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胚胎干細胞范文1
關鍵詞：人胚胎干細胞（hESC）；內細胞團；飼養層細胞；培養條件；mTESRl
中圖分類號：Q2-33
文獻標識碼：A
文章編號：1007-7847（2014）04-0349-04
人胚胎干細胞（human embryonic stem cell，hESCs）是從早期胚胎（原腸胚期之前）或原始性腺中分離出來的一類細胞，它具有無限增殖、自我更新和全能分化的特性，基于這些特性，胚胎干細胞可以被廣泛地利用于個體發育研究、藥物藥理、干細胞移植治療等多個領域。尤其是胚胎干細胞移植治療方面，被認為是治療由于細胞退化及功能喪失所導致的多種退行性疾病的最有前景的治療手段。1998年美國Thomson實驗室建立起第一株人胚胎干細胞，同年，SHAMBLOTT小組從人原生殖嵴細胞及腸系膜細胞中分離出多能干細胞，以后的十幾年中，雖然人胚胎干細胞的建株及維持培養條件不斷地改進，但仍然沒有解決異源性物質潛在污染的問題，最優化的培養條件的建立對于干細胞研究的發展以及最終的臨床應用都是極其重要的。在此，本文從不同方面總結了在人胚胎干細胞建株和維持培養條件上所取得的進步。
1經典的建株和維持培養方法與存在的問題
經典的胚胎干細胞建株的方法是基于小鼠胚胎干細胞建株與維持培養方法的基礎上的，采用免疫外科學的方法，用Tyrode's液去除透明帶，用動物抗人抗體與囊胚的滋養層細胞結合，清洗并添加不含抗體的培養基，然后利用動物血清使滋養層細胞溶解，從而得到內細胞團（inner cellmass，ICM），繼而將ICM轉移到以小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）或者永生的MEF（STO line）怍為飼養層細胞（feeder cell）的條件中培養，最終得到胚胎干細胞。建立起來的胚胎干細胞株具有以下幾個方面的特點：1）具有無限增殖的能力及自我更新、自我修復的能力，且在增殖過程中能夠保持核型的穩定性；2）細胞表達全能性基因；3）無論在體內還是在體外環境中，都能分化成為機體所有類型的細胞。自此后的許多年，人們一直延用這種建株及維持培養的方法，但是這種方法有其不可避免的弊端，傳統的培養辦法中采用小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養層細胞，同時在培養基中包含了一些動物源性的成分，這些外源性成分會對人胚胎干細胞造成潛在的污染，使其存在應用的風險。
2建株的細胞來源及細胞分離方法的發展情況
2.1干細胞的來源
傳統的方法通過獲得ICM，繼續培養來建立胚胎干細胞株。有研究人員采用將已經建成的人胚胎干細胞與體細胞融合以及利用孤雌生殖的方法來獲得囊胚，繼而從中獲得胚胎干細胞，這種方法所獲得的細胞，由于染色體數目上的異常，并不是理想的方法。人們也嘗試從桑葚期的胚胎和已經停止發育的胚胎中獲得胚胎干細胞，但是由于建株成功率太低（1.5%），也不能成為有效的辦法。采用類似于植入前診斷（preimplantationgenetic diagnosis，PGD）的方法，Chung等通過顯微操作的手段，從處于8細胞期的胚胎中取出單卵裂球，與親輩胚胎共培養后，轉移到培養皿中培養，以期使具體的個體可以有遺傳背景完全一致的全能干細胞，并成功建立起胚胎干細胞株。然而，沒有一個被取出單卵裂球的胚胎繼續發育成為一個完整的個體，使得這種方法不能被廣泛地應用。有學者利用體細胞核移植（somatic cellnuclear transfer，SCNT）技術，將已經建立起來的胚胎干細胞的細胞核移植到卵細胞內，繼續培養至囊胚后從中分離內細胞團建株，但是，利用這種方法并沒有建立起胚胎干細胞株。為了獲得疾病特異性的多能干細胞，有學者通過逆轉錄病毒載體轉染和基因重編程的方法，使得已經是終末分化的體細胞重新具有干細胞的特性，這就是我們所熟悉的誘導多功能干細胞（induced pluripotent stemcell，iPS）。這種方法建立起來的iPS株具有一定的優勢，由于體細胞是取自接受移植治療患者本人，這就最大程度避免了異體移植有可能產生的移植排斥反應，成為了獲得干細胞的另一重要來源。
2.2內細胞團的分離方法
第一株人胚胎干細胞的分離過程中，使用了動物抗人抗體及動物血清等動物源性的成分，由于這些動物源性成分可能對人胚胎干細胞造成潛在的污染，使得用這種方法建立起來的人胚胎干細胞株在后期的應用中存在風險。利用機械法直接分離囊胚的透明帶以及滋養層細胞來獲取ICM或用酶消化的方法去除透明帶從而分離ICM，在一定程度上避免了ICM與動物源性成分的直接接觸，從未來的使用方面來說是比較理想的分離1CM的辦法。此外，通過利用激光束在透明帶上打孔，在顯微鏡下，利用固定針固定囊胚，用活檢針將囊胚從透明帶中取出，之后，直接將取出的囊胚在培養皿中培養，或再利用激光束將ICM與滋養層細胞進一步分離，再在培養皿中培養，這種方法也是一種可行的方法。也有學者采用將單卵裂球與已經建成的干細胞共培養的方法來獲得胚胎干細胞，但這種方法建株的效率不高。
