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熱休克蛋白范文1
關鍵詞:熱休克蛋白;結構;功能;針灸;中藥
中圖分類號:R456 文獻標識碼:A 文章編號:1673-7717(2010)04-0718-03
Comparison of Different Heat Shock Proteins and Their Relationship with the Chinese Medicine
HUANG Yun,Advisor:LING Yaping
(Department of Acu-moxibustion and Massage,Hunan College of Chinese Medicine,Changsha 410208,Hunan,China)
Abstract:Heat shock protein is a group of highly conserved protein molecules family who has important physiological functions. Physiology, pathology and environmental factors can be induced by heat shock protein production, it is also known as stress proteins. According to molecular size and degree of homology, HSPs can be divided into HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, small molecular HSP family of five major. Current,We studied HSP90, HSP70 most, but few on the HSP110. HSPs have much in common, but each HSP family has a unique structure and function. HSPs can protect the body , so try to find a no toxic side effects of HSPs induction agent or method has become an active area of research at home and abroad. Acupuncture and Chinese medicine of Traditional Chinese Medicine can affect the expression of HSPs.We make a review aboutthe structure、function of the HSPs and the relationship with Chinese medicine.
Key words:heat shock protein ; structure; function ; acupuncture Chinese medicine
收稿日期:2009-11-11
基金項目:國家自然科學基金資助項目(30772707 )國家教育部博士點科研基金資助項目(20070541003)
作者簡介:黃蕓(1984-),女,湖南耒陽人,碩士研究生,研究方向:經脈臟腑相關機理研究。
通訊作者:林亞平(1956-),女,湖南長沙人,教授,碩士研究生導師,研究方向:經脈臟腑相關機理研究。
熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是Ritossa在1962年首先發現的,當時在研究果蠅唾液腺染色體時發現一種在細胞高溫應激時能產生對細胞有保護作用而且高度保守的蛋白質[1]。HSPs每個家族針對不同的亞細胞結構都有組成性和誘導性表達,如HSP60和HSP90在哺乳動物中為組成性表達,而HSP70和HSP27在受到高熱、氧化應激或抗癌藥物刺激時的高表達為誘導性表達。
HSPs的功能[2]主要有 :①維持細胞蛋白自穩。②“分子伴侶”作用。③提高細胞對應激原的耐受性。④參與免疫調節,增強免疫功能。⑤既有直接的神經元保護作用,又可誘導其他保護性機制的產生,直接或間接參與神經元的自身保護。⑥參與細胞周期的調節。
HSPs的分子生物學特性[3]:①生物界的普遍性。自然界所有的原核和真核生物都有HSP。②高度保守性。不同物種有同源性很高的HSP,其中氨基酸序列有50%～90%的一致性, 但不同家族HSPs之間則無明顯序列同源性。③非特異性。除熱環境以外,其他的物理、化學及生物應激原,如缺血、缺氧、感染、創傷、重金屬離子、氧自由基等均可誘導HSPs的產生。④交叉耐受性。是指一種應激刺激誘導細胞產生HSPs后,不僅使細胞對該刺激的耐受性增加,也增加了細胞對其他應激原刺激的耐受性。⑤模擬性。指能以分子模擬宿主自身抗原,兼具迷惑宿主與致病的兩重性。⑥雙重性。指有自身抗原和特異抗原,能引起抗感染免疫及腫瘤防護,又能誘導多種自身免疫病及感染炎癥。
除了上述的共同特點外,各個熱休克蛋白家族又有獨特的結構、功能及生物學特性。
HSP90:HSP90家族成員主要有HSP90α、HSP90β和gp96(Grp94)。HSP90 在胞漿內主要以同源二聚體的形式存在,每個同源二聚體又由2 個單體構成。HSP90 單體包括3 個主要的結構域:由1個保守的25×103的N 末端結構域和1個55×103的C末端結構域和1個中間結構域[4]。其N端結構域是結合底物蛋白結構域,類似蛋白酶結合底物口袋,C端為寡聚化結構域[5]。HSP90是胞漿蛋白,它通過與靶蛋白的活集團的結合,使其維持所謂“無活性穩態”。HSP90通?？赡嫘缘亟Y合并穩定胞漿中受體分子的活性結合位點,從而避免這些結構與胞漿中的其它生物分子形成聚合體而失活[6]。在抑制細胞凋亡、促進細胞存活上,HSP90主要作用于抑制IκB降解的各個通路上。HSP90能直接與Akt相互作用,抑制它的去磷酸化。磷酸化的Akt能使Bcl-2家族的Bad和caspase-9磷酸化,使它們的活性受到抑制,促進細胞存活。
HSP90作為HSPs 重要成員之一,在腫瘤中研究和應用最多。HSP90在腫瘤細胞中主要處于活化態,而在正常細胞中則主要處于靜默態。pp60v2src 是第一個被發現能與HSP90 作用的原癌基因,它能夠與HSP90 形成HSP902pp60v2src復合體。P53基因突變是至今已知的與人類癌癥相關的最普遍的基因異常, HSP90 也能夠和突變型p53 特異性結合,導致突變型p53 復合體的積聚和半衰期的延長[7]。HSP90 還參與腫瘤血管的生長、侵襲及轉移。研究表明抑制HSP90 的功能可對腫瘤達到“多點攻擊”,達到抑制腫瘤的生長和轉移。HSP90抑制劑可以通過特異性抑制HSP90 阻斷腫瘤生長轉移信號網絡通路中的多個靶點,還能逆轉腫瘤的耐藥性,使腫瘤對化療藥物敏感性增加。HSP90及其抑制劑是目前抗腫瘤研究的熱點和前沿[8]。
