病毒載量。美國PE公司1996年發明TaqMan技術[12]，已廣泛應用于基因檢測， 國內2002年4月深圳匹基公司獲批準第一個生產HIV熒光PCR檢測試劑盒，并應用于臨床診斷，國產實時熒光RT-PCR試劑檢測HIV-1血漿病毒載量與進口試劑相比具有較好的相關性[13]，并具有價格低廉的優勢，已在臨床逐步推廣應用。
3.3.6 PCR-ELISA
PCR-ELISA技術是PCR擴增以后，在微孔板上借用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的原理，使用酶標抗體，進行固相雜交來實現定量。該技術是一種具有很高靈敏度和特異性的方法[14]，但ELISA是一個開放性的反應，擴增后進行ELISA反應，容易產生污染引起假陽性，同時操作過程較繁瑣，臨床上難以廣泛應用。
3.3.7 基因芯片技術
是PCR技術與核酸分子雜交相結合，通過對HIV基因組分析，將該病毒的高度保守序列作為鑒定指標，可直接對病毒病原體進行檢測，顯著提高了診斷的準確性。1996年，Kozal等[15]研制出一種DNA芯片，對HIV-1逆轉錄酶及蛋白酶的基因突變進行篩選，并跟蹤監測HIV拮抗藥物的產生和突變、疾病相關基因型以及患者在治療中的反應。1998年，Hauser等[16]應用DNA芯片技術在艾滋病患者出現抗體反應前檢測HIV，對艾滋病的早期診斷有十分重要的意義。Affy-nletrix公司和Roche Mo1ecular公司合作生產的新一代診斷試劑盒，利用RMS實驗室的PCR擴增技術和DNA芯片技術結合檢測艾滋病患者的HIV耐藥反應。HIV PRT440也已廣泛用于HIV-l病毒的測序、分型及多態性分析[17] ?；虮磉_譜研究可以高通量在檢測基因表達信息[18]。國內也有文獻報道采用基因芯片檢測HIV[19，20] 。由此可見，基因芯片在鑒定HIV感染中具有其他方法無可比擬的優越性。
盡管基因芯片技術需要進一步的不斷完善，但完全可以預計在不久的將來其應用前景會錦上添花。不單限于HIV的耐藥性檢測和基因診斷，可以讓許多感染性疾病病原體的基因集中在一張芯片上，同時對其進行感染診斷。
總之，分子生物學檢測技術有助于HIV感染者的早發現、早診斷、早治療，也有助于對治療艾滋病藥物的療效評價、預測和監測疾病進程，減少艾滋病對個人、家庭及社會的危害。隨著HIV分子生物學技術在高特異性、高敏感性、快速、自動化等方面的不斷進步，HIV分子診斷可望成為艾滋病診斷標準之一，并通過對HIV突變及個體遺傳差異的檢測指導抗病毒治療，為人類遏止艾滋病的流行發揮重要的作用。
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艾滋病病毒（HIV）主要侵襲人體免疫系統，導致人體免疫缺陷發生多種感染疾病或腫瘤。艾滋病的不可治愈及其快速傳播使患者不斷增多，2012年全球感染總人數已達3900萬人，中國近半艾滋病病毒感染者尚未發現，為了防止艾滋病的大規模流行，艾滋病的檢測工作越發重要。目前篩查的免疫學方法，由于靈敏度低，漏檢窗口期和新近感染病毒的感染者，而以核酸檢測為代表的分子生物學技術，靈敏度和特異性均顯著提高，明顯縮短檢出病原體的窗口期，是HIV診斷方法和診斷試劑持續發展的主要方向，對遏制艾滋病的傳播蔓延有重要意義。
1 HIV生物學特性
HIV呈圓形或橢圓形，直徑900～140nm，外層為類脂包膜，成分是外膜糖蛋白（gp120）和跨膜糖蛋白（gp41），核心由RNA逆轉錄酶、DNA多聚酶和結構蛋白等組成，基因組除了具有逆轉錄病毒的基本結構——基因長末端重復序列（LTR）、核心蛋白（gag）、聚合蛋白（po1）、包膜蛋白（env）gF，還有非常復雜的調控機制，包括tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等調節基因，其作用是在轉錄、翻譯、裝配等各個環節對病毒的生長和繁殖起調節作用。HIV基因組中存在3個gag-pol- env.Gag基因編碼的核心蛋白均位于病毒的核酸蛋白體上，P17位于白與殼層之間的基質上，包被于包膜蛋白的內部。核衣殼包被于內部核酸的，由主要的P24和P40及P55組成，其結構比較穩定，是HIV-1型的特異性蛋白。Env編碼包膜蛋白即gp120和gp41，起協助HIV進入宿主細胞的作用。聚合酶蛋白包括P66、P51和P31，它位于病毒的核區內，并與病毒核酸緊密相關[1]。
根據env基因V3段堿基排列的不同，HIV-1分為11個亞型即A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、M和0亞型，HIV-2分為6個亞型[2]，不同國家和地區有相對優勢亞型，HIV亞型在流行病學、診斷、臨床、試劑選擇、藥物篩選和疫苗研制上有著重要意義。