3飼養層細胞的發展與無飼養層細胞培養條件
3.1飼養層細胞
傳統的方法使用MEF作為飼養層細胞來維持胚胎干細胞的生長，但是由于潛在污染的問題，MEF并不是最理想的滋養層細胞。有研究者指出，MEF能夠為胚胎干細胞提供更多的增殖空間，而HFF（human foreskin fibroblast，HFF）分泌的生長因子能夠更好的促進胚胎干細胞的生長，鑒于這個特點，以期能更好的支持胚胎干細胞的生長，人們使用小鼠成纖維細胞跟人包皮成纖維細胞按比例混合而成的混合飼養層細胞來培養hESC，相對利用單一的飼養層細胞相比較來說，生長在單一的飼養層細胞上的人胚胎干細胞克隆扁平、較薄，而生長在混合飼養層上的人胚胎干細胞克隆飽滿、厚實，其克隆形態顯著好于單一飼養層，但是這種方法并沒有避免異源性物質的污染問題。為了找尋非動物源性的飼養層細胞，人們采用了處于不同發育階段的不同組織來源的人體細胞作為MEF的替代品，如：人類包皮成纖維細胞、胎盤細胞、子宮內膜細胞、成人骨髓基質細胞、胎兒肌肉細胞、胎兒皮膚細胞。盡管不同的細胞取得的效果不同，但都能使干細胞保持未分化的狀態。此外，胚胎干細胞自身分化所形成的成纖維細胞樣細胞也能成為一個自體的飼養層細胞來源。由此得到的飼養層細胞，具有特異性，避免了動物源性成分或異源性成分對于胚胎干細胞的污染。
3.2無飼養層細胞培養條件
為了進一步純化胚胎干細胞以減少日后使用的風險，有學者提出是否能夠采用成分明確的物質的組合來徹底替代飼養層細胞的粘附功能及分泌功能，為了解決這個問題，van Hoof等利用基底膜基質（Matrigel）和纖連蛋白（fibronectin）來代替飼養層細胞的功能，同時，利用飼養層細胞條件培養基（feeder conditioned media）跟成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor）維持干細胞的未分化狀態，這種方法取得了不錯的效果。事實上，這種無飼養層細胞的培養條件能夠很好地維持胚胎干細胞的生長及未分化狀態，許多實驗室現在都采用這種條件培養胚胎于細胞。
3.3胚胎干細胞的體外培養液體系
為了避免培養液中所含成分對胚胎干細胞的潛在污染，人們從不同方而做出了努力。首先，在飼養層細胞的培養基方面，人們用成分確定的培養基、細胞因子以及人血清培養人成纖維細胞，得到了不含任何動物源性以及不確定成分的飼養層細胞株。這種方法既保留了飼養層細胞在胚胎干細胞培養過程中的作用，又避免了動物源性成分對胚胎干細胞的污染。胚胎干細胞的培養基方面，傳統的培養基中含有FBS （fetal bovineserum），其中包含有動物源性的蛋白以及一些成分不確定的物質，使得所建的干細胞株可能被污染。為了解決這一問題，Richards等用人血清替代FBS進行胚胎干細胞的維持，以期能夠避免動物源性成分對胚胎干細胞的潛在污染。但是，由于人血清中也含有許多復雜的、成分不明確的物質，而且有可能包含有一些誘導胚胎干細胞分化的物質，所以也沒有很好地解決問題。后來的學者利用成分更加確定的血清替代品（knockout serumreplacement，KSR）來代替FBS。有趣的是，與含有FBS的培養基相比，在KSR培養基中胚胎干細胞表現出更強的增殖能力，但是，血清替代品仍然包含有動物蛋白，而且并不是成分完全確定的，所以也不是最理想的。此外專為培養胚胎干細胞而設計的培養基mTESRl能很好的維持人胚胎干細胞的生長，但是，這種培養基仍然包含有少部分動物源性成分。成分確定的培養基是至關重要的。學者們希望通過采用一些已知成分的組合來代替傳統的培養基，這樣既維持了胚胎干細胞的生長，也不會造成潛在的污染。一些研究組織報道了在培養基中成功使用各種不同組分能夠成功地維持胚胎干細胞未分化狀態的例子，如：bFGF和透明質酸（hyaluronic acid），轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、bFGF和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF），bFGF和GSK3抑制劑（GSK3 inhibitor），激活素A （activin A）和bFGF等。Wang、Xu等發現，利用BMP信號轉導通路拮抗劑（BMP sig―naling antagonist Noggin）和高濃度的bFGF就可以維持胚胎干細胞處于未分化狀態。