HSP70:HSP70家族包括GRP75,GRP78,BIP,HSP68,HSP72,HSC70等。根據表達形式的不同可分為結構型和誘導型兩種:HSC70固定表達存在于胞液與細胞核中,被稱為結構型HSP70;誘導型HSP70(又稱為HSP72或HSP70)為高度應激所誘導。通常所指的HSP70即誘導型HSP70[9]。HSP70蛋白由兩部分組成,即ATP酶區(AT-Pase domain)和底物識別區或叫多肽結合區(pep-tide-binding domain)[10]。HSP70是膜結構相關蛋白,其生物學作用主要是結合靶蛋白的疏水片斷而防止肽鏈的錯誤盤繞。在細胞受到環境變化和有害刺激時,細胞的一部分結構和功能蛋白發生變性,在正常狀態下處于分子內部的疏水片斷暴露“外化”,而形成不穩定的空間結構。HSP70則通過與這些疏水片斷的結合而穩定其結構,并通過復雜的分子間相互作用,利用水解ATP的能量,協助變性蛋白的復性[11]。在控制細胞凋亡中,HSP70高表達能抑制caspase的激活、線粒體的損傷和核斷裂?？梢酝ㄟ^直接或間接地抑制MEK激酶抑制JNK的磷酸化,還可作為天然的抑制蛋白結合到JNK,抑制其活性,從而抑制JNK細胞凋亡通路。
HSP70是HSPs中反應最為敏感研究最多最深入的。在臨床上,HSP70與癲癇、心腦缺血、多發性硬化、感染、腫瘤等多種疾病關系密切。在腦血管病和心血管病中對心肌細胞和腦細胞有顯著的保護作用,減少細胞缺血壞死范圍,修復損傷蛋白質,提高細胞對缺血的耐受性[9,12]。急性腦創傷后在易受損傷區域的神經元HSP70的轉錄表達,能減少神經細胞凋亡,有助于延遲神經細胞的死亡,與神經保護關系最為密切[13-14]。HSP70可與突變型P53形成穩定復合物,從而使核內P53轉移到胞漿中,喪失了控制細胞增殖的能力。HSP70可以激發抗腫瘤細胞的特異性反應,結合細胞內的全部異常肽庫,因此HSP70 - 肽疫苗可以是多價的,這有利于防止免疫逃逸從而增強免疫效果,為腫瘤疫苗開發提供了新的思路。
HSP60:真核生物的HSP60主要位于線粒體內(約70～80%),另有小部分位于胞漿。此外, HSP60存在于某些細胞的分泌顆粒中,例如胰島的β細胞。HSP60是線粒體內最主要的分子伴侶蛋白之一,它與HSP10組成的高分子量聚合物被形容為“巨型呼吸器”,是線粒體基質蛋白折疊和修復系統的關鍵組成部分。人類HSP60與其分子伴侶HSP10的基因頭對頭位于2號染色體上,兩個基因之間有雙向啟動子,啟動子中則含有熱休克元件,接受熱休克轉錄因子的調控[15]。正常條件下,HSP60以穩定狀態存在于細胞質和線粒體基質中,維護抗凋亡因子的正常構象和功能;應激條件下,HSP60迅速從胞質中轉移到線粒體基質以修復線粒體基質中的變性蛋白,對促凋亡因子產生保護和協同作用[16]。因此,HSP60有抗凋亡和促凋亡的雙向調整作用。它的這種抑制或者促進作用可能與細胞種類、所受刺激類型、細胞狀態、HSP60含量和活性等多種因素有關。HSP60 是一種T細胞信號,壓抑或禁止化學反應,其中Peptide (p277) 是它的一個24個氨基酸片段,首先在非肥胖型糖尿病大鼠體內發現的一種抗原,p277能阻止先天的或適應性T細胞受體對B 細胞的損害,從而對1型糖尿病有治療作用[17]。
sHSP:小熱休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)幾乎存在于所有生物體中,其主要結構是由N端域和C端域2個部分組成,C端域含有一個相當保守的α晶體蛋白(α-crystallin)結構域,由約90個氨基酸殘基組成,與其相鄰的是可變的N端域。小熱休克蛋白家族成員的共同特點是特殊絲氨酸殘基上的磷酸化,磷酸化作用會導致sHSP低聚體狀態發生改變,從而使sHSP的生物學功能得以發揮[18]。目前研究最多的sHSP有HSP47和HSP27。 HSP47是內質網內唯一的一種熱休克蛋白,它是一種能與多種類型膠原和前膠原特異性結合的內質網駐留蛋白。在膠原合成及纖維化病理過程中發揮重要作用。國外有多項研究證實,抑制HSP47的表達,可抑制膠原合成,減弱纖維化程度[19-20]。HSP27為ATP非依賴性分子伴侶,其功能主要是防止蛋白質聚集. HSP27既可以維持細胞氧化還原穩態又可以維持線粒體的穩定性,結合和穩定肌動蛋白維持肌動蛋白網狀系統的完整性,防止凋亡因子如激活的Bid進入線粒體膜。
HSPs與針灸、中藥。HSPs對機體具有保護作用,故設法尋找一種沒有毒副反應的HSPs誘導劑或方法,誘導HSPs合成,增加機體對細胞的保護過程,已成為國內外研究的活躍領域。中醫中的針灸和中藥能影響HSPs的表達。在機體受到疾病損傷時,用對機體沒有損傷的針灸和中藥誘導HSPs的表達,對機體產生保護作用。
祖國醫學認為針刺作為一種刺激,作用于腧穴,通過經絡系統的傳導,調節機體臟腑功能,具有溫通經絡,消瘀散結,祛散陰寒,益氣升陷,回陽救逆及保健強身,預防疾病等作用,已得到國內外醫學界的公認[21]。臨床上,刺血療法治療類風濕性關節炎具有鎮痛和瀉熱作用顯著的特點,用三棱針在大鼠患側“昆侖”穴刺血,這種物理性刺激可以直接刺激機體促進HSP70的產生,增強HSP70表達。HSP70的增高又抑制炎癥細胞因子如IL-1、PGE2的轉錄,使之減少分泌并降低循環中的含量[22]。對心臟手術者取雙側內關、列缺、云門穴位針刺,發現針刺對心肌細胞HSPmRNA基因表達有一定的增強作用,表明針刺對心臟手術者的心肌缺血有一定保護作用。劉志彬等對慢性脊髓損傷大鼠模型使用電針治療后,通過增加HSP70的表達能量顯著降低iNOS的活性,保護脊髓神細胞并減輕繼發性脊髓損傷[23]。
艾灸是將艾葉點燃后放置在腧穴或病變部位進行燒灼和熏熨,借其溫熱刺激及藥物作用以防治疾病的一種外治方法。艾灸具有鎮痛、改善血循環、調整代謝紊亂、調節免疫功能和調整臟腑功能等作用?！夺t學入門》說:“虛者灸之使火氣以助元氣也,實者灸之使實部隨火氣發散也,寒者灸之使其氣復溫也,熱者灸之引郁熱外發”。易受鄉等[24-26]對應激性胃潰瘍大鼠艾灸“足三里”“梁門”穴。研究結果顯示,與艾灸非穴對照點組比較,艾灸足三里、梁門穴組大鼠胃黏膜的HSP70家族的表達均明顯增強、MDA含量明顯減少胃黏膜損傷程度明顯減輕,顯著降低了應激性潰瘍指數和潰瘍面積比,并使應激模型大鼠的死亡率降低。
中藥復方或單味藥物的提取物能提高HSPs在機體的表達。于澤等[27]用三七五參湯作用與心肌缺血損傷的試驗中,Western和免疫組化結果顯示三七五參湯組大鼠心肌組織中HSP70的表達較正常組和模型組明顯為高,心肌損傷程度明顯減輕,說明三七五參湯對缺血心肌的保護作用可能與其誘發HSP70表達有關。涂勝豪等[28]觀察雷公藤甲素對膠原誘導的關節炎大鼠的作用。結果發現,雷公藤甲素可以有效地下調模型大鼠關節滑膜和軟骨細胞異常表達的HSP60、HSP70和MHC-Ⅰ類分子。在腦缺血再灌注中,分別用補陽還五湯、黃芪、川芎嗪、葛根素、丹參、復方阿魏酸來誘導HSP70,結果顯示,雖然這些藥物的作用機理不同,但是都使HSP70mRNA及蛋白表達明顯增強,對腦缺血損傷有保護作用。補陽還五湯可明顯抑制HSP70的轉錄,而黃芪則除了可明顯抑制其轉錄外,還可輕度降低HSP70的翻譯[29]。
參考文獻
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熱休克蛋白范文2
[關鍵詞] 宮頸癌;HSP70;免疫組化
[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼]B[文章編號]1673-7210(2010)03(b)-161-02
熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一組進化上高度保守的蛋白質,機體細胞在熱休克或受到其他外來刺激時誘導HSP產生,其在許多腫瘤中呈高表達[1-2]。本研究采用免疫組化SP法檢測宮頸癌組織中HSP70的表達,從而探討其與宮頸癌的關系。
1 對象與方法
