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歲歲又重陽范文1
[關鍵詞] 骨髓間充質干細胞 分化 視網膜色素上皮細胞 共培養
視網膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium，RPE）細胞組織學上來源于神經外胚層，具有重要的生理功能，但是視網膜色素上皮細胞無再生能力，因而，當其功能障礙時會導致嚴重的遺傳性、變性性視網膜病變，如視網膜色素變性等，目前通過藥物和手術均不能阻止其進展、惡化。通過視網膜干細胞途徑達到視網膜再生是一條希望之路，但是哺乳類動物視網膜干細胞成年后則很少具有活性，因此，外源性視網膜細胞移植可能是一個有希望的途徑。
可直接應用于移植的視網膜干細胞非常有限，組織工程學的興起為外源性視網膜干細胞的產生帶來了新的希望，骨髓間充質干細胞（BMSCs）是至今研究最值得關注的成體干細胞，骨髓間充質干細胞是來源于中胚層的多能成體干細胞，大量的實驗證實體外不同的微環境對BMSCs具有不同的誘導分化效果。BMSCs不僅能向中胚層的成骨細胞等分化，而且能跨胚層分化，如向內胚層的肝細胞樣細胞以及外胚層的神經干細胞樣細胞等分化。本實驗探索誘導BMSCs向視網膜色素上皮細胞定向分化的微環境,現將研究結果報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
DMEM-LG培養基、胰蛋白酶、胎牛血清（Hyclone, USA）；bFGF、EGF、BDNF、PEDF(Peprotech,USA)； Taurine（Sigma,USA）；淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）；小鼠抗人巢蛋白單克隆抗體、小鼠抗人角蛋白8＆18單克隆抗體、小鼠抗人RPE65單克隆抗體（NeoMarkers，USA）；流式細胞術試劑小鼠抗人單抗CD34-FITC+小鼠抗人CD90-PE，小鼠抗人單抗CD34-FITC+小鼠抗人CD44-PE（Beckman-Coulter，USA）, RT-PCR試劑盒（Fermentas，USA），transwell雙層共培養系統（Corning，USA）。
1.2 方法
1.2.1骨髓的采集、BMSCs 的分離與培養
骨髓取自健康成年捐贈者，實驗符合國務院1994年頒布的《醫療機構管理條例》第33條原則。抽取骨髓約5mL，將骨髓用PBS稀釋后以1000rpm離心5min，洗滌2次，將下層血漿用等量DMEM-LG培養基重懸后采用淋巴細胞分離液（相對密度為1.077kg/L）密度梯度離心分離，輕輕吸取白色霧狀單核細胞層，置于離心管中再次用PBS洗滌2遍，用含10%FBS的DMEM-LG培養基吹打分散后調整細胞密度為1×106/mL接種于25cm2塑料培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。72h后予以首次換液，以后每3d換液1次。
1.2.2 BMSCs的形態學觀察與細胞表面抗原的流式細胞儀檢測倒置相差顯微鏡下觀察原代及傳代細胞形態學變化及增殖情況，并拍照記錄。按照謝茂松等[1]對骨髓間充質干細胞的流式細胞術鑒定方法步驟進行，第3代人BMSCs 90%融合時用胰蛋白酶消化，用流式細胞儀檢測BMSCs CD34（造血干細胞表面抗原），CD44（基質細胞表面抗原）及CD90（干細胞表面抗原）的表達情況。
1.2.3 RPE細胞的采集、分離與培養
RPE細胞取自福建醫科大學附屬第一醫院眼科角膜移植術后的供體眼球，具體操作方法按照徐國興等[2]提出的步驟進行，無菌條件下行眼杯消化法消化RPE層，將消化液中和后離心，用含15%胎牛血清的DMEM/F12培養基重懸接種于培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。72小時后開始首次半量換液，以后每3天換液一次，當細胞貼壁密度達80%時消化傳代。
1.2.4 RPE細胞的免疫細胞化學檢測鑒定
RPE65蛋白檢測：收集細胞爬片進行RPE65蛋白的免疫細胞化學檢測：PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，5%正常羊血清封閉，加入小鼠抗人RPE65蛋白單克隆抗體（稀釋度為1：100），4℃過夜，滴加聚合物輔助劑及生物素化山羊抗小鼠IgG， DAB顯色及蘇木素復染，自來水洗滌后干燥，樹脂封片，顯微鏡下觀察，拍照。
1.2.5誘導分化
實驗分兩組：誘導組和對照組。誘導組分兩階段誘導：首先向神經前體細胞誘導分化，再進一步與RPE細胞共培養向RPE細胞專向誘導分化。取第3代人BMSCs按 5×104/mL密度接種六孔板中，培養基為含10% FBS的DMEM-LG，每個六孔板中預先放蓋玻片進行爬片，24h后將培養基更換為含20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF及 20ng/mLBDNF進行第一階段誘導，在因子誘導的2d開始進行巢蛋白的檢測，檢測到巢蛋白表達率最高時進行第二階段誘導，采用transwell雙層非接觸共培養體系，將第一階段誘導的BMSCs接種于transwell下層并爬片，取第三代RPE細胞接種于transwell上層，進行共培養誘導并觀察細胞形態變化，對照組采用含10% FBS的DMEM-LG培養基培養，不加任何干預。
第二階段向RPE樣細胞方向誘導后角蛋白及RPE65蛋白表達的免疫細胞化學檢測,角蛋白8＆18及RPE65蛋白抗體稀釋度均為1:100。
1.2.6共培養誘導前及共培養2w后采用RT-PCR方法檢測角蛋白及RPE65蛋白表達情況
第二階段誘導前和誘導2w后，收集細胞，Trizol裂解細胞提總RNA，取1μlRNA在逆轉錄酶作用下合成cDNA，然后以此cDNA為模板，以角蛋白引物序列：上游5'-GAGGCATCCAGAACGAGAAGG-3'下游5'-CGGGCATTG
TCCACAGTATTTG-3'（擴增片段長223bp），RPE65蛋白引物序列:上游：5'-TTCAACCTCTTCCATCACATCAAC-3'下游：5'-GATTCAAGCCAAGTCCATACGC-3'（擴增片段長397bp），內對照β-肌動蛋白（β-Actin）引物序列：上游：5'-AAAGACCTGTACGCCAACACAG-3'下游：5'-TTTTAGG
ATGGCAAGGGACTTC-3'（擴增片段長度：556bp）（由南京金斯瑞生物公司設計并合成）擴增。產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統拍照。
2 結果
2.1 BMSC形態及鑒定結果
原代培養48h有部分細胞貼壁，少數形態呈桿狀，4~6d細胞呈桿狀或梭形，形成多個不同大小的細胞集落，7~10d呈放射狀向外擴展，細胞呈梭形，并逐漸融合成漩渦狀單層細胞。傳代后細胞分布均勻，形態一致，長梭形，呈成纖維細胞樣形態（見圖1）。
圖1 原代培養BMSCs第10天（×100）