Beattie等發現，在培養基中使用激活素A、煙酰胺（nicoti-namide，NIC）和角化細胞生長因子（keratinoCytegrowth factor，KGF）能夠維持細胞的末分化狀態，并認為激活素A能夠阻斷干細胞的分化，煙酰胺和角化細胞生長因子則在細胞增殖方面起作用。通過這些方法，將成分明確的物質組合起來，就使得培養基的組成更為簡單，成分更為確定。近來，建立起第一株人類干細胞的Thomson實驗室的學者們，為了使得培養出來的hESCs和iPS能夠更接近于臨床使用的目標，利用8種成分已經確定的成分組成胚胎干細胞的培養基（E8），在實際的應用過程中，這些成分確定而又簡單的培養基在維持胚胎干細胞及誘導多能干細胞的未分化狀態以及細胞增殖方面也取得了不錯的效果。
4臨床級別的人胚胎干細胞
人們期望利用胚胎干細胞的特性來治療各種退行性疾病，這就要求我們所建立的人胚胎干細胞株必須是臨床級別的細胞。如何獲得臨床級別的人胚胎干細胞是一個難題，目前人們大多使用GMP（good manufacturing practices，GMP）的標準來確保所獲得的人胚胎干細胞的質量以及判斷其是否為臨床級別的細胞。GMP要求從人胚胎干細胞建株過程中的各個環節都有質量保證。首先，實驗過程中所使用的耗材及試劑必須經過GMP認證，實驗平臺需通過GLP（good laboratorypractice，GLP）質量認證，實驗中所使用的飼養層細胞必須是在符合GLP的實驗平臺上采用符合GMP標準的試劑與耗材建立起來的細胞株，飼養層細胞必須符合GMP標準或獲得FDA（food anddrug administration，FDA）認證。同時，胚胎干細胞的操作必須有標準的操作程序，實驗人員的培訓必須符合GMP的標準，所獲得的人胚胎干細胞需經過QC（quality certification，QC）的檢測及生物安全性檢測?，F有的胚胎干細胞體外培養液體系，由于其未避免異源性基因的插入，或由于其體系中含有成分不確定的組分而可能對胚胎干細胞造成潛在污染的風險，都不能完全符合臨床使用的要求。只有符合GMP標準的臨床級細胞，使用到臨床時，才能確保細胞的安全性。尋找更加優化、成分更加確定的、不含有動物源性成分的培養條件顯得尤為重要。雖然現存的各種培養液體系經過全球科學家多年的不斷悉心探索，已經取得了長足的進步，但是由于培養液體系中的種種缺陷，使得在這些條件下建立起來的人胚胎干細胞仍然不能完全符合臨床使用的要求，在尋求最優化的培養液體系的道路上，我們仍然任重道遠。
胚胎干細胞范文2
成年心臟心肌的再生能力有限，發生器質性損傷后，常導致不可逆的心臟功能減退。目前，藥理、介入、外科等方面的治療效果仍十分有限。ESC具有強大的分化潛能和增殖能力，能定向分化為結構、功能典型的具有收縮能力的心肌細胞，用于治療心血管疾病有良好的前景。這一方面的研究目前還處于較基礎的環節。
1 ESC可向心肌細胞分化
ESC主要來自囊胚內細胞團及受精卵發育至?？芭咧暗脑缙谂咛ゼ毎?，經體外培養可以分化為心肌細胞。Kehat[1]對由鼠ESC（mESC）分化的心肌細胞進行了一系列鑒定：免疫組化染色顯示α-MHC、α-actinin、cTnI、desmin、ANP等心肌特異蛋白都有表達；RT-PCR提示心臟特異的基因cTnI、cTnT、GATA4、human ANP、MLC-2A、MLC -2V、Nkx2.5和α-MHC特異表達；電鏡觀察到縫隙連接和橋粒，并且隨著培養時間的延長，細胞內肌小節排列漸趨整齊；電生理也顯示了典型的興奮收縮偶連反應。Baharvand等[2]則進行了體內、體外分化情況的對比研究進一步支持了其定向成熟分化。Laura等[3]將人胚胎干細胞（hESC）體外誘導分化的心肌細胞，培養觀察了達3個月，并通過膜片鉗等技術來評估其功能成熟情況，以RT-PCR來評估編碼離子通道的亞基的表達；可發現隨著體外培養時間的延長，ESC分化的心肌細胞愈接近成熟心肌細胞表型。
2 定向誘導ESC向心肌細胞分化
ESC 體外分化為心肌細胞，一般采用胚胎體(EB)形成法，而EB自然分化得到的心肌細胞比較少，約5％[4]。大量的研究[5]認為轉化生長因子（TGF）、骨形態發生蛋白(BMP)、Wnt家族蛋白(Wnt families)、成纖維細胞生長因子(FGF)以及全反式維甲酸(RA)、二甲基亞砜(DMSO)和垂體后葉素、維生素C、5-氮胞苷等可以促進ESC分化為心肌細胞。血清的影響近年來也受到重視， Passier等[6]采用無血清培養基誘導胚胎干細胞，發現心肌自發搏動的數量較含血清培養增加了24倍，如果在培養體系中加入維生素C，分化效率還可以再提高40％；Pal等[7]則發現低濃度血清(5%)維持及有BMP-2(25 ng/ml)的共同作用下，有利于人胚胎干細胞株BG01V和ReliCell((R))hESC的分化。除了提高心肌細胞在胚胎干細胞分化群落中的比例，Wang等的研究[8]發現旋轉的細胞培養系統不但利于ESC分化形成EB，且分化得的心肌細胞成熟度優于普通懸浮培養，并能在3D膠原支架上形成組織。