1.1研究對象
選擇2008年1月～2009年1月我院收治的47例宮頸癌患者,均接受手術治療,留取手術切除標本。術前均未進行放、化療。同時收集10例正常宮頸組織作為對照組。
1.2試劑
兔抗人HSP70多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉生物技術有限公司。
1.3免疫組化SP法
切片經脫蠟、梯度酒精脫水后,自來水沖洗,蒸餾水沖洗3 min。3%甲醇-H2O2中室溫孵育20 min,蒸餾水沖洗沖洗3 min,PBS沖洗5 min×2次。HSP70采用高壓熱修復。室溫冷卻,放入PBS內沖洗5 min×2次,用山羊血清封閉,37℃溫箱內孵育45 min。滴加兔抗人HSP70抗體(一抗)按1∶100稀釋,對照組用PBS,4℃過夜。PBS沖洗5 min×3次,滴加二抗工作液,37℃溫箱內孵育30 min,PBS沖洗5 min×3次。滴加三抗工作液,37℃溫箱內孵育30 min,PBS沖洗5 min×3次,DAB顯色。蘇木素復染,常規梯度酒精脫水,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。以已知陽性切片作陽性對照,PBS代替一抗作陰性對照。
1.4結果判定
陽性染色為胞質和(或)胞核中出現棕黃色顆粒。每張切片至少觀察10個高倍視野,計數陽性細胞與腫瘤細胞的百分比:50%為(+++),(+)～(+++)為陽性。
1.5統計學方法
數據用SPSS 10.0軟件進行分析,經確切概率法檢驗,P
2 結果
2.1 HSP70的表達
47例宮頸癌中HSP70陽性表達率為74.5%(35/47),10例正常宮頸組織中HSP70陽性表達率為20.0%(2/10),經確切概率法檢驗,差異有高度統計學意義(P
2.2 HSP70與組織分級的關系
47例宮頸癌包括高分化10例,中分化21例,低分化16例,其陽性率見表1。結果顯示,宮頸癌分化程度越低,HSP70的表達越強。
表1 宮頸癌HSP70陽性率與組織分級的關系[n(%)]
2.3 HSP70與宮頸癌組織學類型的關系
宮頸癌組織分型及HSP70陽性率見表2。經統計學分析,差異無統計學意義(P>0.05)。
表2 宮頸癌HSP70陽性率與組織學類型的關系[n(%)]
3討論
HSP廣泛存在于原核和真核生物,在生理條件下,HSP呈基礎表達,調控細胞的增殖與分化、胚胎的生長發育、激素的功能效應等。HSP能調節蛋白質的折疊、傳遞與降解,在維持組織細胞的自身穩定和環境適應性方面也有重要作用。在有害因素如熱、冷、缺血、低氧、有機毒物、重金屬、微生物、組織創傷、基因損傷等的刺激下,均可誘導HSP產生,并保護細胞對抗熱休克和其他導致大量蛋白質損傷、變性的有害刺激,防止應激所致的蛋白質損傷,進而啟動內源性保護機制,發揮抗損傷的應激保護效應。大量研究顯示,表達HSP的腫瘤細胞對熱休克、射線(如γ射線)、TNF-α等多種刺激誘導的凋亡有抑制作用。腫瘤細胞HSP70表達水平一般較高,趙霞等[3]用HSP70反義寡聚核苷酸阻斷Molt-4等腫瘤細胞的內源性HSP70表達,結果發現,HSP70反義寡聚核苷酸的使用可以誘導腫瘤細胞凋亡,同時抑制腫瘤細胞增殖,提示HSP70的表達有助于腫瘤細胞的生存和增殖。
本研究發現,宮頸癌組織HSP70的陽性表達率為74.5%,正常宮頸組織HSP70的陽性表達率為20.0%,與郭云鴻等[4]的報道一致。本研究結果顯示,HSP70的表達與宮頸癌細胞的分化程度和組織類型沒有明顯的相關性,但可以看出,高、中、低分化各自的陽性率差別很大,細胞分化程度越低,HSP70的表達越強,推測HSP70的表達可能與患者的預后有關,HSP70表達越強,患者預后越差。由此可以推斷,HSP70的表達可能與宮頸癌的發生、發展及預后有關,檢測其表達水平有望作為估計患者預后的指標之一。
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熱休克蛋白范文3
【摘要】 目的 探討谷氨酰胺（Gln）對缺血再灌注肝臟熱休克蛋白70（HSP70）基因表達的影響及其對肝臟的保護作用。方法 雄性Wistar大鼠120只，隨機分為3組（n＝40）：假手術組（1組）、生理鹽水組（2組）和谷氨酰胺組（3組）。術前3組大鼠連續5天腹腔注射Gln，2組僅給予等量的生理鹽水。2、3組采用Pringle's法阻斷入肝血流，35 分鐘后開放復流，1組僅行麻醉、開腹。分別于阻斷前及再灌注后2、4、24小時，取血及肝組織，測定血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、腫瘤壞死因子α（TNFα）及肝組織丙二醛（MDA）的含量，采用RTPCR法檢測肝組織HSP70mRNA的表達。結果 再灌注后2、4、24小時，3組MDA、ALT、AST、LDH及TNFα水平與2組相比均顯著降低（P
【關鍵詞】 熱休克蛋白70；谷氨酰胺；缺血再灌注；肝臟
Abstract： Objective To investigate the influence of Lglutamine on the expression of HSP70mRNA in liver and its protective role against ischemia/reperfusion damage.Methods One hundred and twenty male Wistar rats were pided randomly to three groups(n=40): shamoperation group (group 1)，saline group(group 2) and glutamine group (group 3).Rats in group 2 were pretreated with 4ml 0.9% saline intraperitonally twice per day for 5 days consecutively.In group 3，rats were pretreated with Gln dissolved in 4ml 0.9% saline intraperitoneally twice per day for 5 days consecutively.The rats of groups 2 and 3 underwent total hepatic inflow occlusion for 35min utes through the pringle′s method.Ten rats from each group were randomly chosen and killed before the initiation of occlusion and at 2hours，4hours，24hours after reperfusion respectively.The levels of MDA in liver tissue were measured.The levels of serum TNFα were detected.The serum concentrations of ALT，AST，LDH were assayed on a standard biochemistry autoanalyser.The expression levels of HSP70mRNA in hepatic tissue were assessed by reverse transcription polymerase chain reaction.Results Compared with group 2，the levels of MDA，ALT，AST，LDH and TNFα in group 3 decreased significantly at 2hours，4hours，24hours after reperfusion (P