第3代人BMSCs表面抗原檢測顯示CD90表達陽性率CD90+/CD34-：96.3%，CD44表達陽性率CD44+/CD34-：94.2%，表明所獲得的細胞絕大部分為BMSCs。
2.2 RPE細胞鑒定：RPE65蛋白免疫細胞化學檢測結果
第三代RPE細胞呈梭形，融合時可呈多邊形，鏡下可見胞漿內少量色素顆粒，隨著傳代的延續色素顆粒逐漸減少。
圖2 第三代RPE細胞融合（×100）
圖3 免疫細胞化學檢測RPE細胞的RPE65蛋白表達情況（免疫細胞化學二步法，DAB染色，蘇木素復染，×100）
2.3 誘導第一階段誘導的BMSCs巢蛋白免疫細胞化學檢測結果
誘導第3d開始能檢測到巢蛋白表達，第12d陽性表達率達到最高，達（86.9±2.6)%。
圖4 免疫細胞化學檢測誘導BMSCs巢蛋白表達情況（免疫細胞化學二步法，DAB染色，蘇木素復染，×100）
2.4 誘導第一、二階段后細胞角蛋白及RPE65蛋白的免疫細胞化學檢測結果
第一階段誘導后可檢測到角蛋白表達，但未見RPE65蛋白表達；第二階段誘導后檢測到角蛋白陽性率為（60.8±3.1)%，RPE65蛋白表達陽性率為（25.7±3.8)%；
圖5 免疫細胞化學檢測誘導BMSCs角蛋白表達情況（免疫細胞化學二步法，DAB染色，蘇木素復染，×100）
圖6 免疫細胞化學檢測誘導BMSCs后RPE65蛋白表達情況（免疫細胞化學二步法，DAB染色，蘇木素復染，×100）
2.5 誘導第一、二階段角蛋白及RPE65蛋白的RT-PCR檢測結果
實驗組第一階段誘導后RT-PCR檢測角蛋白及RPE65蛋白，發現有角蛋白表達，未見明顯RPE65蛋白表達；實驗組第二階段誘導后發現角蛋白及RPE65蛋白均有表達；對照組未見角蛋白及RPE65蛋白表達。
圖7 兩階段誘導角蛋白的RT-PCR 結果
圖8 兩階段誘導RPE65蛋白的RT-PCR 結果
3 討論
本實驗采用分階段誘導BMSCs向神經外胚層來源的視網膜色素上皮細胞方向分化。干細胞在體內分化與微環境密切相關，不同的發育階段干細胞所處的微環境不同將會影響干細胞發生不同的分化，干細胞進入新的微環境后,對新的微環境的調節信號做出反應，分化成與新的生長環境相適應的細胞。我們采用分階段誘導是在細胞分化的不同階段提供合適的微環境以期向特定細胞分化。第一階段采用神經細胞生長分化所必須的生長因子誘導BMSCs向神經前體細胞分化，第二階段將分化成的神經前體細胞與RPE細胞供培養，利用RPE細胞所分泌的相關物質來提供一個微環境，促使誘導的神經前體細胞向RPE樣細胞分化。
有實驗證實骨髓間充質細胞表面存在PDGF、FGF和EGF受體等。本實驗首先使用bFGF、EGF及BDNF 三種因子進行誘導BMSCs向神經前體細胞誘導分化。這些因子具有以下的生物學功能：bFGF具有促有絲分裂功能，在神經元發生、分化和功能方面起著重要作用，在體外bFGF能提高視網膜表達視蛋白的水平，體內有神經視網膜保護作用。BDNF能延緩神經元的變性和自然死亡，對神經元的存活和生長具有重要作用，有很強的刺激和促進神經細胞生長、分化的功能；不僅能保護神經元的功能，而且能促進光損傷的視網膜修復；BDNF能明顯促進光感受器細胞生存；在發育中的RPE細胞中有BDNF表達。大量實驗證實EGF存在于視網膜，可能與胚胎發育期和生后的光感受器細胞的誘導分化有關，它是視網膜神經元有效的分化因子。
RPE細胞能分泌多種生長因子,這些因子是維持視網膜完整結構所必須的，RPE維持光感受器細胞的存活，RPE能分泌FGF（FGF-1, FGF-2, FGF-5），IGF-1,PEDF等。PEDF有神經保護和為抗血管生成功能，提供環境保護，健康眼RPE能分泌PEDF維持視網膜和脈絡膜結構，并支持光感受器細胞和神經視網膜細胞的生長[3]。RPE細胞已知的能分泌以上多種因子，還有分泌一些其他未知的營養成分，這些對于RPE細胞的生長是必需的，因此本實驗將誘導分化后的神經前體細胞再與RPE細胞共培養，利用RPE細胞分泌的各種因子為神經前體細胞提供一個微環境，以促進其向RPE樣細胞方向分化。
本實驗采用細胞角蛋白8＆18(CK8＆18)與RPE65蛋白鑒定誘導分化后的細胞。細胞角蛋白是細胞骨架蛋白的一種，見于所有的上皮細胞，細胞角蛋白包括多個亞型，不同的上皮細胞表達不同亞型的細胞角蛋白。RPE細胞表達分子量為45KD的CK18和分子量52KD的CK8。而在視網膜組織，RPE細胞是視網膜中的上皮細胞，其它非上皮細胞不表達細胞角蛋白表面標志。RPE65 基因定位于1p31,編碼視網膜色素上皮特異蛋白, RPE65蛋白是RPE細胞特異性蛋白，故而在該組織中表明就是RPE細胞。本實驗第一階段檢測角蛋白即有表達，但未見RPE65蛋白表達；第二階段誘導分化后檢測細胞的角蛋白8＆18與RPE65蛋白，均有表達，表明所誘導的部分細胞具有合成角蛋白8＆18與RPE65蛋白的特征。
本實驗結果顯示在適當的微環境下可以誘導BMSCs分化為表達角蛋白及RPE65蛋白的細胞，但體外的誘導與體內的微環境有著很大的差別，體外誘導分化的細胞是否具有RPE細胞的生理功能如吞噬功能，有序排列，形成緊密連接等仍不明確，這些問題均需要更加深入的研究。
參考文獻:
[1] 謝茂松,徐國興,李瓊等.大鼠骨髓間充質干細胞分離培養方法的比較[J].國際眼科雜志,2007,7（5）:1285-1287.
歲歲又重陽范文2
【摘要】
目的 觀察丹酚酸B(SalB)干預體外誘導骨髓間充質干細胞(MSCs)分化為心肌樣細胞的作用及其機制。方法分離培養及鑒定大鼠MSCs，對其進行分組誘導:SalB組(終濃度為250 μg/L)、5-氮胞苷組(終濃度為10 μmol/L)、SalB聯合5-aza組(終濃度分別為250 μg/L與10 μmol/L)，誘導24 h后繼續培養4周，觀察其形態學變化，免疫細胞化學法鑒定心肌特異性肌鈣蛋白T (cTnT)的表達， 實時熒光定量RT-PCR法檢測心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表達。結果誘導后的MSCs體積增大，增殖減慢，并出現肌管樣結構；免疫細胞化學結果顯示誘導后的MSCs表達心肌特異性蛋白cTnT，與5-aza組相比，SalB組cTnT表達較低，SalB聯合5-aza組cTnT表達升高；實時熒光定量RT-PCR結果顯示各組均表達心肌分化早期基因，SalB聯合5-aza組誘導后的MSCs的心肌早期分化基因表達明顯高于其他兩組。結論SalB可在體外誘導大鼠MSCs定向分化為心肌樣細胞，其與5-aza聯合誘導可明顯提高MSCs向心肌細胞分化的能力。
【關鍵詞】 丹酚酸B； 骨髓間充質干細胞； 體外誘導； 免疫細胞化學； 實時熒光定量RT-PCR
骨髓間充質干細胞(MSCs)系自體來源，取材容易，擴增能力強，是一種體內外均有極強的分化潛能的干細胞［1］。1995年，Wakitanis等［2］發現體外分離培養的大鼠MSCs體外可被5-aza誘導分化為心肌樣細胞。但5-aza作為抗腫瘤藥物具有一定的毒副作用，故尋找安全、有效的誘導劑應是目前的重要課題。我們前期的研究結果表明SalB可以減小心肌梗塞的面積［3］，并能有效地促進梗塞灶內成纖維細胞的增生，加速心臟的修復過程。那么，它對有心肌分化潛能的MSCs起什么作用呢？為進一步研究其機制，我們進行了中藥單體丹酚酸B(SalB)體外誘導MSCs分化為心肌樣細胞的研究。現將研究結果報道如下。