3 純化已經分化的心肌細胞
ES細胞可分化為心房肌、心室肌、房室結、蒲肯野細胞和竇房結樣細胞。多種心臟細胞類型的混合物移植后，很可能導致心律不齊，不利于長期心功能的維持；純化分化的心肌細胞，是臨床應用的前提。MLC-2v啟動子可特異地使心室相關基因表達，Muller等為ESC構造了CMVenh/MLC-2v啟動子，使增強型綠色熒光蛋白（EGFP）表達，通過FACS篩選陽性細胞，特異地純化了心室肌細胞，基本除去了心房肌細胞，但純化生產大量ES細胞源心室樣心肌細胞仍是ESC應用于心血管疾病治療的一大障礙。目前hESC向心肌細胞誘導分化率較低，而且僅有早期心肌細胞的結構和特性，尚未建立有效的篩選純化技術。有研究提出可通過添加細胞因子，經Percoll密度梯度離心分選獲得，但經此分選后的心肌細胞活性肯定受到很大影響，體內是否具有參與心臟重建功能還有待驗證。
4 移植細胞的選擇
ESC的治療屬于細胞移植治療，尚在摸索階段。用未分化的ESC進行移植是一種探索，早期研究發現未分化的ESC進行移植，可改善心功能；近年Nussbaum等[9]的研究發現未分化的鼠胚胎干細胞不適合移植治療，無論是在正?；蚴怯泄Ｋ腊l生的心臟，不僅沒有明顯的心肌細胞分化，而且會形成畸胎瘤和發生免疫應答；故認為應該進行定向誘導后再用于移植治療。
5 移植途徑的選擇
目前的實驗中有以下移植途徑：（1）經靜脈移植:冠狀動脈血流量約占心排血量4％，經靜脈移植效率十分低下。在心肌梗死急性期，大量炎性介質釋放使梗死區及周邊毛細血管通透性增加，這可能使干細胞經冠狀動脈移植成功，但此期心肌炎癥反應較強，又容易導致移植細胞死亡。（2）心肌內注射:通過特制的針進行心肌內注射，靶部位可以是正常心肌、梗死邊緣帶或是以上二者的聯合，適合與冠狀動脈搭橋術同時進行，目前僅用于動物實驗。（3）心內膜心肌內注射:心臟自動導航系統能夠實現經心內膜心肌內注射，創傷小、安全性高，但移植細胞可隨心臟運動從針孔溢出，無法均勻分布，可能造成移植后心室運動的不協調；且注射部位、注射劑量以及移植細胞在損傷心肌中的生存條件還需要進一步闡明。找到高效、安全的移植途徑是臨床應用前必須解決的問題。
6 移植免疫
細胞的免疫原性主要是由I型主要組織相容性抗原（MHC I)介導的。hESC雖然只表達低水平的MHC I類抗原，但移植治療時仍存在移植排斥反應。目前提出了一些解決ESC移植排斥反應的可行途徑：（1）體細胞核轉移(SCNT)：即治療性克隆技術。將患者的體細胞核移入去核的卵母細胞中，體外培養形成含有患者遺傳信息的ES細胞系，再將其誘導分化成特定細胞（如：心肌細胞）進行移植。（2）通過轉基因技術向ESC轉染患者組織相容性抗原(MHC I)基因。（3）建立ESC細胞庫，將具有不同組織相容性的ES細胞系凍存建庫。（4）通過基因敲除去ESC的MHC基因，建立可共用的供體ESC細胞系。此外，有研究者提出把ESC分化的多能造血干細胞移植到已去除T細胞的受者體內，使受者和供者干細胞形成嵌合體，新生成的T細胞將對移植的心肌細胞形成特異的免疫耐受，達到穩定的中樞清除性耐受，這樣受者無需事先進行免疫抑制。Fandfich等直接用大鼠胚胎干細胞(RESC)打入MHC配型不符的大鼠門靜脈，發現可形成穩定的造血干細胞嵌合體，并成功地誘導對移植心臟的耐受。其具體機制還不清楚，可能是因為RESC不表達免疫刺激因子，不能觸發T細胞的反應；另外RESC表達FASL，與帶有FAS的免疫細胞接觸后觸發免疫細胞的凋亡 。近年有研究[10]發現在有免疫活性的小鼠體內移植ESC未觀察到免疫耐受或淋巴嵌和現象，但觀察到有免疫赦免，會允許ESC形成畸胎瘤。
7 安全性評價
由ESC分化的心肌細胞移植到體內后可能受到局部微環境信號的影響發生變化，目前尚無一個統一的標準對細胞發生的惡性轉化加以確定，有必要進行多項指標的評估：（1）形態學特征的改變。（2）刀豆球蛋白A(ConA)凝集試驗觀察細胞表面結構的改變。（3）錨定非依賴性生長(AIG)。是細胞癌前轉化的特征，同時也是檢測細胞惡性轉化的重要指標。（4）染色體核型分析。（5）動物體內成瘤性檢測。Koch等[11]發現由ESC形成的腫瘤部分地受控于補體的旁路途徑，對補體的易感性也是與ESC形成腫瘤的能力相關的； Behfar等[12]發現TNF-α這種程序重排細胞因子在體內可以促進ESC向心肌細胞的分化，這種作用也許可以抑止ESC在分化中發生腫瘤。建立嚴格控制的標準化干細胞培養體系對于保證干細胞生物學特征的穩定及增強移植的安全性具有重要意義。移植后長期的安全性評價很少，有待于進一步研究。