Key words:HSP70;Lglutamine;ischemia reperfusion;liver
通過啟動內源性保護反應來增強肝臟本身的耐受性，是減輕缺血再灌注損傷最理想的方法。熱休克蛋白（HSP）是一種細胞自我保護性蛋白，促進HSP表達是啟動內源性保護反應的關鍵所在。目前，對于預防性應用谷氨酰胺（Gln）是否可促進HSP70表達和減輕機體繼發性損害報告甚少，且存在著爭議［1-3］。其作用機制如何也不明確。因此，本研究擬探討Gln對缺血再灌注肝臟HSP70基因表達的影響及其作用。
材料與方法
1 實驗動物分組及處理
雄性Wistar大鼠120只，體重300～350g ，隨機分為3組（n=40）：（1）假手術組（1組）；（2）生理鹽水組（2組）：生理鹽水4ml，腹腔注射，每天2次，連續5天；（3）谷氨酰胺組（3組）：Gln溶液（300mg/kg，用生理鹽水稀釋至4ml），腹腔注射，每天2次，連續5天。術前禁食12小時，自由飲水。所有動物均采用戊巴比妥鈉（3.5mg/100g）腹腔內注射進行麻醉。沿腹正中切口切開腹腔，顯露第1肝門，采用Pringle's法用無創血管夾阻斷肝十二指腸韌帶，持續35分鐘后，撤夾恢復血流。分別于缺血前及再灌注后2、4、24小時每組隨機選取10只大鼠，自心臟取血5ml，靜置20分鐘，4000r/min離心10分鐘，分離血清，-30℃保存待測。切取部分肝組織，置于-70℃中保存待測。1組除麻醉、開腹外不做任何處理。血清用于測定谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）及腫瘤壞死因子α（TNFα），肝組織用于丙二醛（MDA）及HSP70mRNA表達的測定。
2 主要試劑
LGln(上海康達氨基酸廠)；MDA及總蛋白定量試劑（雙縮脲）（南京建成生物研究所），試劑配置序號參照說明書；TNFα采用夾心法ELISA檢測試劑盒(上海森雄科技實業有限公司)測定；大鼠HSP70引物參照Genebank［TaKaRa（大連）公司合成］序列為（擴增片段為354bp）：5’AACGTGCTGCGGATCATCAA3’（上游引物），5’CTGGATGGACGTGTAGAAGT3’（下游引物）；內參照磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物［TaKaRa（大連）公司合成］序列為（擴增片段為528bp）：5’ACCACCATGGAGAAGGCCGG3’（上游引物），5’CTCAGTGTAGCCCAGGATGC3’（下游引物） ；Trizol總RNA提取試劑（美國Promega公司）；逆轉錄試劑盒、DNA Market(M)及PCR擴增所需的其他試劑［TaKaRa（大連）公司］；電泳用聚丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）及瓊脂糖等（上?；ど锕こ坦荆?。
3 檢測方法
血清ALT、AST、LDH含量采用島津CL7150全自動生化分析儀測定；血清TNFα、肝臟MDA含量分別采用ELISA方法、硫代巴比妥酸法測定，操作步驟按試劑盒說明書進行；每組在各個時點分別隨機選取5只大鼠的肝標本，采用RTPCR法檢測肝組織HSP70mRNA的表達。
4 統計學處理
數據結果均以均值±標準差表示，統計學差異性檢驗采用SPSS11.5統計軟件進行完全隨機設計方差分析，樣本之間采用LSD法進行兩兩比較。
結 果
1 血清ALT、LDH、AST水平的變化
再灌注后2、4、24小時，3組ALT、LDH、AST水平明顯低于2組（P
2 肝組織MDA水平的變化
再灌注后2、4、24小時，3組肝組織MDA水平明顯低于2組（P
3 血清TNFα水平的變化
再灌注后2、4、24小時，3組TNFα水平明顯低于2組（P
4 各組大鼠肝組織HSP70mRNA表達的變化
術前：1、2組肝臟未見HSP70mRNA表達，而3組明顯表達（P
討 論
HSP是細胞應激蛋白的一種，細胞在受到急性非致死性刺激后，HSP基因即刻被激活，轉錄活性增強，細胞內可檢測出mRNA表達［4］，這最早發現于熱休克實驗中的果蠅唾液腺細胞中，后來證明，它是一種普遍存在于生物界中的能被多種損傷因素和應激因子誘導的細胞應激反應蛋白。HSP根據分子量不同而命名為HSP70、HSP90、HSP27等。對于哺乳動物，HSP70是其中重要的活性成分，它可以被各種物理、化學、生物等刺激所誘導，產生非特異性保護作用。這是因為HSP70作為一種“分子伴侶”，可使應激損害所造成的變性蛋白質重新正確折疊得以修復，或指導它們進一步降解，防止在細胞內積聚而致細胞損傷。
盡管許多方法和藥物可誘導HSP產生，但在臨床實際中，由于受到劑量、毒副作用、誘導效率等許多條件的限制而得不到應用。本研究結果顯示預防性給予Gln，肝臟HSP70mRNA表達水平明顯提高。這表明Gln具有促進HSP70基因轉錄的效應。在缺血再灌注損傷中HSP具有保護作用，其機制可能與下列因素有關：（1）抑制中性粒細胞浸潤［5］；（2）調節白細胞與內皮細胞間的相互作用［6］；（3）提高細胞的抗氧化能力［7］；（4）減少炎性介質的生成［8］，如TNFα等；（5）HSP70還可能調節NO的生成［9］。本研究發現在肝臟缺血再灌注前預防性給予Gln，可減輕再灌注后的脂質過氧化損傷，降低轉氨酶水平，抑制TNFα的釋放，說明Gln在肝缺血再灌注損傷中起保護作用，這可能與Gln促進HSP70mRNA的表達關系密切。因為Gln是一種人體正常需要的氨基酸，對人體無毒，臨床中已廣泛應用。所以，在缺血再灌注前給予Gln誘導HSP70以提高機體自身的耐受性，對減輕肝臟損傷，減少并發癥，改善預后具有積極的臨床意義。
目前對于Gln誘導HSP還存在著爭議［1-3］，各研究結果之間的差異可能與Gln的劑量、應用時間、所作用的組織及動物種屬有關。關于Gln誘導HSP的機制仍不清楚，該效應是由Gln本身還是其代謝產物作用的結果，仍有待深入研究。
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熱休克蛋白范文4
熱休克蛋白，也叫應激蛋白，是一種分子伴侶，除在細胞生長，發育，基因轉錄，蛋白質合成、折疊、聚集細胞骨架等方面發揮重要的生理作用外。還通過多種途徑對細胞受到的不同損傷產生內源性保護[1]。根據分子量大小和同源程度可分為HSPll0，HSP90，HSF70，HSP60，HSP40，小分子熱休克蛋白(Sall heat shock proteins，d-laps)，HSP10和泛素等類型。熱休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)又名熱休克蛋白B1 (heat shock protein BHSPB1)、熱休克蛋白 25(heat shock protein 25(HSP25)，是熱休克蛋白家族中的小分子熱休克蛋白亞家族(sHSP亞家族)的重要一員。近年 HSP27與細胞凋亡及心力衰竭的關系引人注目，本文就HSP27對細胞凋亡及老年心衰的保護作用作一綜述 。
1 HSP27的抗凋亡機制