1 器材
1.1 動物
（200±20）g體重的Wistar雄性大鼠，購于中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心，動物許可證號：scxk2005-0001。
1.2 試劑與儀器
L-DMEM培養液、1∶250胰蛋白酶、EDTA、雙抗，Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS），Hyclone公司；D-Hanks緩沖液； percoll淋巴細胞分離液，Pharmacia公司；CD44兔多克隆抗體〔Rabbit Anti-CD44(HCAM)〕、CD34兔多克隆抗體（Rabbit Anti-CD34）、即用型SABC免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑盒、PBS緩沖液，武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗大鼠單克隆抗體Troponin T， Cardiac Isoform Ab-3(Clone CT-3)，美國Lab vision公司；即用型SP免疫組化染色試劑盒(cat.no.MSP859143)，天津灝洋生物制品科技有限責任公司；TaqMan Reverse Transcription Reagents、SYBR Green PCR Master Mix reagent kits試劑盒(Applied Biosystems)、Trizol總RNA提取試劑，天津潤泰科技發展有限公司；5％CO2恒溫培養箱（model TC2323 CO2 incubator）；倒置相差顯微鏡（XD-101 98010）；SW-CJ-2FD型單人雙面凈化工作臺；離心機（LDZ5-2）；UV-530紫外分光光度計(上海生物儀器廠)；PCR儀(美國HYBAID)；ABI7300實時定量PCR儀。
1.3 藥品
5-aza，Sigma公司；丹酚酸B，天津天士力制藥股份有限公司。
2 方法
2.1 MSCs的分離培養
將大鼠脫頸處死，無菌條件下取雙側股骨、脛骨，適量D-Hank's液沖洗骨髓，100目篩網過濾，將密度為1.073g/ml的Percoll預先置于試管的底部，然后按照1∶1的比例沿管壁緩慢滴加骨髓懸液，離心（1 800 r/min，20 min），收獲位于界面層灰白色的單個核細胞，用L-DMEM離心洗滌2次（800 r/min，5 min）后接種于完全培養液（含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的L-DMEM培養液），置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中繼續培養，24 h后首次換液，以后每3 d更換1次培養液，2周后細胞長滿瓶底。
2.2 MSCs的傳代及純化
待原代MSCs長滿瓶底時，用1∶1配比的0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA對細胞進行消化2～3 min，以完全培養液中止消化并反復吹打貼壁細胞，制成單細胞懸液，按1∶3進行傳代培養，直至貼壁細胞彼此融合鋪滿瓶底時，重復上述操作，反復傳至第9代。
2.3 MSCs的鑒定
選用生長狀況良好的第9代 MSCs，用免疫細胞化學方法檢測細胞表面抗原CD44和CD34。將第9代的大鼠MSCs培養于6孔板，孔板內預置無菌蓋玻片，周后，細胞80%長滿瓶底，用95%乙醇（加少量冰醋酸）固定15 min，PBS徹底清洗。滴加5%BSA封閉液，室溫孵育20 min，甩去多余液體，不洗。滴加以1∶100濃度稀釋的一抗（兔IgG）4℃過夜。余按SABC免疫組化試劑盒操作說明進行。蘇木素輕度復染、脫水、透明、封片。
2.4 MSCs的誘導分化
將第9代MSCs接種于預先置有蓋玻片的6孔板中，培養2 d，將完全培養液換為無血清培養液，24h后進行分組誘導：SalB組(終濃度為250 μg/L)、5-aza組(終濃度為10 μmol/L)、SalB聯合5-aza組(終濃度分別為250 μg/L，10 μmol/L)，并設空白對照組，僅用基本培養液(L-DMEM)誘導。誘導劑作用24 h后，更換完全培養液繼續培養，每3 d換液1次，共4周。
2.5 免疫細胞化學鑒定心肌特異性蛋白cTnT
取誘導后4周的細胞，用95％乙醇（加少量冰醋酸）固定15 min，PBS徹底清洗。用羊血清封閉，滴加cTnT(1∶50)，陰性對照用PBS代替一抗cTnT，4℃冰箱過夜。其余步驟按超敏S-P試劑盒操作程序進行，最后蘇木素復染，梯度酒精脫水，中性樹脂封固。顯微鏡下觀察，胞質中有棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞。每組選取染色較好的8張玻片，在顯微鏡下每張玻片取5個視野，由數碼攝像機攝入，用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件對結果進行分析。
2.6 實時熒光定量RT-PCR檢測
心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表達 取誘導后4周的細胞，按以下步驟進行操作：(1)RNA提取與cDNA的合成:取誘導后4周的細胞，采用Trizol一步法提取總RNA，按照試劑盒說明進行反轉錄，反轉錄條件為：25℃10，48℃30，95℃5 min。(2)實時PCR法檢測心肌早期基因NKX2.5，GATA-4，Desmin和a-actin的相對表達量：從NCBI基因庫查找、驗證后，確定各目的基因和管家基因的引物序列，由北京賽百勝基因有限公司合成，引物序列見表1。根據試劑盒說明進行擴增，擴增條件為95℃，10 min；95℃，15sec60℃，1 min，40循環。（3）所得CT值經轉換后以2-ΔΔCT相對定量法獲得每個樣本各目的基因相對表達量的數值。表1 各目的基因及內參照基因引物序列（略）
2.7 統計學方法
結果用±s表示。應用SPSS 11.5統計軟件采用單因素方差分析進行組間比較，以P＜0.05為具有統計差異。
3 結果
3.1 MSCs的形態特征
剛分離接種的MSCs鏡下呈圓形，大小不一，數目較多，24 h內貼壁完成，但仍有較多的圓形細胞懸浮于培養液中，2～3 d后細胞呈梭形，體積較懸浮的圓形細胞大，大小較均一，核漿分界清楚，折光性強。8～9 d形成多個克隆，細胞排列有一定方向性，多成“漩渦狀”或“網狀”生長。傳代細胞保持原代細胞的形態特征，24 h內完全貼壁，呈梭形，增殖迅速，5～7 d即鋪滿培養瓶底部，發生接觸抑制不再生長，需及時傳代。在整個培養過程中，通過換液可去除不貼壁的紅細胞，通過傳代可去除貼壁比較牢固的巨噬細胞、單核細胞等，隨著傳代，細胞得到純化。
3.2 MSCs表面抗原的鑒定
鏡下可見陽性細胞胞漿內含棕黃色、顆粒狀物質。永生化的MSCs免疫組化染色CD44表達陽性，不表達CD34。
3.3 MSCs誘導后的形態變化