8 ESC移植治療的動物實驗
Min等將小鼠ESC分化的心肌細胞用GFP基因進行轉染，然后移植到梗死的大鼠心臟，于第六、三十二周觀察，免疫熒光證實GFP基因在心臟表達，植入區的毛細血管增加且大鼠的存活率提高，這說明移植的細胞能長期存活，并保持良好的功能狀態[13]。Yang等將血管內皮生長因子（VEGF）基因轉入ESC，這種轉基因的ES細胞在體外誘導分化后移植到梗死的心臟，顯著增強了心臟的收縮力，免疫組化顯示梗死區域新生血管大量形成[14]。ESC源性心肌細胞移植后促進心功能的恢復，得益于有功能的心肌細胞取代了疤痕組織，使梗死面積減小，減少了梗死局部心肌細胞的凋亡[15]，也使正常心肌組織過度牽張程度降低，保護了其收縮功能。另外，移植細胞可以釋放一些心臟保護因子，如VEGF等，促進心臟功能的更好恢復。但是，移植細胞能否完全整合入心臟組織，是否導致心律失常以及遠期后遺癥等問題還有待研究?，F在的實驗研究多基于嚙齒類動物，相對較短時間內觀察到心功能改善，在更長時間內的效果及在大型動物和靈長類的實驗模型涉及尚少。故在評價動物模型時，應該注意基因表達、細胞信號途徑、物種體內生物學環境等方面的差異，注意實驗室結果與臨床實踐運用的差異性，對其臨床運用的可能給予恰當評價。
ESC不可避免地需要來源于胚胎組織，我國學者贊成以維護和提高人類健康為目的的hESC研究，強調必須嚴格、審慎，堅持倫理原則，嚴格控制使用人為配子制造的胚胎和克隆人的胚胎。作為當今醫學生物技術研究的前沿領域，ESC在心血管疾病治療方面的研究必將為心血管疾病的治療展開新的篇章。
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胚胎干細胞范文3
【關鍵詞】 川芎； 胚胎干細胞； 細胞分化； 心肌細胞
【Abstract】 Objective：To explore the features of differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes induced by Chuanxiong containing serum，establish a simple and efficient system of ES cells differentiation cardiomyocyte.Method：The action of ES cell activity under Chuanxiong containing serum were observed，visible spontaneous and rhythmic beating embryoid bodies occurred at 3 d，reached peak at 5 d.Myocardial cell specific genes β-MHC were detected by using RT-PCR method.Result：Compared with the rat serum and fetal bovine serum group，theβ-MHC of the cells cultured by Chuanxiong containing serum expression and differentiation rate increased significantly，the differences were statistically significant（P
【Key words】 Chuanxiong； Embryonic stem cells； Cell differentiation； Cardiomyocyte
First-author’s address：Longgang Central Hospital of Shenzhen City，Shenzhen 518116，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.30.005
心肌細胞移植在臨床中已經廣泛使用，移植細胞包括多種，其中最適合于移植的細胞為胚胎干細胞，主要是由于其具有較強的分化能力和增殖能力。胚胎干細胞分化為心肌細胞是研究心肌細胞分化機制的良好平臺和模型[1-2]。隨著現代藥學的發展，人們更加重視中藥的應用，中藥歷史悠久，很多中藥均具有較好的活性，可用于疾病的治療，其中保護心肌功能的中藥應用也較為廣泛，具有保護心肌、改善機體免疫功能、促進蛋白增長及防治細胞凋亡等特點[3-4]。與傳統的化學藥品相比，中藥具有安全有效、價格便宜等特點[5-6]。本實驗利用胚胎干細胞實驗模型，對川芎含藥血清誘導小鼠胚胎干細胞分化為心肌細胞進行實驗研究，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 中藥川芎含藥血清的制備 選取健康未過的SD雄鼠30只[許可證編號：syxk（粵）2013-0085，廣州中醫藥大學實驗動物中心]，個體質量（200±10）g，適應性飼養3 d后進行實驗。將其隨機分為空白對照組、低劑量組及高劑量組，每組10只。給予大白鼠川芎水煎液灌胃（取一定量川芎飲片置容器中，加水沒過藥面，浸泡30 min后，煎煮3次，60 min/次，合并水煎液，過濾，濃縮至含生藥1 g/mL備用），低劑量組的劑量約為正常用量（0.8 g/kg）的5倍，為4 g/kg，2次/d，連續3 d；而高劑量組則為正常用量的30倍，為24 g/kg，