(1)HSP27與細胞內氧化還原水平：是HSP27抗凋亡最重要的并與衰老密切相關的機制?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)是由外源性氧化劑或胞內有氧代謝中產生的、具有很高生物活性的氧自由基，可直接損害或通過一系列過氧化鏈式反應引起廣泛的生物大分子結構破壞，并可直接改變細胞內環境穩定性。在一些特定條件下，如 缺血、缺氧、離子輻射、紫外線照射、化療藥物、化學試劑等 都可通過介導活性氧的產生而導致細胞凋亡的發生。同時，ROS理論也是細胞老化的中心學說。 Mehlen[2]等將HSP27基因轉染鼠 L929細胞，檢測腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-A，TNF-α)處理后的細胞，實驗結果表明，HSP27能降低細胞中的ROS水平、延緩脂質過氧化及胞質蛋白的氧化等相關過程。還原型谷胱甘肽(GSH)是細胞合成的、胞內重要的水溶性抗氧化劑。實驗證明，組成型和誘導表達增加的 HSP27，通過促進谷胱甘肽自身的氧化還原循環，提高葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性，使胞內GSH的水平增高，對TNF-或放射線等其他類型的氧化損傷具有保護作用[3]。(2)HSP2與caspases：近年越來越多的證據表明，HSP27可以抑制 pro-caspase的剪切活化而具有抗凋亡作用[4]。作為分子伴侶，它能與凋亡信號通路的信號分子結合，抑制胞漿程序化死亡途徑。例如，它能與 Cyt C的結合，阻斷 caspase-9前體的激活，阻止凋亡復合體的形成，抑制了凋亡的發生。[5]在蛋白酶級聯剪切過程中，caspase-3處于核心位置，發揮著非常重要的作用，因此被稱為死亡蛋白酶。前caspase-3被其他蛋白酶剪切后被激活，活化的caspase-3再剪切不同的底物，導致蛋白酶級聯剪切放大，最終使細胞走向凋亡。實驗表明，HSP27可以與前caspase-3結合，抑制其活性，作為該通路的負性調節因子，抑制細胞凋亡的發生。[6]因此，HSP27在應激條件下對caspase介導的凋亡通路的斷作用可能是抑制細胞凋亡的重要機制。 (3)HSP27與凋亡抗原配體 ：凋亡抗原配體-1(apoptosis antigen ligand 1，Apo-1)、CD95又稱死亡受體Fas，Mechlen[7]等采用 Fas敏感的、不表達內源性 HSP27的鼠纖維肉瘤細胞株(L929-Apo-1-6)，轉染人HSP27基因，發現HSP27基因表達能明顯抑制蛋白激酶 c抑制劑 Sturosporine和 TNF-a誘導的細胞凋亡，這一事實有力地證明了人類 HSP27是細胞內介導細胞凋亡的 Fas/Apo-1的抑制物研究表明，通過一條非 caspase依賴性的信號途徑，Fas死亡域相關蛋白(fas death domain-associated protein，Daxx) 其本身雖然不引起細胞凋亡，但可通過 Fas和凋亡信號調節激酶 Ask1的相互作用而介導凋亡的發生。HSP27磷酸化使 HSP27從寡聚體變為二聚體，并與 Daxx結合，阻止了Daxx由胞核向胞漿的轉位以及與 Fas、Ask1的結合，使該凋亡通路中斷。然而，當細胞表達寡聚體形式的 HSP27或缺乏Daxx結合能力的突變體時，HSP27不能發揮抗凋亡作用[8]。這些都有力地證明HSP27與死亡受體 Fas介導的凋亡途徑密切相關。 (4)HSP27與線粒體氧化磷酸化 ：線粒體是細胞內一個重要的細胞器，線粒體內的氧化磷酸化是真核細胞內 ROS產生的主要來源，而 ROS的大量產生可以對脂質和核酸產生破壞性分子鏈反應，會選擇性地使離子通透性喪失或使線粒體膜通透性發生改變，導致線粒體膜勢能發生改變，引起 Cyt C的釋放，激活胞漿程序化死亡途徑 有學者證明，線粒體是HSP27在細胞氧化損傷中起保護作用的作用靶點，熱休克預處理能明顯減輕 H2O2對線粒體的氧化損傷，穩定線粒體膜電位。在熱應激處理的Jurkat細胞系中發現在線粒體片段上有 HSP27的表達;同時發現，HSP27的表達能在凋亡刺激因素的作用下保持線粒體膜電位的穩定，抑制 Cyt C的釋放，而若在刺激因素作用之前加入 HSP27反義寡核苷酸，則出現相反的結果，未起到細胞保護作用[9]。如上所述，HSP27在應激條件下可通過減少細胞內 ROS水平，穩定線粒體膜電位，抑制Cytc釋放，最終抑制細胞凋亡的發生 。 (5)HSP27與細胞骨架：真核細胞的空間結構由細胞骨架(eytoskeleton)維持，微絲是細胞骨架 的一種重要類型，由肌動蛋白構成。近年的研究表明，細胞骨架在細胞凋亡過程中的變化非?；钴S，凋亡過程中可見的細胞體積縮小、凋亡小體形成等形態學變化被認為與微絲的改變密切相關。體內和體外實驗均證實，微絲是caspase的底物，在caspase-3的作用下，微絲蛋白被剪切成長度為15000和 31000的片段，綠色熒光蛋白標記后發現這些片段的導入可引起并促進細胞凋亡的形態學變化?，F已有實驗證實，在氧化等應激條件下，通過 p38- MAPK 激活的蛋白酶-2-HSP-球形肌動蛋白(G-actin)信號途徑，由被活的HSP27使 G-actin磷酸化，并聚合為絲樣肌動蛋白 (F-actin)，導致細胞骨架重排，從而調節細胞的運動，穩定細胞結構。近來發現，HSP27的致細胞骨架穩定作用在凋通路的上游事件中可能也起重要作用，它能阻止一些凋因子和線粒體的結合，從而抑制了Cyt C的釋放及凋亡的發生[10]。另外，在許多細胞類型中，強氧化刺激能引起微絲系統的破壞和肌動蛋白的解聚和片段化，這和 ROS對肌動蛋白半胱氨酸的巰基氧化有關[11]，即細胞骨架自身的氧化還原損傷參與了 ROS引起的細胞凋亡過程，因此，HSP27對ROS的抑制從另一個角度闡明了 HSP27對細胞骨架的保護和對細胞凋亡的抑制作用。(6)其他機制 ：各種如熱、缺血、氧自由基和毒素等刺激導致細胞損傷，胞漿蛋白發生變性、錯誤折疊、凝聚等變化，HSP27能發揮分子伴侶作用，刺激 RNA及蛋白質的合成，協助細胞在死亡之前修復熱休克造成的損傷，使細胞盡快恢復正常生理功能。另外，HSP27抗凋亡的作用機制還可能有抑制熱休克過程 中蛋白的合成，使真核細胞中未折疊的蛋白的量減少，從而減輕應激對細胞的破壞作用[12]和作為凋亡抑制因子的蛋白激酶 B(Akt)相互作用，激活 Akt，阻止細胞凋亡[13]?？傊?，HSP27在細胞凋亡過程中能通過多個途徑起到細胞保護作用，更加確切的機制有待進一步研究。
2 老年心力衰竭與心肌細胞凋亡的聯系
心臟衰老過程中心肌細胞發生壞死和凋亡，造成心肌細胞數量減少，重塑性降低，收縮功能受損。心肌細胞在增齡過程中凋亡速度加快導致心臟質量減輕，功能退化。Kwak[14]等研究發現，左心室細胞凋亡速度與年齡成正比;與年輕對照組比較，衰老左心室心肌細胞減少 30%;性別也會影響細胞凋亡，老年雄性靈長類動物心肌細胞凋亡速度上升4倍，而同年齡組的雌性動物無明顯變化。1996年 Sharov等[15]首次報道在用冠狀動脈栓塞制作的犬 HF模型心臟發現凋亡證據。此后又在其他 HF病人和實驗動物型心臟發現凋亡現象。Olivetti等通過 TUNEI 法發現，處于慢性心衰末期病人的心肌組織中有 0.2% 的細胞出現凋亡，一般看來，凋亡細胞的數量太少不至于對心功能造成不良影響。然而，凋亡是一個短暫事件，其發生過程需20 min～24 h，故推測即使每天有0.2% 細胞凋亡，持續數月或數年則可能造成相當多的心肌細胞缺失。因為心肌細胞數量的減少，可以使心肌收縮力下降，可能會導致 CHF的發生，并使存活的心肌細胞的負荷加重，而使 CHF進行陛惡化。由此對心衰發生的病理生理機制提出這樣一個假說，即活性心肌細胞的持續性缺失可能是進行性心衰的重要機制之一。據報道不同動物有明顯不同的細胞凋亡率，最高可達 35.5%[16]。這些死亡率僅能在很局限的區域見到，細胞凋亡可在24 h內發生并完成，如此速率可導致心臟的快速退化萎縮。最近研究，在終末期 HF已知出現小于 0.5% 的細胞凋亡率，又超出生理性的趨勢。另外，終末期 HF中出現細胞壞死比細胞凋亡更多，最高可達7倍?，F凋亡現象。大量研究表明，在心血管系統中，誘導心 肌細胞凋亡的因素有：壓力負荷導致的機械壓力 、急性心肌缺血、氧 自由基 、細胞 內鈣離子超負荷和 AngII、 ALD、ET等神經內分泌激素以及 TNF、干擾素IL- 1、表皮生長因子、轉化生長因子 -Gl等細胞因子。