2 HIV-1的感染機制及感染標志
病毒侵入人體后，通過病毒表面gpl20在化學因子CCR5或CXCR4幫助下與細胞表面受體CD4分子結合，然后在gp41的協助下HIV的膜與CD4+細胞的細胞膜相融合，病毒核心蛋白及RNA進入胞漿。兩條RNA+在逆轉錄酶作用下成DNA-，在DNA多聚酶的作用下復制DNA，此DNA部分存留在胞漿內產生系列變化，然后在細胞膜上裝配成新病毒，再感染其它細胞。HIV感染后，首先能夠監測到病毒RNA，其次是p24抗原，最后是抗體[3]。
3 分子生物學檢測技術
隨著分子生物學檢測技術快速發展，HIV RNA或DNA檢測得到應用，核酸檢測已是艾滋病實驗室診斷的主要發展方向[4]，在HIV感染的監測、診斷、研究、療效觀察及預后判斷等方面均發揮著越來越大的作用，主要有定性和定量兩類。
3.2 定性檢測
3.2.1 原位雜交（insite hydzmion）
應用特定的標記探針以分子雜交法直接檢測標本中的HIV病毒靶核酸，起初標記探針是放射性標記，后來逐漸發展為酶標記或化學發光標記等等。原位雜交的陽性率比聚合酶鏈反應（PCR）略低，隨著核酸擴增技術的出現并廣泛使用，基因探針技術也就逐漸失去應用意義。
3.2.2 聚合酶鏈反應技術（PCR）
PCR是一種以核酸生物學為基礎的分子生物學診斷技術?；驹眍愃朴贒NA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構成。患者感染HIV 1～14d后血漿中能檢測出HIV RNA，可用于急性感染期患者、抗體檢測不確定等情況的輔助診斷或用于血液篩查，尤其在HIV陽性母親產下的嬰兒是否感染HIV的診斷中有著非常重要的意義，前病毒DNA PCR檢測法對出生48h內的嬰兒檢測敏感性為38%，出生14d的嬰兒檢測敏感性達93%[5]。
3.2.3 逆轉錄多聚酶鏈反應技術（RT-PCR）
RT-PCR技術通過對RNA逆轉錄酶的應用實現，即將病毒RNA逆轉錄DNA，接著進行PCR，指數擴增DN段，將放大產物變性并與多孔板結合，利用酶聯系統進行檢測。RT-PCR技術可在2h內擴增產物達到凝膠電泳或實時熒光法可檢測的水平，準確定量的RT-PCR方法已被許多商業實驗室證實，目前多種改良的快速RT-PCR檢測方法應用于HIV的快速臨床診斷[6，7]。
PCR靈敏度高、特異性強、操作簡便，但易污染出現假陽性結果；此外，HIV基因的多樣性，尚無一套引物能夠覆蓋所有的HIV序列，限制了檢測敏感性，因此，陽性結果還須核酸序列測定加以確認。HIV核酸定性檢測陽性結果可作為HIV 抗體窗口期的早期診斷的輔助指標，但不能單獨用于HIV感染的確診，成為限制PCR對于HIV感染診斷的臨床應用。
3.3 定量檢測
HIV核酸定量檢測即病毒載量測定，感染HIV后病情發展速度直接與血漿中病毒載量呈正比。在其他血清學和病毒學標志出現前檢出病毒核酸，使窗口期縮短6～11.5d，且慢性潛伏期也能檢出，便于早期輔助診斷；HIV病毒載量常用于用于評估疾病病程、監測抗病毒治療成效、選擇抗病毒治療方案；還可用于鑒定出生后18個月內的嬰兒血液中的HIV-IgG抗體是否來自于母體，嬰兒是否感染HIV（母嬰診斷）。當前，常用的定量檢測方法有較高的敏感性、特異性和可重復性。
3.3.1 分支DNA信號擴大系統（bDNA）
bDNA是指人工合成帶有側鏈的DN段標記被激發的標記物，利用發光強度與樣品中HIV RNA含量成比例，可通過發光強度來定量檢測血漿中HIV-1型RNA的一種方法。bDNA作為一種定量核酸檢測方法具有對檢測靶序列變異的更強識別能力，目前發展到靈敏度更好的、具有靶序列放大系統的第三代bDNA有數十個覆蓋整個基因組的探針，不僅可用于檢測HIV感染，可以方便地檢測HIV的部分變異株，且可用于療效觀察，文獻報道其為一種高靈敏度及特異性的方法[8，9]。與PCR相比bDNA不存在擴增物的交叉污染，但靈敏度不如PCR，提高bDNA的靈敏度仍是難點[10]。
3.3.2 核酸序列依賴的擴增系統（NASBA）
NASBA是以RT-PCR為基礎，由一對引物介導的、連續均一的、體外特異性核苷酸序列等溫擴增RNA的新技術，原理是提取病毒RNA，加入AMV逆轉錄酶、核酸酶H（Rnase H）、T7RNA聚合酶和引物進行擴增。NASBA無需熱循環裝置，只在一個溫度下進行（42℃），即可擴增大量拷貝的RN段。對不同條件的實驗室可以一次擴增足量的RNA用于多次研究和直接使用肝素抗凝的血漿樣品，適合凍存血漿的回顧性分析。其高效擴增的特性，能與多孔板酶介導的顯像技術及實時熒光檢測結合。因擴增產物的不穩定性特征，對傳染病病原的定性、定量檢測，減少了分子診斷實驗室擴增產物的交叉污染。但操作較繁瑣，不便于大批量處理，且擴增時退火溫度較低，容易引起污染，當前，NASBA已應用于HIV-1的分子診斷[10]。