2 次/d，連續3 d，空白對照組灌生理鹽水（4 mL/kg）。人與大鼠動物等效劑量系數由《實驗動物學》可知為6.3。每次給藥10 min后，對其進行取血，將血液靜置2 h后離心（離心條件：3000 r/min，離心10 min），離心后取上清液56 ℃加熱30 min，過濾，保存于-20 ℃。體外含藥血清按20%計算[7-10]。
1.2 胚胎干細胞培養
1.2.1 來源與試劑 小鼠胚胎干細胞選自中科院生化細胞研究所[11-12]；DMEM高糖培養基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、明膠、β-巰基乙醇（β-ME）、絲裂霉素C、非必需氨基酸（NEAA）購自美國GIBCO公司，白血病抑制因子（LIF）購自法國Millipore公司。
1.2.2 胚胎干細胞培養與誘導分化 將凍存在液氮罐中的胚胎干細胞取出，于37 ℃水浴鍋中迅速融化，將細胞立即轉移至10 mL的ep管中，加入適量的培養基，采用300 rcf，10 min離心，去除上清液，加入1 mL培養基吹打，轉移細胞并進行培養，當細胞生長至70%左右時，對細胞進行傳代。培養液分四組，即：川芎血清低劑量組、川芎血清高劑量組、大鼠血清組、胎牛血清組，將收集到的川芎含藥血清和大鼠血清、胎牛血清，配制成10 mL備用，各組培養液終濃度為20%。（1）懸滴培養：ES細胞中加入20%川芎含藥血清（低劑量組和高劑量組）的分化培養液，將細胞密度設置為3.75×104/mL。細胞培養在6 cm培養皿中，取1.6 mL細胞置于10 cm的培養皿內蓋上，將內蓋翻轉使其生長，加入5 mL PBS，孵育1 h。（2）懸浮培養：細胞孵育后對細胞進行觀察，控制細胞懸滴液中細胞個數為1，第2天于倒置顯微鏡下觀察，每個懸滴內均含有1個，吸去PBS，加入分化培養基，移至6 cm中培養，孵育2 h。（3）貼壁培養：細胞培養2 d后，觀察細胞個數，大約為10個，接種至4孔板，第3天時肉眼觀察每個培養皿中均可見數十個EBs。分別接種至事先用明膠包被的24孔板內，每孔中加入2 mL分化培養液。
1.3 實時定量PCR檢測心肌細胞特異基因β-MHC的表達 實驗細胞分四組，即川芎血清低劑量組，川芎血清高劑量組，大鼠血清組和胎牛血清組，每組6孔。提取總RNA并測定濃度，分析其完整性，進而合成cDNA，β-MHC Forward：5’-AGAGCTCATCCTTTCTGGTCAT-3’，Reverse：5’-ACCATCTGACATTCTACAGTCT-3’；GAPDH Forward：5’-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’Reverse：5’-ATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3’[4-5]。PCR體系為：12.5 μL SYBR Green Realtime PCR MasterMix，2.5 μL樣品溶液，1.0 μL引物加水至25 μL。反應條件：95 ℃下加熱60 s，進行預變性；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，如此循環40次。擴增后的產物主要是采用熒光檢測，用ABI 7500 Software v2.0軟件對其進行分析，繪制曲線表，計算Ct值，對系統數據處理后可以得出不同濃度對于細胞分化的影響。
1.4 統計學處理 使用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，以P
2 結果
2.1 川芎誘導小鼠胚胎干細胞向心肌細胞的分化 細胞培養2 d后呈密集狀態，一般為圓形，細胞界限和形態不明顯（圖1）；體外細胞個頭小，但生長速度快（圖1～2）。川芎分化液培養3 d的胚胎干細胞會收縮配體，導致培養時間增加，收縮越明顯，則時間越長。自發節律性收縮區域較大，且細胞形態較單一（圖3～4）。于細胞培養的第3 d可見零星EB球發生自發性節律性跳動，5 d時約有70%的EB球出現節律性跳動，低、高劑量川芎血清組（圖3～4）EB球發生自發性節律性跳動的細胞數量明顯多于胎牛血清（圖1）和大鼠血清組（圖2）。