陰性對照組細胞在誘導1周后基本長滿培養瓶底，而各誘導組細胞死亡較多。2周后，陰性對照組的細胞因生長抑制開始死亡，細胞重疊生長，狀態不佳；誘導組細胞仍有少量死亡，但部分細胞體積開始變大，形態呈梭形、長方形、不規則形；3周后，陰性對照組的細胞大片死亡，鏡下形態不清；各誘導組細胞呈梭形、長方形的細胞數量相對增多，細胞增殖能力減弱，數量較誘導前減少，個別胞漿中可見明顯顆粒狀物質，部分視野可見肌管樣結構；第4周，陰性對照組的細胞形態模糊；各誘導組細胞形態均一，細胞間發生融合，排列具有方向性，更多視野可以觀察到明顯的肌管樣結構，以SalB聯合5-aza組最為明顯。
3.4 誘導后MSCs的免疫細胞化學鑒定
未誘導的MSCs空白對照組未發現cTnT陽性細胞， SalB，5-aza，SalB聯合5-aza誘導的各組中cTnT免疫細胞化學染色均可見陽性細胞，與5-aza相比，SalB聯合5-aza組的cTnT表達明顯增加，陽性表達率為28.21%，單純SalB組的陽性表達率較低。結果見表2。
3.5 實時熒光定量RT-PCR檢測
心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表達結果顯示，各組均表達心肌分化早期基因，SalB聯合5-aza組誘導后的MSCs心肌早期分化基因表達明顯高于其他兩組（見表3）。誘導后各基因的溶解曲線和擴增曲線見圖1～10。表2 各誘導組MSCs的cTnT陽性表達率比較(略) 表3 3組NKx2.5，GATA-4，Desmin，a-actin mRNA相對表達量的比較(略)
4 討論
隨著MSCs分離、培養和純化技術的不斷發展和成熟，越來越多的研究者關注于誘導其定向分化為所需的細胞，其中處于心臟細胞與組織再生工程領域的人們正熱衷于誘導其向心肌細胞分化的研究。Liu等［4］實驗表明，原代和第1代的MSCs用不同濃度的5－aza單次或多次誘導后均未出現心肌樣細胞，證明未永生化的MSCs在體外是不能分化為心肌細胞的。骨髓間充質干細胞經連續傳代4個月以后得到永生型細胞(immortalized cells)，即純化的間質干細胞［5］。未分化的永生化MSCs對誘導成功很關鍵。因此，本課題組選用了第9代的MSCs。
5-aza是研究最多的干細胞分化體外誘導劑，也是目前較公認的可以誘導MSCs分化為心肌細胞的藥物。5－aza是一種胞苷類似物，能引起DNA中某些胞嘧啶去甲基化，而DNA的甲基化與基因表達密切相關。所謂甲基化是指細胞通過一個甲基集團與CPG二核苷酸的胞嘧啶環的5'-末端共價結合以修復基因，一般近70%的CPG殘基被甲基化，甲基化的結果是這些基因不被表達，而那些非甲基化的基因表達。在胚胎發育早期，特異性基因選擇性的去甲基化使細胞向不同方向分化［6］。我們的實驗驗證了5-aza可以誘導永生化的MSCs向心肌細胞分化。
肌鈣蛋白（Tn）包含了3種成分：肌鈣蛋白C(TnC)、肌鈣蛋白I(TnI)和肌鈣蛋白T(TnT)。他們在橫紋肌和心肌的收縮調節中起重要作用。肌鈣蛋白T(cTnT)是肌鈣蛋白的原肌球蛋白的粘合亞型，與肌動球蛋白上的決定ATP酶活性的Ca2+的敏感性有關。存在于快慢骨骼肌及心肌亞型中。cTnT在心肌與骨骼肌上的氨基酸序列是不同的，兩者在結構上和免疫方面也有很大的區別，其抗血清的交叉反應率只有1%～2%，不易受骨骼肌的影響，是鑒定心肌細胞的比較特異性的蛋白。因此，本實驗選其作為鑒定MSCs向心肌細胞分化的重要檢測指標。結果顯示除陰性對照組外，各組均表達cTnT。為探討確切機制我們從基因水平做了進一步的實驗。研究認為，分化信號提供給MSCs后，引起調控MSCs分化的關鍵基因表達改變，決定了干細胞的定向分化方向［7，8］。目前已發現的與心臟發育相關的基因有很多，我們選擇的是目前比較公認和研究較多的心肌早期分化基因Nkx2.5、GATA-4、Desmin和a-actin。NKX2.5、GATA-4是對心臟早期發育具有至關重要作用的轉錄因子［9，10］。Nkx2.5基因在心臟異表達，在胚胎、胎兒心肌細胞中保持一定的表達水平，是心臟前體細胞分化的最早期標志之一。GATA-4作為GATA轉錄因子家族成員，具有兩個鋅指結構域，在心臟異性表達，最初表達于原始心肌中層，然后在血管和心臟內膜及肌層中表達，它除了直接參與調節心肌細胞結構基因和相關調控基因的表達外，還可與幾種心肌基因調控區的DNA結合，參與心肌細胞的分化過程。NKX2.5、GATA-4在心肌細胞發育的早期即出現表達，兩者單獨或協同作用可促進正常心肌細胞的特化、分化和成熟。Desmin和α-actin都是細胞的骨架蛋白。Desmin作為心肌細胞分化的一種早期的標志已經得到公認，是最早表達于未分化的肌母細胞中的肌源性蛋白［11］，在肌源性細胞的發育、成熟過程中起重要作用，能夠維持肌纖維形態、連接細胞核與細胞膜而使肌小節之間發生信號聯系。α-actin為肌動蛋白的一種亞型，是骨骼肌和心肌的特異性具有收縮功能的細胞骨架蛋白，為胎兒或新生兒心室肌的主要成分。因此Desmin和α-actin的表達陽性說明MSCs發生了肌源性分化。心肌細胞的發育是一個連續的過程，其中涉及多種基因的參與和調控，這些基因的表達及它們之間的相互作用在心肌發育過程中至關重要。據報道［12］，SalB能改善心肌梗塞大鼠的心臟功能，并能使心肌基因表達譜發生改變。本研究從體外初步探討了SalB誘導MSCs分化為心肌樣細胞的機理，從實驗結果我們認為SalB誘導MSCs向心肌細胞分化的可能機制一方面是由于SalB作用于MSCs后分泌某些有利于心肌細胞生長的因子，從而影響了其向心肌細胞分化的相關基因及蛋白的表達；另一方面可能是由于其上調了心肌分化相關基因的表達。但是SalB誘導MSCs的心肌分化率較低，若要用于臨床治療，尚需更進一步的研究與實踐。同時，我們的研究結果顯示SalB聯合5-aza可以提高心肌分化率，那么，其能否減少5-aza作用所帶來的負面影響呢？這仍需要進一步的實驗研究。
參考文獻
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［10］Nemer G， Nemer M. Regulation of heart development and function through combinatorial interactions of transcription factors［J］.Ann Med， 2001， 33(9)：604.
歲歲又重陽范文3
送你一棵幸運草，愿你好事連連有；敬你一杯健康酒，愿你快樂又長壽；送你一條短息語，祝你重陽節日樂！
三三令節春時松更高，九九芳辰重陽鶴添壽，愿秋風捎去我的思念和祝福，祝你越活越精神，越活越年輕！
秋高氣爽，人壽花香；彩云追月，盛世和祥。登高臨望，有把酒臨風之概；菊釀成杯，有對月相賀之意。春光即逝，莫引秋殤，今是重陽，來曰且追。
九月初九是重陽，一見傾心結姻緣，相持相伴到白頭，老來登高憶滿頭。短信祝福呈吉祥，問候關懷暖心窩，愿你重陽心歡喜，健康快樂到永久。
松柏不殘四季翠，山村難老百歲人三三令節春時松更高，九九芳辰重陽鶴添壽，愿秋風捎去我的思念和祝福，祝你越活越精神，越活越年輕！