3 Hsp27在衰老心肌中的作用
近年來的一些研究表明，HSP27與衰老之間存在著密切的關系，可能對隨年齡性的功能下降起著重要作用。Hsp27抑制過氧化的發生及被破壞蛋白的聚集，延緩疾病的發生延長生命周期[17]。衰老心臟的特征是心肌細胞數減少，剩余的心肌細胞代償性肥大。隨衰老的加重，減少的心肌細胞呈現出凋亡細胞所占比例增加，而壞死細胞所占比例減少的趨勢，HSP27可通過對凋亡的抑制，起到延緩衰老作用。目前研究顯示，老齡導致的心血管生理變化是舒張性心理衰竭的一個重要獨立因素。
4 HSP27對心力衰竭的保護作用
慢性心力衰竭是眾多心血管疾病的終末階段，給患者機體帶來嚴重損害，并給患者家庭和社會帶來巨大的經濟壓力。目前研究表明，HSP27在對抗心肌細胞凋亡的過程中起到了重要的保護作用，而心肌細胞凋亡又是心肌細胞缺失的重要機制，在心衰尤其是老年心衰的發生、發展過程中起重要作用，讓我們不難聯想到HSP27對老年心力衰竭應起到一定的保護作用。C.D.Venkatakrishnan[18]等研究表明，HSP對心肌細胞的保護作用在于HSP27通過激活P38MAPK及磷酸化作用能對用阿霉素Doxorubicin (DOX)誘導的心肌細胞毒性產生保護作用，DOX誘導的活性氧族能夠引起擴張型心肌病和充血性心力衰竭，而DOX引起心臟毒素是由線粒體觸發的心肌細胞凋亡引起的。高溫誘導的小分子熱休克蛋白能夠使DOX介導的氧化誘導的心肌細胞內的毒素減少到最低，也就是說HSP27起到了一個內源性的抗氧化劑作用，對抗DOX衍生的氧化產物，如：H2O2，從而對心肌細胞凋亡及心力衰竭起到保護作用。Hollander等[19]的研究也顯示，Hsp27過表達可縮小體外灌流心臟短時間缺血/再灌注引起的心肌梗死灶面積、改善左心室功能。國內劉莉[20]等也通過建立心肌特異性高表達Hsp27的轉基因鼠模型;并且經Dox誘導小鼠的慢性心衰，并觀察Hsp27對小鼠生存率、左心室血流動力學的影響。結果表明Hsp27心肌特異性過表達顯著改善了Dox誘導的小鼠死亡率和左心室血流動力學參數變化，最后得出結論：Hsp27心肌特異性過表達對Dox誘導的小鼠心衰具有顯著的抑制。雖然心衰病理發生的確切分子機制尚有待進一步闡明，但大量來自動物和人類的研究證據表明，活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成增加產生的氧化應激以及由氧化應激觸發的心肌細胞凋亡，是多種原因誘導的心衰發生發展的共同基礎，而ROS同時也是細胞老化的中心學說，因此HSP27必然對老年心力衰竭也具有一定的保護作用。
5 研究前景及意義
目前小分子熱休克蛋白對延緩細胞凋亡的作用已基本明確，HSP27作為小分子HSP的重要成員亦具有較強的抗凋亡作用，與衰老也有著密切的聯系，這不僅讓我們提出如下問題：小分子HSP是否對老年性疾病也據有一定的保護作用?各種能產生HSP27的治療方法是否能成為抗衰老及治療老年心衰的重要手段?而HSP27是否有可能成為未來心衰基因治療的一個備選基因?目前較為流行的高壓氧治療能產生內源性的HSP27，那么高壓氧治療是否能成為心力衰竭的新的重要手段，而心力衰竭是否能通過基因治療來預防及治療，仍需進一步的研究。
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熱休克蛋白范文5
【摘要】 目的 觀察加味小柴胡湯對順鉑誘導的大鼠肝BRL細胞核轉錄因子-kB(NF-kB)、熱休克蛋白70(HSP70)表達的影響。方法 將BRL細胞分為4組：空白組、順鉑組及加味小柴胡湯大、小劑量組。采用完整細胞蛋白質斑點印跡、免疫組織化學等方法，檢測各組細胞NF-kB、HSP70變化。結果 順鉑組NF-kB表達明顯較空白組升高，HSP70表達降低，組間比較差異有統計學意義；加味小柴胡湯大、小劑量組 NF-kB明顯較順鉑組低，差異有統計學意義；加味小柴胡湯大、小劑量組HSP70表達均升高，但僅加味小柴胡湯大劑量組差異明顯。結論 加味小柴胡湯可下調順鉑誘導的BRL細胞NF-kB表達，上調HSP70表達，此作用可能是該方減輕細胞氧化損傷、抑制細胞凋亡重要機理之一。
【關鍵詞】 BRL細胞；順鉑；加味小柴胡湯；細胞核轉錄因子-kB；熱休克蛋白70
Abstract：Objective To study the effect of modified Xiaochaihu Decoction on NF-kB and HSP70 of BRL cell induced by cisplatin. Methods BRL Cells were pided into control group， cisplatin group， high and low dose of modified Xiaochaihu decoction. Complete cell protein dot blot technique and immunohistochemisth analysis were appllied to detect the change of NF-kB and HSP70. Results There was a significant increase in NF-kB and decrease in HSP70 of BRL cell induced by cisplatin compared with control group. There was a significant decrease of NF-kB in modified Xiaochaihu decoction group compared with cisplatin group. There were increases of the expression of HSP70 in both high and low dose group， but only the high dose group demonstrated significant difference. Conclution The expression of NF-kB of BRL cell induced by cisplatin can be inhibited while the expression of HSP70 can be enhenced by modified Xiaochaihu decoction. It may be one of important mechanisms of relieving cell oxidize lesion and inhibiting apoptosis by modified Xiaochaihu decoction.