2.2 實時定量PCR檢測心肌細胞特異基因β-MHC的表達 川芎低、高劑量含藥血清組β-MHC表達量均明顯高于胎牛血清組和大鼠血清組，比較差異均有統計學意義（P
3 討論
隨著人們生活水平的進步，大部分人均處于亞健康狀態，心血管疾病是臨床上常見的疾病。心血管疾病的臨床突破主要來自胚胎干細胞的發展，胚胎干細胞會根據誘導自發分化成多種細胞，如心肌細胞和血管內皮細胞等[13-15]。心肌細胞對于恢復正常供血、免疫功能均有重要的意義[16-17]。一般情況下，胚胎干細胞能夠自然分化，但分化率低，因此提高分化率顯得至關重要。臨床上對于胚胎干細胞的研究較為廣泛，但是研究方向各不相同，關于中藥的研究更是鳳毛麟角，因為涉及人體、細胞、動物等各個方面，給研究工作帶來了一定的困難，但也有部分學者取得了可喜的成果[18-19]。有研究方向為將細胞采用不同密度制成懸浮液，采用不同的方法和改變環境進行培養，分析其分化成心肌細胞的分化率。最后對具有促進分化功能的中藥進行相關的安全性評價，致力應用于臨床。川芎是傘形科藁本屬植物，經研究表明，其具有多種臨床功效，如使血管擴張、增加腦部血流量、改善供血、降低血液黏稠度及改善心肌缺血[20]。本課題組在研究川芎含藥血清的胚胎毒性時發現川芎含藥血清對胚胎干細胞轉化為心肌細胞有促進作用（P
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胚胎干細胞范文4
一般資料：2010年5月～2011年1月收治2型糖尿病患者10例，足部病變嚴重程度按中華醫學會糖尿病學會1996年糖尿病足檢查方法及診斷標準。按入院先后隨機分為兩組。胚胎多潛能干細胞組6例，男4例，女2例，年齡52～78歲，平均613±21歲，其中糖尿病足Ⅱ級4例、Ⅲ級1例、Ⅳ級1例。對照組4例，男3例，女1例，年齡54～82歲，平均602±22歲，其中糖尿病足Ⅱ級2例、Ⅲ級1例、Ⅳ級1例。兩組患者年齡、性別等一般資料比較無顯著性差異。
方法：治療組與對照組基礎治療基本相同。兩組所有皮膚潰瘍創面均用01%新潔爾滅液和生理鹽水依次清洗，清除潰瘍創面的壞死組織，潰瘍創面有感染者先用3%雙氧水清潔膿性分泌物后再按程序清創。在上述基礎上，治療組予胚胎多潛能干細胞治療。既患者在局麻下經股動脈輸入胚胎多潛能干細胞。
結果
兩組患者ABI及足趾皮膚溫度的比較：結果見表1。
討論
糖尿病足屬于祖國醫學“脫疽”范疇，1956年Oakley首先提出糖尿病足一詞，1972年Catterall將糖尿病足定義為“已因神經病變而失去感覺和因缺血而失去活力，合并感染的足稱為糖尿病足”，是糖尿病慢性并發癥之一，也是導致糖尿病病人致殘死亡的主要原因之一。主要臨床表現為足部潰瘍和壞疽，嚴重者需要截肢，截肢率高達40%。由于神經病變，患肢皮膚干而無汗，角化變脆，肢端刺痛，感覺遲頓或消失。因肢端營養不良，肌肉萎縮，屈肌和伸肌失去正常的牽引張力平衡，趾間關節變曲，形成弓形足、雞爪趾等畸形，周圍血管病變，足背動脈搏動消失，足部皮膚溫度下降，休息時伴疼痛等。間歇性跛行，是早期下肢癥狀，行走一定距離后感覺下肢乏力、勞累、麻木，下蹲起立困難，夜間出現休息痛。
根據世界衛生組織(WHO)定義，糖尿病足是指糖尿病患者由于合并神經病變及各種不同程度末梢血管病變而導致下肢感染、潰瘍形成和(或)深部組織的破壞。在臨床上，由于糖尿病患者由于長期受到高血糖的影響，下肢血管硬化、血管壁增厚、彈性下降，血管容易形成血栓，并集結成斑塊，而造成下肢血管閉塞、支端神經損傷，從而造成下肢組織病變。而“足”離心臟最遠，閉塞現象最嚴重，從而引發水腫、發黑、腐爛、壞死，形成脫疽。目前，各大醫院對糖尿病足患者一般采取截肢、搭橋或干細胸移植手術。
胚胎多潛能干細胞在缺血組織中分化合成血管內皮細胞，并分泌多種血管生長因子，促進新生血管生成，從而改善患者病情以及以愈合為目的的一種治療方法。胚胎多潛能干細胞移植治療糖尿病足的療效機制［1］可能是移植后干細胞在缺血組織內分化成內皮細胞后演變為毛細血管，再逐漸塑形成小的側支血管。本研究將10例糖尿病足患者隨機分為兩組，治療組6例和對照組4例，均在控制飲食，嚴格控制血糖穩定基礎上采用清創，抗感染，治療組予胚胎多潛能干細胞及硫酸鋅。對照組予硫酸鋅。結果顯示，治療組有效率為900%，對照組為571%，治療組總有效率明顯高于對照組(P＜005)。本研究發現，應用胚胎多潛能干細胞及α-硫辛酸后，患者血糖迅速達標，感染迅速局限，潰瘍愈合良好，并且下肢供血明顯改善。此外，經胚胎多潛能干細胞治療后［2］足趾皮膚溫度明顯增加，且顯著高于對照組，說明胚胎多潛能干細胞在改善糖尿病足血液微循環方面優于對照組。