歲歲重陽，今又重陽；聲聲祝福，莫要彷徨；絲絲掛念，記在心上；條條短信，勝似陽光；問問友人，是否安康？重陽節快樂！
歲歲重陽，今又重陽，傲霜滿地香；久久思量，久久難忘，九九重陽勝春光；美酒一杯，秋雁兩行，福澤深厚又綿長。祝重陽快樂，永遠健康！
九月初九上酒樓，酒醉醉酒忘憂愁，久久凝思九九日，九九重陽想舅舅，糾結思念家中舅，久久未見離家久，帶酒一瓶送舅舅，祝福永久在心中。
天高云淡香，遍插茱萸在廳堂。游子千里歸故鄉，美酒一杯敬尊長。養育之恩不敢忘，祝愿福壽安康萬年長。重陽節到了。祝天下所有老人健康長壽！
我愿化作一片云，隨你漂流到天涯海角，我愿變成一首歌，寂寞時在你耳邊響起，我用真心編寫最美的祝福，在這重陽佳節里送給最愛的你。
生命的火焰在跳動，寒冬也冷卻不了；生命的色彩在描繪，黑夜也掩蓋不了；生命的精彩在延續，時光也終止不了！重陽節，真誠祝愿您健康快樂，永遠年輕！
歲歲又重陽范文4
《采桑子 重陽》最早作為《詞六首》之一正式發表于1962年5月號《人民文學》，當時標題為《采桑子》。1963年12月人民文學出版社出版的《詩詞》收入此詞，標題改為《采桑子 重陽》。
據有些資料披露，這首詞正式發表前有一稿。兩稿對照如下：
【修改稿】
人生易老天難老，
歲歲重陽。
今又重陽，
戰地黃花分外香。
一年一度秋風勁，
不似春光。
勝似春光，
寥廓江天萬里霜。
【原稿】
一年一度秋風勁，
不似春光。
勝似春光。
寥廓江天萬里霜。
人生易老天無老，
歲歲重陽。
今又重陽，
但看黃花不用傷。
（見龔國基著《與詩》210頁）
【妙處可言】
《采桑子 重陽》的定稿與未定稿相比，除了上下闋顛倒以外，還有兩處較大的修改：一是“人生易老天無老”改為“人生易老天難老”；二是“但看黃花不用傷”改為“戰地黃花分外香”。從這幾處的修改，可以看出煉字的功夫。
1.上下闋顛倒后，意境和結構大不相同。開頭用一個深刻的哲理句奇峰突起：“人生易老天難老”；緊接著扣題，雖然“歲歲重陽”，但是今天的重陽可不同了，是在戰地，感受分外深切。這樣思緒由黃花到秋風，最后飛到萬里寥廓江天。全詞由無邊到眼前，再由春光到無邊，結構上曲折起伏，又完整綿密。
2.“人生易老天無老”改為“人生易老天難老”，改動一字，但是思考頓深?！疤鞜o老”是膚淺的直覺，“天難老”反映了對宇宙空間無邊無際、時間無始無終的深刻認識?！叭松桌稀迸c“天難老”之間，又包含了對有限與無限的辯證認識（若干個有限組成無限，而又永遠到不了無限）。
3.“但看黃花不用傷”改為“戰地黃花分外香”。“不用傷”是有傷而不傷的自我解脫，“分外香”是用心去感受從未有人感受過的境界。很多分析都去聯系當時的處境和心情，其實用不著；這兩個句子一比較，高下立現。
其實，詩詞中的“煉字”根本目的還是為了“煉意”，也就是為了更好地表現詩詞的意境?！盁捵帧北仨氁浴盁捯狻睘榍疤岵庞袃r值。“字”是出墻紅杏，“意”是滿園春色。因此無句無篇也就說不上煉字。只有篇中煉句，句中煉字，切合題旨，切合情景，做到語意兩工，這樣煉出來的字才能真正靈光四射?！恫缮Ｗ?重陽》在未定稿的基礎上作了幾處改動后，單獨看改動之處，可能覺不出有多好，可是如果把改動之處放到整首詞中來看，再聯系當時的寫作背景仔細品味，詞篇的字里行間洋溢著的革命樂觀主義精神就感人至深了。
【牛刀小試】
遇 見
孔屹檜
風屏息在天邊
樹葉卻嘩啦啦地
跌落一片
如綠衣蝴蝶
繾綣纏綿
你低眸
我仰望
脫口而出的訝異
如蜻蜓點水般的
漣漪蕩漾
須臾
淡然的笑意
綻放在你眉間
伸出手
清風將你掌心的溫度
綿延至我心尖
勝過許多的諾言
【指導教師：張興武】
歲歲又重陽范文5
愿我的祝福邁過千山萬水，愿我的祝福走過千家萬戶，愿我的祝福攜著千福萬福，伴著九九重陽的歡聚，來到你的身邊，祝你節日快樂，幸福安康!和大家分享重陽節祝福語錄精選材料，提供參考，歡迎你的參閱。
語錄一
1.秋風吹過的藍天，格外明艷，仿佛心底的那份思念;秋水映襯的白云，卓爾不群，恰如祝福的那顆真心;重陽發來的信息，全心全意，代表想你的心地。
2.讓南山上的空氣幫你潤肺，讓解放碑的輕軌載你騰飛，讓瓷器口的雞雜給你美味，讓太白酒的清香把你迷醉，也讓我的祝福帶給你實惠：重陽節快樂!
3.你如果現在是一個人，我祝你重陽節快樂;如果兩個人，那也重陽節快樂;如果一伙人，請告訴我你們在什么地方。
4.今日重陽節，共飲酒，吃口重陽糕，順便訴問候，首先祝你重陽佳節好，愿你生活如重陽一直逢雙九，幸福永遠九九(久久)!
5.九月初九是重陽，孤身在外想念爹娘。舉杯遙祝二老安康，愿你們身體健康老當益壯，心情舒暢神清氣爽，康樂人生如意吉祥，歡樂多多幸福綿長!
6.雙九重陽佳節到，短信祝福來問好：相逢總是很奇妙，生活無憂無煩惱，工作壓力瞬間消，傷心失落全跑掉，鍛煉身體多散步，愿你重陽更美好!
7.滄海一粟，九九回歸;天涯浪子，黯然傷神;親朋滿座，只差一人;快馬一鞭，歡喜滿心;終踏鄉路，靜聽鄉音;疾見親友，頓感溫馨!
8.重陽節，祝你一重喜悅，兩重歡笑，三重友誼，四重真情，融成十重光芒溫暖你心窩，祝你重陽節幸?？鞓?
9.每逢佳節，重陽在列，片插茱萸，登高望遠，舉杯懷遠，唯思爾等，愿君嬋娟，共思美好，祝你重陽節快樂!
10.九九重陽齊歡笑，真誠祝福少不了，全家歡聚真熱鬧，我在這里問聲好，愿你事事都如意，一家老少樂淘淘!
11.月落烏啼滿天霜，楓葉輕舞到重陽。東籬把酒黃，悠閑送到你身旁。無盡思念心中藏，有情歲月暖心房。聲聲祝福情意長，愿你幸福人安康。
12.重陽將至，送你跑車價格太貴，送你美酒怕你喝醉，送你玫瑰怕你誤會，給你介紹情人又怕你犯罪，只好發條短信，讓你陶醉!重陽節快樂
13.寒雁一向南飛遠，游人幾度叢。九月九日望遙空，秋水秋天生夕風?，F在正是爭艷的季節，愿你的心情也和那樣清爽、淡雅!重陽快樂!
14.九九重陽節，愿久久的幸福在你生活中重復，久久的成功在你事業中重復，久久的友情在你我之間重復。重陽節快樂!
15.借此佳節之際我感謝你，你的笑顏似絢爛的陽光照亮了我的國際，你給予我的安慰和鼓舞撐持我度過全部艱苦。祝你重陽節高興! 九九重陽，歡笑聚堂，祝您重陽節：親朋好友相聚來，喜上眉梢笑花開，長慈幼孝夫妻愛，好時好事好運來!
16.吃著重陽糕，飲著酒，插朵茱萸花，牽著愛人手，散步到永久，重陽節到了，愿你幸福平安，快樂一生。
17.重陽節到了!在這個豐收的季節里，祝愿你：事業豐收，薪水豐收，愛情豐收，歡樂永相隨!
18.九月，楓笑紅了臉，菊笑開了花，您笑彎了腰。九月，你踩著堅定的步子，一步步攀登著石階，邁向成功，邁向新的生活。送您一塊重陽糕，愿您重陽步步高!
19.重陽節，送你一杯九月九的酒，熏香你的生活;送你一絲思念，讓你學會心系祖先;送你一束鮮花，甜蜜你的愛情;送你一縷輕煙，讓你每天輕松歡樂。
20.重陽節就要到了，送一支山茱萸，愿你永遠愉快;送一塊重陽糕，愿你永遠高興;送一杯酒，愿你幸福久久。祝福您身體健康，老當益壯!
21.九月九日宴重陽，親友齊聚登高望，祈福避災無疾病，幸福如意身健康。天高云淡香，遍插茱萸迎吉祥，好運圍繞財神伴，闔家歡樂業興旺!
22.重陽時節日照少，情緒不暢易衰老，溝通交流解心結，平靜心態保健康，避寒而臥睡無恙，飲食平衡養胃腸，無事之秋開心過，愿你順意心舒暢。
23.九九重陽節，你我難聚首，思鄉的人兒眼淚流，條條的短信訴真情，愿你心兒莫憂愁，朋友一直將你放心上，再到重陽日，你我定能共飲酒!