Key words：BRL cell；cisplatin；modified Xiaochaihu decoction；NF-kB；HSP70
核轉錄因子-kB(NF-kB)是一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因的增強子kB序列特異結合的蛋白因子，具有多向轉錄調節作用，當細胞氧化損傷后NF-kB的表達增強[1]。熱休克蛋白(HSP)是機體在各種應激害時所產生的一種高度保守蛋白質， HSP70是HSP中最重要的一種中等分子量蛋白，其表達能夠對應激狀態下細胞產生保護作用。HSP的細胞保護作用可能是恢復和維持抗氧化酶功能，修復其在應激狀態時被破壞的功能蛋白，從而穩定細胞結構，使細胞維持正常的生理功能[2]。筆者利用體外細胞培養方法，觀察了順鉑誘導BRL細胞應激反應損傷時NF-kB、HSP70的異常表達及加味小柴胡湯的調控作用。
1 實驗材料
正常大鼠肝BRL細胞，廣州中山大學動物實驗中心細胞庫提供。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM、單克隆抗體、TUNEL檢測試劑盒均購自Sigma公司。順鉑為齊魯制藥有限公司生產，批號0503007。加味小柴胡湯由中國第153中心醫院中藥制劑室制備(原藥材1 g/mL)。
2 實驗方法
2.1 細胞分組及處理
取處于對數生長的BRL細胞隨機分為4組(每組6瓶)。空白組：加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基；順鉑組：加入順鉑5 mg/L及10%胎牛血清的DMEM培養基；加味小柴胡湯大劑量組：加入順鉑5 mg/L、10%胎牛血清的DMEM培養基及加味小柴胡湯4 mg/mL；加味小柴胡湯小劑量組：加入順鉑5 mg/L、10%胎牛血清的DMEM培養基及加味小柴胡湯2 mg/mL。在37 ℃、0.5% CO2培養箱中培養48 h后，將胰蛋白酶消化的細胞制備成細胞混懸液。將收獲的4組細胞分別制成細胞滴片(1×107/mL細胞混懸液滴加至預先處理過的硝酸纖維素膜和載玻片上)、細胞裂解液，并提取DNA和蛋白質，進行免疫組化檢測。
2.2 完整細胞蛋白質斑點印跡
采用間接酶標抗體免疫組化法：點膜標本經氯仿蒸氣裂解細胞膜暴露細胞質內的蛋白質，加0.5%吐溫-20/TBS(Tris- HCl pH 7.2)封閉，加各自的一抗，0.01%吐溫-20/TBS洗2次，加堿性磷酸酶標記的羊抗鼠或羊抗兔IgG，加DAB/NBT-BCIP底物液進行免疫組化顯色，以PBS代替一抗作為陰性對照。
2.3 免疫細胞化學染色
4%多聚甲醛固定后的細胞標本入0.3%Triton X-100/PBS透化后，加10%正常羊血清，甩去多余血清，加1∶100稀釋的各種一抗，置4 ℃濕盒內孵育過夜。PBS，pH 7.5洗后，加1∶200稀釋的二抗(鼠IgG-HRP)，置37 ℃濕盒內孵育1.5 h，以DAB顯色。陰性對照實驗用PBS代替一抗。
2.4 檢測指標
對細胞蛋白質斑點的印跡應用薄層層析掃描儀(Shimadu，日本)進行掃描并對免疫組織化學標本染色，應用圖像分析儀(山富，中國)掃描各標本的免疫反應信號的灰度值。
3 統計學方法
采用SPSS11.5軟件對以上數據進行統計學分析。所有數據用x±s表示，均值之間比較采用t檢驗。
4 結果
4.1 加味小柴胡湯對順鉑誘導BRL細胞核轉錄因子-kB、熱休克蛋白70表達的影響
(見表1) 表1 各組細胞NF-kB、HSP70蛋白表達掃描灰度值(略)注：與空白組比較，**P＜0.01；與順鉑組比較，P＜0.05，P＜0.01
4.2 各組細胞免疫組化顯色比較
細胞NF-kB經DAB染色呈棕黃色，正常組染色淺淡，順鉑組呈棕褐色，加味小柴胡湯大、小劑量組均明顯較順鉑組淺淡，加味小柴胡湯大劑量組更為顯著。提示順鉑處理組細胞NF-kB表達較正常組明顯，應用加味小柴胡湯的實驗組可下調NF-kB表達(見圖1)。細胞HSP70染色呈棕色，正常組細胞染色較深，順鉑組較淺，加味小柴胡湯大、小劑量組染色均明顯較順鉑組深。提示正常細胞HSP70表達明顯，順鉑組HSP70表達降低，加味小柴胡湯大、小劑量組細胞HSP70表達明顯上調(見圖2)。
5 討論
NF-kB是由B淋巴細胞核提取物中檢測到的一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因的增強子kB序列特異結合的蛋白因子，典型的NF-kB由p53和p65亞基組成。在靜止狀態下，NF-kB與I-kB抑制性蛋白結合處于未活化狀態。當細胞受到炎性細胞因子、LPS等刺激時，I-kB激酶活化，I-kB從NF-kB復合體上解離，NF-kB發生核易位并與特定的DNA kB序列結合而促進基因轉錄。NF-kB可被炎性細胞因子激活，而后又誘導炎性細胞因子的表達。因此，早期應用抑制NF-kB活化藥物，對控制炎癥介質的大量釋放將有所裨益[3]。由于活性氧(ROS)可激活NF-kB的表達[4]，在H2O2誘導的細胞凋亡中，可見NF-kB激活轉錄因子p53的表達[5]。本實驗結果表明，順鉑誘導的BRL細胞NF-kB表達明顯升高，提示順鉑致肝細胞損傷的發生機制與NF-kB的高表達有關。
HSP蛋白作為分子伴侶作用，是生物體或離體培養細胞在不良環境因素作用下所產生的一組具有高度保守性的應激蛋白，能保護細胞不受或少受損害。HSP70是目前發現的主要分子伴侶之一，能與蛋白分子結合，保護新合成的恰當構型。當蛋白質受損變性時，能促使其恢復或加速其降解和消除，以維護細胞的功能和生存。HSP70的增加可以提高細胞在各種應激狀態下的生存能力，其細胞保護作用與應激時受損蛋白質的修復或移除有關，主要有抗氧化作用、協同免疫作用、抗細胞凋亡作用等幾方面[6]。HSP70可增強機體對多種應激原的耐受能力，由于各種有害應激可激活細胞內應激激酶而導致細胞凋亡，而HSP70基因表達水平的增加，可抑制應激激酶的激活，防止細胞凋亡，這無疑對預防肝細胞損傷有積極意義。
本研究提示，加味小柴胡湯可下調順鉑誘導的BRL細胞NF-kB表達，上調HSP70表達，此作用可能是該方減輕細胞氧化損傷、抑制細胞凋亡的重要機理之一。
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熱休克蛋白范文6
[關鍵詞] 慢性心房顫動； 熱休克蛋白； 酶聯免疫法； Western斑點印跡法
[中圖分類號] R541.7； Q786[文獻標識碼] A[文章編號] 1671-7562（2008）04-0260-04
Expressionandsignificance ofHSP27/60/70in rightserum and atrial of
patients with chronicatrialfibrillation
PAN Yan-qing, CHEN Xin
(DepartmentofCardiovascularSurgery, theNanjingFirstHospitalAffiliatedof
NanjingMedicalUniversity,Nanjing 210006, China)