3.3.3 轉錄介導的擴增系統（TMA）
TMA技術原理與NASBA大致相同，差別是TMA利用MMLV逆轉錄酶及T7 RNA聚合酶兩種酶，MMLV逆轉錄酶既有逆轉錄酶的活性又具有RNA酶H活性，反應溫度為41.5℃，1h內RNA模板擴增約109倍。相比p24抗原檢測，TMA技術可縮短窗口期6 d，比HIV抗體檢測縮短14 d [11]。
3.3.4 連接酶酶促鏈式反應 （LCR）
LCR法是基于靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連接的一種探針擴增技術，原理是由兩段數l0個核苷酸組成的單鏈DNA探針與目標序列雜交，將被檢測物中的特異性片段進行擴增，檢測擴增產物。LCR既可擴增，又可檢測DNA突變，對已知突變類型的基因診斷是一個切實有效可行的方法，是隨PCR后一種較有發展前景的體外擴增新技術。
3.3.5 實時熒光定量PCR技術
實時熒光定量PCR技術的應用使HIV核酸檢測技術又進入到一個新境界。原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。一般使用TaqMan探針或Sybr Green熒光染料。但Sybr Green染料不能區別目的產物和非目的產物，使結果有偏差，目前廣泛使用的是TaqMan探針技術。熒光實時PCR則可以進行實時檢測，改變了傳統的電泳終點檢測，得到相應的S型擴增曲線，其不但可以進行定性檢測，更重要的是可以進行定量檢測。與常規相比，具有特異性強、自動化程度高、有效解決污染問題等特點，能夠檢測血漿中的病毒載量及血液中單個核細胞的前病毒載量。美國PE公司1996年發明TaqMan技術[12]，已廣泛應用于基因檢測， 國內2002年4月深圳匹基公司獲批準第一個生產HIV熒光PCR檢測試劑盒，并應用于臨床診斷，國產實時熒光RT-PCR試劑檢測HIV-1血漿病毒載量與進口試劑相比具有較好的相關性[13]，并具有價格低廉的優勢，已在臨床逐步推廣應用。
3.3.6 PCR-ELISA
PCR-ELISA技術是PCR擴增以后，在微孔板上借用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的原理，使用酶標抗體，進行固相雜交來實現定量。該技術是一種具有很高靈敏度和特異性的方法[14]，但ELISA是一個開放性的反應，擴增后進行ELISA反應，容易產生污染引起假陽性，同時操作過程較繁瑣，臨床上難以廣泛應用。
3.3.7 基因芯片技術
是PCR技術與核酸分子雜交相結合，通過對HIV基因組分析，將該病毒的高度保守序列作為鑒定指標，可直接對病毒病原體進行檢測，顯著提高了診斷的準確性。1996年，Kozal等[15]研制出一種DNA芯片，對HIV-1逆轉錄酶及蛋白酶的基因突變進行篩選，并跟蹤監測HIV拮抗藥物的產生和突變、疾病相關基因型以及患者在治療中的反應。1998年，Hauser等[16]應用DNA芯片技術在艾滋病患者出現抗體反應前檢測HIV，對艾滋病的早期診斷有十分重要的意義。Affy-nletrix公司和Roche Mo1ecular公司合作生產的新一代診斷試劑盒，利用RMS實驗室的PCR擴增技術和DNA芯片技術結合檢測艾滋病患者的HIV耐藥反應。HIV PRT440也已廣泛用于HIV-l病毒的測序、分型及多態性分析[17] ?；虮磉_譜研究可以高通量在檢測基因表達信息[18]。國內也有文獻報道采用基因芯片檢測HIV[19，20] 。由此可見，基因芯片在鑒定HIV感染中具有其他方法無可比擬的優越性。
盡管基因芯片技術需要進一步的不斷完善，但完全可以預計在不久的將來其應用前景會錦上添花。不單限于HIV的耐藥性檢測和基因診斷，可以讓許多感染性疾病病原體的基因集中在一張芯片上，同時對其進行感染診斷。
總之，分子生物學檢測技術有助于HIV感染者的早發現、早診斷、早治療，也有助于對治療艾滋病藥物的療效評價、預測和監測疾病進程，減少艾滋病對個人、家庭及社會的危害。隨著HIV分子生物學技術在高特異性、高敏感性、快速、自動化等方面的不斷進步，HIV分子診斷可望成為艾滋病診斷標準之一，并通過對HIV突變及個體遺傳差異的檢測指導抗病毒治療，為人類遏止艾滋病的流行發揮重要的作用。
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