24.重陽節到了，祝愿你登上高峰把幸福采下來，把煩惱丟下去;讓驕陽把事業照得紅紅火火，讓秋風把憂愁吹得干干凈凈!
25.工作需要多點激情，生活需要多點快樂，愛情需要多點甜蜜，友情需要多點聯系，假日需要多點休息。享受生活，歡度重陽，朋友記得常聯系!
26.一到九九重陽，二九歸一心愿，三神大喜同樂，四季唯一佳節，五合六聚歡聚，七大八小祝愿，九九歸一祝福，重陽快樂無比!
27.九月九是重陽，烈酒香醇菊飄香;九九相碰在重陽，萬丈光芒耀吉祥;九九相約在重陽，好運雙雙齊送上;九九歸真在重陽，步步登高人安康;祝重陽喜洋洋!
28.一杯酒帶來我最真的問候，希望遠方的你能夠開心健康。一句簡單的問候代表我最真心的祝福，希望你事事如意。重陽節快樂!
29.當秋風吹起的時候，遠方的你讓人分外牽掛，當楓葉飄落的時候，天各一方的我們彼此關懷，在重陽節的日子里送出我的祝福，希望你身體健康。
30.一年一度重陽，祝福大不一樣，生活喜氣陽陽，職場陽陽得意，愛情沐浴陽光歡笑陽溢，幸?？傇谏磉呩潢柌粫P長而去。收下祝福吧!重陽節快樂!
語錄二
1、愉快摻雜在空氣中，祝福飄落在樹梢上。向你招手是溫馨的重陽，你的笑聲是節日的激情。我愿化作幸福、給你帶來幸福，化作健康，給你帶來健康。重陽快樂
2、秋天來了，豐收的時候還會遠嗎?重陽來了，團聚的日子還會遠嗎?愿我的朋友笑容燦爛，每天都有一個好心情。拋開煩惱，時刻都能開開心心。
3、用彩云編織繾綣的夢境，收集心中每一份感動，許下星空每一個祝愿，記載心頭每一絲企盼，交織成一首幸福美麗的樂章，在這重陽佳節伴隨你!
4、今日重陽九月九，如意吉祥釀美酒。一杯送你錢滿箱，二杯送你好前程，三杯送你彩票夢，四杯送你永平安，五杯盡飲鴻福來，國太平安度余生。節日快樂!
5、重陽佳節，祝福送至，秋菊飄香，問候傳遞。我用彩云編織幸福的夢境，收集重陽里每一份感動，用短信將幸福為你送去。祝你重陽節快樂，精彩生活每一天。
6、暴雨澆不滅青春的火焰，困難壓不垮堅挺的人心，荊刺止不住登高的愿望。借秋風傳送我的問候，托大山保存的我的祝福，真心地祝愿你重陽快樂。
7、工作需要多點激情，生活需要多點快樂，愛情需要多點甜蜜，友情需要多點聯系，假日需要多點休息。享受生活，歡度重陽，朋友記得常聯系!
8、愿你工資加薪如漲潮，生意興隆買賣好，愛情路上遇月老，友誼之樹不會老，一天更比一天好，家中啥都不缺少，開開心心活到老，重陽節快樂。
9、轉眼重陽到，金風送爽俏，又逢重陽去登高，茱萸遍插秋風抱，送你祝福短信妙，重陽久久幸福居高，容顏不老，開心最緊要!
10、思念，高遠了青山，傾訴了山泉;期盼，遍地了茱萸，濃香了秋艷;祝福，匯集了久久，凝聚在心間，祝你：重陽節日，全家美滿，幸福平安。
11、為答謝各位親友對本人的支持，特在此佳節舉行大派送活動，凡在本人心中具有一定地位的朋友將獲得價值一毛的短信一條。祝：重陽節快樂!
12、重對董說：雖然戴的是草帽，也是公司的頭啊。陽對日說：聽話才有靠山。老對考說：我坐你站，因為我是面試官。我對你說：重陽到了，祝你快樂!
13、秋菊釀出重陽酒，喝出開心沒煩惱。五谷做成重陽糕，吃出健康平安到。秋風譜出重陽曲，聽出幸福和美妙。艷陽搭建重陽屋，住出溫馨好情調。重陽節快樂!
14、九九重陽登高塔，高瞻遠矚賞。開闊眼界祁幸福，期盼親朋皆平安。胸佩茱萸送瘟神，門插迎吉祥。全家共飲酒，歡聚一堂度重陽。重陽節快樂!
15、歡聚一堂，痛飲酒，多吃重陽糕。讓我們的重陽節，步步高升吉祥順利，健康養生到永遠。祝你重陽節快樂!
16、出游賞景、登高遠眺、觀賞、飲酒、吃重陽糕;朋友，重陽佳節到了，愿你和你的家人健健康康，長長久久。
17、本想親自到你身邊給你送點祝福，但因物價上漲、囊中羞澀、路費難湊，實在無奈，發條短信，內容很少，但祝福很滿。祝你重陽節開心快樂!
18、九九重陽節，傳你九陽真經：天氣多變，記得加衣;少些惆悵，多點喜氣;秋高氣爽，悠然賞菊;親朋好友，時常聯系。記住要訣，你會天下無敵!
19、七夕節許愛情愿最靈，重陽節許長壽愿最靈，財神日許發財愿最靈。正月十五財神日，心中許個發財愿再加我給你祝愿，愿望一定能實現。祝：今年大發!
20、但得夕陽無限好，哪須惆悵近黃昏，我蒸上九重的粟糕，備好香醇的菊酒，只待與你分享。愿你在這秋風徐徐的重陽里快樂永久!美好永久!
21、懸茱萸，福滿堂，九九重陽好運到;賞秋菊，品香茶，愜意無憂樂逍遙;踱步出，有山水，登高遠眺心情妙。九九重陽，愿你開心久久，幸福久久!
22、九九重陽節，悠悠思鄉情，金秋佳節，菊蓉笑綻，關愛老人，思念親情，好友陪伴，思高登頂。祝親愛的朋友身體健康，心想事成，重陽節快樂!
23、斟一杯菊酒，愿你健康長壽;插一棵茱萸，愿你吉祥如意;嘗一塊花糕，愿你步步登高。九九重陽節，祝你幸福快樂。
24、九九重陽快樂!此短信飽含我的深情款款、含情脈脈，既活潑俏皮，又幽默喜氣。收到的快樂一生，儲存的幸福永遠，收藏的好運連連，轉發的年年大發!
25、九九重陽，飄香，山高水長祝爹娘，常安康。糕點黃黃，甜蜜心上，秋收秋獲好時光，財滿倉。送一則短信，含萬般衷腸。祝你合家幸福，開心蕩漾。
26、1個，2個，。97個，98個!我的祝福翻了98個跟頭，終于來到了你的面前，唷，還差一個!好，再翻!99個跟頭，祝九九重陽快樂，快樂久久!
27、盼望著，盼望著，九月九要來了，重陽節要到了;你的手機要響了，我的祝福要發了;你的臉兒要笑了，我的心意要表了：重陽節快樂了!
28、四川人重陽節指南：去青城登高望遠，去峨眉燒香拜佛，去宜賓喝五糧液，去成都感受地鐵，再到春熙路看美女，最后回家搓麻將。哎呀!生活硬是不擺老!
29、獨在異鄉為異客，每逢佳節倍思親，遙知兄弟登高處，遍插茱萸少一人!祝福遠方求學的學子以及打工的朋友們重陽節快樂!
30、又逢九九重陽，又到金秋送爽，又逢長假添吉祥，又可與友登高聚首訴衷腸，又是重陽快樂回味久悠長，又見笑面如花你最靚，快樂就在九九重陽!