參考文獻
胚胎干細胞范文5
關鍵詞：干細胞；胚胎干細胞；全能；多能；單能
干細胞是指機體內一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞。干細胞有不同的分類方法，其中之一是根據細胞的分化潛能，分為全能干細胞、多能干細胞和單（專）能干細胞。在人教版選修三教材中寫到：胚胎干細胞具有發育的全能性。那么它是全能干細胞嗎？造血干細胞是多能干細胞還是單能干細胞呢？本文將對此進行初步辨析。
一、全能干細胞
全能干細胞具有形成完整個體的分化潛能。哺乳動物的生命始于受精卵，經卵裂形成桑椹胚，再經過囊胚、原腸胚、組織器官形成，直至發育為完整個體。而真正意義上的全能干細胞只有受精卵和卵裂早期（一般不超過16個細胞的胚胎）的細胞，其中的每個細胞安置到適宜的子宮內，不僅可以分化產生3個胚層中的各種類型細胞，還能發育成胎盤組織，最終都可以發育為一個完整個體。
二、多能干細胞
多能干細胞分為兩類，一類稱為多潛能干細胞，與全能干細胞相比，多潛能干細胞已經失去了發育成完整個體的能力，但仍具有分化為體內全部200多種類型細胞的潛能。如囊胚內細胞團細胞和原始生殖細胞。另一類多能干細胞是指分化潛能有限，一般局限于分化成與其來源相近（同一胚層）的細胞類型的干細胞。例如骨髓間充質干細胞，它們可分化形成骨、肌肉、軟骨、脂肪等組織細胞，卻不能分化出全部類型的細胞；又如存在于人體骨髓中的造血干細胞，可以分化成紅細胞、血小板、粒細胞和淋巴細胞等十種以上的血細胞，但它們都不能分化出體內全部類型的細胞。
三、 單（專）能干細胞
單（專）能干細胞是指只能向一種或幾種密切相關的細胞類型分化的干細胞。如小腸上皮中的干細胞，它能夠分化為小腸上皮細胞等4種細胞；神經干細胞可分化產生3種細胞。
四、胚胎干細胞
20世紀60年代，人們發現小鼠畸胎瘤中存在有未分化的多能干細胞，在適宜的條件下，它們可形成多種類型的細胞，由于畸胎瘤是原始生殖細胞癌變而成，因此，人們就把這種畸胎瘤中發現的干細胞稱為胚胎癌細胞。1981年，科學家用小鼠囊胚的內細胞團細胞建立了多能干細胞系，這種多能干細胞被稱為胚胎干細胞。此外，人們還嘗試從原始生殖腺中直接分離未分化的多能干細胞，他們也可以在體外適宜的環境中保持未分化狀態并較長期增殖，這種干細胞被稱為胚胎生殖細胞。雖然胚胎癌細胞、胚胎干細胞和胚胎生殖細胞是三種不同的細胞，但它們在體外都具有無限增殖或較長期增殖和多向分化的潛能，而且從細胞起源來看，它們都直接或間接的來自胚胎組織，因此可把它們統稱為胚胎干細胞。
綜上所述，人體骨髓中的造血干細胞應屬于多能干細胞；而來自囊胚內細胞團和原始生殖嵴的胚胎干細胞亦屬于多能干細胞，它雖是一種高度未分化細胞，具有發育的全能性，但卻不儆諶能干細胞，只有受精卵和卵裂早期的細胞才是真正意義上的全能干細胞。
參考文獻：
胚胎干細胞范文6
今年諾貝爾生物獎頒給了在基因靶向技術領域有杰出貢獻的科學家，下一次，可能就會輪到干細胞研究了。整個11月，醫學和生物學界最大的新聞就是華裔女科學家余君英領導的實驗室成功分離出“萬能細胞”，即將普通的人體皮膚細胞改造成干細胞，然后通過基因重組，最終培育成人體組織或器官。
另外一個干細胞的新進展是11月14日發表在《自然》雜志上的論文：如何利用一種被稱為“體細胞核移植”的技術創造胚胎干細胞。研究人員已經在猴子身上成功進行了試驗，第一批原始胚胎已經克隆出來。所謂“體細胞移植”指的是將人體細胞的細胞核取出，將其放入一個未受孕的卵子中，最終成功孕育出一個新胚胎干細胞。
獲取胚胎干細胞的另外一種辦法是干細胞里攜帶有個人基因。這種方法是利用一套分子指令，將一個體細胞轉變成干細胞。日本京都大學的研究人員于去年在老鼠身上成功進行了試驗。第一個成功克隆羊的伊萬?維爾穆特在同一期《自然》雜志上發表評論說，迄今為止，沒有任何跡象表明京都大學的這項技術在人類細胞上同樣有效。然而，就在《自然》雜志發表“體細胞核移植”論文后不久，京都大學研究人員和威斯康星州立大學的科學家俞君英分別在《細胞》和《科學》雜志上發表了論文，兩篇論文說的其實是一件事：如何將“體細胞移植”這項技術有效地運用在人類細胞上。維爾穆特看了雙方公開的數據后，馬上改變他之前的堅持，并表示今后他也會把精力集中在這項最新的技術上。
科學家們之所以對胚胎干細胞如此感興趣，是因為胚胎干細胞可以轉化成其他各種身體細胞，這樣，用帶有病人基因的新組織或器官替換那些已經不再起作用的組織或器官的可能性就會大大增加，病人身體的免疫系統也就不會出現排異反應，再生藥物也將因此誕生。
當然，再生藥物距離問世還有很長的一段路，但在可以預見的未來，在研制新藥方面，培育某些身體組織的這種能力將體現出巨大的價值。從基因經濟學的角度說，利用這一新技術獲取干細胞將擁有巨大的商業前景。