Abstract:Objective To investigate the expression and significance of heat shock protein (HSP) in human chronicatrialfibrillation.MethodsRight atrial samples and serum samples were obtained from forty patients undergoing valve replacement, in which twenty patients had chronic atrial fibrillation(AF). The rest of patients suffered from sinus rhythm(SR).The HSP27/60/70 expression level in right atrial samples was determined by Western-blot, while the expression in serum samples was determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. Results(1)There was no difference of HSP27/60/70 expression between serum samples of two groups. (2) HSP 27 were expressed in both groups, while no significant difference of expression level existed (605.66±189.03 vs 584.34±144.79,P>0.05). (3) Compared with SR, the AF group had higher level of HSP 60(5 965.03±1 564.92 vs 3 159.80±1 055.41, P
Key words:chronic atrial fibrillation； heat shock protein； enzyme-linked immunosorbentassay； Western-blot
（Modern Medical Joural，2008，36：260-263）
慢性心房顫動(簡稱慢性房顫)是臨床最常見的心律失常，有70％左右發生于器質性心臟病患者，其中以瓣膜性心臟病、先天性心臟病和冠心病常見[1]。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一種在進化過程中序列高度保守的生物蛋白，對維持機體的自身穩定性起重要作用,是細胞應激反應的生物標志及細胞的內源性保護蛋白[2-3]。近年來，部分研究提示HSP家族和房顫的發生發展可能存在一定聯系。本研究對慢性心房顫動患者血清及右心房心肌中HSP 27/60/70的表達進行檢測，旨在探索慢性房顫可能的發生發展機制。
1 資料與方法
1.1 病例選擇
選取2007年8月至2007年10月間在本院行瓣膜置換手術患者，慢性房顫（AF）組選取20例房顫持續時間>36個月者，其中行二尖瓣置換術8例、主動脈瓣置換術6例、二尖瓣加主動脈瓣置換術6例；竇性心律（SR）組選取20例，其中行二尖瓣置換術10例、主動脈瓣置換術6例、二尖瓣加主動脈瓣置換術4例。兩組患者年齡及性別比較差異無統計學意義(P>0.05)，右房直徑（RAD）、左房直徑(LAD)及左心室舒張末期直徑（LVDd ）均AF組大于SR組（均P＜0.01),射血分數(EF) SR組大于AF組(P＜0.01)。見表1。所有患者的瓣膜術后均送檢，病理檢查結果符合風濕性瓣膜病變表現。
1.2 標本留取及保存
所有患者入院時抽取靜脈血10ml,離心后取血清保存于-20℃冰箱備用。組織標本于手術進行到體外循環開始前，取右心耳組織,立即置-70℃液氮保存。
1.3 實驗方法
用ELISA法檢測血清HSP27/60/70, 試劑盒均為美國ADL公司產品，實驗步驟按說明書進行操作。用Western斑點印跡法檢測心肌中HSP27/60/70，檢測方法按參考文獻[4]。
1.4 數據統計及比較
所有的定量數據均用x-±s表示，采用SPSS11.5軟件進行統計學處理，組間數據比較采用t檢驗。
2 結果
2.1 兩組患者血清中HSP27/60/70含量測定
見表2。兩組患者血清中HSP27/60/70含量比較差異均無統計學意義(P>0.05)。
2.2 兩組患者心肌中HSP27/60/70含量測定
兩組患者心肌組織中HSP27表達未見明顯統計學差異(P>0.05)；HSP70表達水平AF組含量明顯低于SR組(P
2.3 兩組患者血清及心肌中HSP27/60/70相關性分析
只有SR組血清與右心房心肌中HSP27存在低度相關性（r=0.541，P＜0.05),見表4、5。
3 討論
HSP又稱應激蛋白(stress protein，SP)，根據其分子質量大小和氨基酸序列同源性不同，將主要的HSP分為4個家族：HSP90家族、小分子量smHSP家族、HSP60家族和HSP70家族。HSP在抗氧化、協同免疫、抗細胞凋亡方面發揮重要作用[2-3]。
心房顫動是臨床最常見的心律失常之一。近年來，國內外學者部分研究結果提示房顫的發生和HSP家族可能有相關性[5-14]。本研究提示兩組患者術前血清中HSP27/60/70含量差異均無統計學意義(P>0.05)，和Mandal等[6]觀察結果相符，故目前認為血清中HSP27/60/70和慢性房顫發生關系不大。
本研究結果顯示兩組患者心肌組織中HSP27表達差異未見統計學意義(P>0.05)。HSP27 是smHSP亞家族中的重要一員，Yang等〔15〕研究結果提示特發性房顫組患者心肌中HSP27表達較另兩組增高。Kampinga等[16]認為HSP27可抑制房顫的持續發作，Brundel等[17]研究提示特發性房顫組患者心肌中HSP27表達較另兩組增高，故目前認為HSP27能夠抑制特發性房顫向持續性房顫轉化，但對已經形成的慢性持續性房顫無特殊抑制作用。HSP27對心肌細胞的保護機制主要包括：(1)促進GSH 生成,提高細胞內還原能力; (2)抑制細胞色素C (CytC) 釋放和Cyt C 凋亡蛋白酶激活因子1復合物形成; (3)抑制caspase 前體活化; (4)穩定細胞骨架。
本研究結果提示患者右心房心肌組織中HSP70表達AF組低于SR組，差異有統計學意義(P
本研究結果提示兩組患者心肌中HSP60表達差異有統計學意義(P
熱休克蛋白家族和慢性房顫的發生發展有關。細胞內HSP70合成增多，可能通過參與心肌細胞離子通道修復、穩定細胞膜和溶酶體膜、防止蛋白質變性等途徑以維持心肌細胞的正常結構及功能以避免房顫的發生；心肌細胞合成HSP60增多，通過抗細胞凋亡及參與抑制應激激活激酶途徑、增強分解ATP滿足心肌細胞需氧等途徑以保護心肌細胞，但同時也可能導致細胞間黏附分子的表達來促進心肌結構重構，故HSP60在慢性房顫患者心肌中表達后可能不完全是保護性作用。HSP27可能是通過防止心肌細胞溶解從而保護心肌，防止突發性房顫向慢性持續性房顫轉化。HSP27、HSP60及HSP70可能是在慢性房顫的發生及持續發作的不同階段發揮其心肌保護作用，但具體保護機制尚有待進一步研究。
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