31、雙九重陽日，舉杯共消愁，人生多波折，多虧朋友助，借著今天佳節日，祝福話語說出口，愿你年年歲歲有今朝，時時刻刻無憂愁!
32、愿你薪水多賺，獎金滿滿;快樂天天，幸福年年!祝我們這些表面風光內心彷徨;容顏未老，心已滄桑;成就難有，郁悶經常;比螞蟻忙;比岳飛更忠良的兄弟姐妹們，重陽節快樂!
33、九月九重陽節，想約你一起來過節，但一采就碎，菊酒一喝就醉，外出旅游太貴，登高遠眺太累，不如發條短信經濟又實惠，祝你重陽過得輕松愉快!
34、做人要做李莫愁，刮風下雨不用愁;做事要像張無忌，牛鬼蛇神都無懼;工作要像王重陽，全真七子幫我忙;生活要像韋小寶，開心無憂沒煩惱!
35、春花燦爛，孕育了秋實;秋菊飄香，潤含了順利;茱萸遍地，預示了安逸;重陽登高，祝你如意，送上大禮：愿你重陽節合家幸福，健康甜蜜。
36、秋景妖嬈百媚生，秋菊怒放迎重陽;茱萸在手福滿屋，身輕體健福壽長;登高遠眺精神爽，忘憂忘煩心情好;祝你重陽交好運，步步如意走鴻途!
37、重陽節將至，我把祝福送;送枝茱萸葉，災禍無處躲;斟杯酒，幸福很長久;贈塊重陽糕，事業步步高;邀你登高峰，增福又添壽。祝你重陽節快樂，幸福快樂又安康!
38、重陽節登高，我登上天庭，用酒賄賂了全能的上帝，借他的手機給你發短信，因為收到上帝祝福的人定會健康久久，長壽久久，快樂久久，幸福久久!
39、有很多的事情難以忘懷，有很多的朋友夢縈魂牽?？傆邢鄥R相聚的時候，總有在一起載歌載舞的時日。朋友重陽節到了，愿你平安吉祥，年年如意，喜樂開懷!
40、九月九日，在這個思念泛濫的日子里，我想把全世界的祝福都送給你，我對你的思念，你懂得，所以我只想說：朋友，身體健康，萬事如意!
41、花總是會謝的，人總是會老的，重陽節年年都要來的，老人節早晚都要過的。無需在意歲月的更迭，祝你擁有一個美好，快樂的節日。重陽節快樂。
42、重陽佳節，豐收時節，漫山紅葉綻放你的笑顏，遍地稻香籠罩我的祝愿，祝愿你：事業大豐收，愛情大豐收，生活大豐收，快樂大豐收，事事大豐收!
43、是您將我培育，教我做人的道理;是您將我指引，讓你給我不至于在花花世界里迷失自己;父愛如山，永記于心，我親愛的父親，重陽節快樂。
44、歲歲重陽，今又重陽，九九相逢祥瑞降。不似春光，勝似春光，秋高氣爽喜洋洋。金菊飄香，歸雁成行，健康喜樂福綿長。重陽節，祝你幸福安康!
45、原本有心花不開，偶爾有人來相伴，悔時心中已有淚，吞下口去悄無悄，來者耳邊輕輕訴，缺字少左心相印，東風去掉一二點。每句猜一字：愿你每天都快樂!
46、九月九，捧來美酒，回憶涌上心頭!久未見，思念濃厚，問候不常有!朋友之情當天長地久，朋友之誼當放心頭。送來祝福：仕途高漲，工作順利!
47、歲歲重陽，今又重陽。秋風凄冷霜葉黃，年月如水細細淌。在故鄉，望遠方，兄弟別忘添衣裳。勤努力，勇敢闖，自信人生二百年。
48、數、數、數，數到九月九，重陽節日又來到，發條短信祝福你，愿你平安幸福，身體健康，事事順心，重陽快樂!
49、重陽賞菊飲菊酒，祛災祈福吉祥久。九九佳節蟹黃肥，樽前品蟹日日美。吃過糍粑柿子甜，出游登高身體健。佳節遙寄我思念，貼好秋膘享冬天!重陽快樂!
50、愿我的祝福邁過千山萬水，愿我的祝福走過千家萬戶，愿我的祝福攜著千福萬福，伴著九九重陽的歡聚，來到你的身邊，祝你節日快樂，幸福安康!
語錄三
1、重陽佳節，大吉大利，歲歲重陽，六六大順，重陽之夜，七星高照，喝酒賞夜，十全九美，金秋十月，喜氣濃濃，祝天下有情人：幸福美滿，歲歲重逢!
2、九九重陽節，送給你雙重的快樂，雙重的健康，雙重的如意，雙重的溫情，雙重的祝福：祝好事成雙相伴，甜蜜重重包圍!
3、重陽的到來，久久的期盼;九九的快樂;久久的思念;九九的幸福，久久的等待;九九的祝福，久久的珍藏;九九，喜事樂事好事伴你久久。
4、通往希望的山上，我不斷向上攀登，不管前方的路途多么崎嶇，那是我不變的方向，只為登上山頂，為你祝福，為你祈禱，重陽登高，祝你幸?？鞓烽L相伴!
5、重陽送美酒，讓好運伴你走。重陽送，讓你美貌如花。重陽送茱萸，朋友常相聚。重陽送祝福，幸福到永久。
6、如果我能化作一縷的陽光，我會為你把夢照亮，如果我能變作一團火焰，我會為你驅散早秋的寒意，今天是重陽節，為你送去一份發自內心的祝福。
7、酒是友情長青酒，久是天長又地久，九是五六的九。九九重陽至，送你友情長青酒，愿你我友誼天長地久，祝你五谷豐登六六大順八發快樂九九!
8、夕陽無限美，黃昏也嬌媚，縱使光線暗，明日可重來;年年節日多，今次大不同，人人登高忙，節節盼高升;小小短信到，細細潤心田，道聲重陽節快樂，生活好滋味!
9、菊飄香，插茱萸，歡歡喜喜過重陽，登登高，望望遠，釋放快樂無煩惱，斟滿酒，敬敬老，父母安康永不老，表思念，送祝福，愿你幸福永相伴，重陽節愿你開心無限!
10、年年歲歲九月九，兩九相重又重陽;金秋九月天氣爽，心曠神怡喜登高;秋糧豐收重陽糕，寓意吉祥步步高;盛世華誕祖國興，尊老敬老新風氣。祝您重陽節快樂!
11、九九八十一，好運全部送給你。不管三七二十一，幸福將會糾纏你。重陽節到來之際，為你奉上真誠的祝福，愿你登上人生的最高峰，事事都成功!
12、九九重陽，九九祝福，九九快樂，九九成功，九九好運，九九平安，九九發財，九九健康，九九幸福。九個九九，思念九九，情意九九。
13、理想幻想夢想心想事成;家事公事心事事事順心;財路官路人生路路路暢通;晴天雨天天天開心，友情親情愛情情情似海;中秋國慶重陽節節節快樂!
14、松柏不殘四季翠，山村難老百歲人，三三令節春時松，更高九九芳辰重陽鶴添壽，愿秋風捎去我的思念和祝福，祝你越活越精神，越活越年輕!
15、送你九九重陽節開心秘方：工作放一放，心事擱一擱，煩惱拋一拋，身體歇一歇，心情釀一釀，開心笑一笑，牙齒露一露，快樂好心情。祝天天開心!
16、姐擁有一座快樂別墅，兩幢好運公寓，三輛成功豪車，四季健康時光，愛姐追姐的人多了。但姐就看中了你，非你不嫁。記住了，我叫重陽“姐”。
17、重陽節，敬老時，不管你年齡有多大，請保持燦爛的笑容平和的心態，把有限的生命融入到無限的快樂中去，就能青春永駐，幸福長享。重陽快樂!
18、一言九鼎送秋風，秋景，秋實，秋葉，三言兩語送秋夢，秋波，秋雨，秋水宜人，秋意濃，九九歸一九月九，重陽佳節幸福天長地久。
19、濃情九月九，思念掛心間，一片孝心，一份關愛，一份誠摯，一份祝福，將真摯的情感表達，祝福天下所有的老年人重陽節快樂!
20、9月9，請你品好酒：千年陳釀女兒紅，喝了氣色紅潤，身體好，百年佳釀茅臺酒，喝了一醉解千愁，人間難有幾回有!祝你重陽快樂!
21、九九八十一，重陽來做題，九份成功甘露水，九份快樂甘露水，八十一份幸福漿，加上你這個儲藏瓶，百分人生終歸你。
22、重陽送九“久”：友情歷久彌堅，愛情天長地久，事業久煉成鋼，生活長治久安，人氣久負盛名，成功由來已久，健康經久不息，好運曠日持久，快樂長長久久。
23、無論天涯海角，總有一條牽掛的線，始終圍繞在你身邊，逢年過節就出現在你眼前，重陽節到了，祝愿我的朋友幸福健康，平安快樂，心想事成，萬事如意!
24、我的祝福跋山涉水，餐風飲露，降妖伏魔，一路西行，歷經九九八十一難，終于成功抵達你的手機，趕在九九重陽佳節之前，對你說一聲：節日快樂!
25、登高遠眺，層云朵朵，晚霞夕照，余暉勾勒出人間的美好;九九重陽，茱萸遍插，酒香，美酒蕩漾著生活的芬芳;值此佳節，真誠祝愿，愿你快樂永遠!
26、歲歲重陽，今又重陽!去年黃花亮，今年黃花黃!只等登高望遠，家鄉的人還好!愿秋風帶去祝福，帶去問候，祝福家鄉的人身體康健，問候遠方的人兒幸福長久!
27、九九重陽節日到，我的短信首先到，登高望遠先敬老，賞菊插萸憶歡笑，一葉一信總關情，好運籠罩樂逍遙。祝重陽節鴻運總圍繞，幸福無限延。
28、重陽佳節，一心一意想著你，對你的思念，久久不能忘記。兩心相映不分離，三生有幸愛上你，祝你福壽無疆，越活越精神，越活越年輕，越活越健康!
29、歡送國慶，朝陽無限好，大江向東流，萬家歡樂遍神州;喜迎重陽，風凰棲梧頭，花開滿枝稠，人壽年豐身無憂。雙節同慶，祝君好事成雙，幸福又吉祥!
30、九月九的重陽—友誼情深;美酒—芳香宜人;艷陽—普照大地;韭菜—味美可口。好一個九月九，朋友!今天我將永久地祝福你重陽節快樂。
31、九九重陽到，祝福跑不了，送一縷秋風給你，愿它拂去你所有的不如意;送一杯茶給你，愿它沖走你所有火氣;送一枝茱萸給你，愿它帶走你所有的霉氣;送一條短信給你，愿它帶給你歡喜!
32、一陣秋風捎去一片牽掛，一場秋雨帶去一份溫馨，一縷陽光送去一份暖意，一群大雁載去一腔思念。九月初九重陽佳節來臨，祝愿朋友開心久久，健康久久，甜蜜久久，幸福久久。
33、九九艷陽天，登高賞。茱萸插發間，驅邪求平安。揮酒祭天地，祈福在人間。席地飲美酒，快樂天天伴。重陽節愿朋友，全家平安吉祥!事業大展輝煌!
34、家有一老，如獲至寶∶似綠草，風吹不倒。鍛煉長跑，動作靈巧。丟開煩惱，困惑不擾。重陽節好，福氣來找。您可千萬別怪我膽子不小，歡心來討。
35、重陽怎么樂呵，有人花錢吃喝，有人花錢點歌，有人花錢美容，有人花錢按摩，今天我自個兒花錢，發條信息陪你嘮嗑，送你一點秋波：祝你重陽快樂!
36、重陽節送您限量版重陽糕，祝您心情好開心程度高，工作順辦事效率高，薪水漲升級職位高，身體棒生活質量高，朋友多人氣指數高，福氣到運氣與天齊高!
37、在艷陽高照的日子中，我們迎來了盼望已久的節日，與家人團聚，享受著快樂的洗禮，記得笑容多一點，重陽節快樂。
38、重陽節：我國古代以“六”為陰數，九”為陽數，九月九日正好是兩個陽數相重，所以叫重陽”，也叫“重九”，你知道嗎?重陽節快樂。
39、重陽到，買輛奔馳送你，太貴!請你出國旅游，浪費!約你海吃一頓，傷胃!送你一支玫瑰，誤會!給你一個熱吻，不對!只好短信祝福你，實惠!
40、生命之春，如春草般蓬勃。生命之夏，如夏花般燦爛。生命之秋，如秋楓般靜美。九九重陽，時值霜天季節，你卻格外神采奕奕。祝您老節日快樂，健康長壽!
41、一帆風順，雙喜臨門，三羊開泰，四季發財，五谷豐登，六六大順，七星高照，八發，九九重陽祝你十全十美!
42、重陽節：老人養生，紅糖少不了。老人對各種微量元素和維生素的攝入逐漸減少，而紅糖含有較多維生素和礦物質，老人在吃糖時，應多選擇紅糖，可維持正常代謝功能，延緩衰老。
43、據考證，史上第一個淘寶店主是一位詩人，名叫王維。證據就是他在重陽節給買主寫的一句慰問詩：“每逢佳節倍思，親!”親，重陽節快樂哦!
44、重陽去登高，我送祝福到，祝你工資翻倍漲的高，祝你事業發達飛的高，祝你身體健壯跳的高，祝你萬事如意笑聲高，祝你生活幸福步步高。
45、送你清風讓你心曠神怡，送你細雨洗去你疲憊的汗跡，讓藍天作封白云作信，讓流星作我的特快專遞，送你彩虹通向夢想之旅，祝你重陽節快樂!
46、一九二九快樂無憂，三九四九健康逗留，五九六九幸福不走，七九甜蜜無愁，九九重陽團聚久久，十分祝福祝你無愁，快樂永遠長長久久!
47、九九久久，重陽節送給你雙重的祝福：祝你麻將常胡九;祝你活到九百九十九;祝你的福氣財運長長久久;祝你的幸福天長地久。再送你一瓶吉祥美酒，痛飲。
48、今天你是世上最幸運的人，恭喜你收到我的這條短信，雖然你也許還沒有滿一百歲，但我會提前祝你長命百歲，萬壽無疆，九九重陽，久久健康!
49、清秋日，重陽節，祝福短信不能缺，先向老人致問候，祝雙親身體健康，神清氣爽;再祝合家歡樂，共度佳節;三祝工作順利，發達事業，最后來句總結：重陽節快樂!
歲歲又重陽范文6
2、金秋送爽，丹桂飄香，重陽又至，問候送上。品濃酒之香，念遠方老友，送真心祝福，愿你年年歲歲，無憂無愁!
3、生活是座迷宮，愛是一個謎題，從容游迷宮，開心解謎題。景好不如人美，相遇不如神交，九九重陽節，祝你樂逍遙!
4、您生命的秋天，是楓葉一般的色彩，不是春光勝似春光，時值霜天季節，卻格外顯得神采奕奕。祝您老重陽節快樂，健康長壽!
5、與你相遇在秋高氣爽的重陽，想你在初冬漫漫的圣誕，吻你在青草已綠的春天，只想輕輕的問你——重陽給我一次美好的約會，好嗎?
6、敬老鼓琴仙度曲，愛老種杏客傳書。重陽節快樂!
7、重陽及門第，碧月護富翁!無限秋光好，我請你去賞菊，好嗎?
8、重陽節到了!在這個快樂的節日里!祝愿你：事業豐收，薪水豐收，愛情豐收，歡樂永相隨!
9、九月九，佩茱萸，食蓬餌，飲酒菊，登高山，心神怡，送鴻運，福相依!祝愿重陽快樂，萬事如意!