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低密度脂蛋白范文1
如今,測定LDL-C已是醫院檢驗中的常規項目,測定結果也比過去準確得多。那么,我們血中的LDL-C含量有多少才好呢?在1997年,我國有關專家聯合制定了《血脂異常防治建議》,將LDL-C的含量低于3.12毫摩爾/升(120毫克/分升)定為合適范圍;3.15～3.61毫摩爾/升(121～139毫克/分升)為邊緣升高;3.64 毫摩爾/升(140毫克/分升)以上為升高。2002年,我國進行的大規模血脂水平調查發現,隨著社會經濟的發展、人民生活水平的提高和人們生活方式的改變,人群中的LDL-C含量逐步升高。而且,城市居民高于農村,大城市高于中小城市,富裕農村高于貧困農村。根據這一情況,2007年中華醫學會多個有關學會聯合研討,結果了《中國成人血脂異常防治指南》。指南中將血LDL-C調整為低于3.37毫摩爾/升(130毫克/分升)定為合適范圍;3.37～4.12毫摩爾/升(130～159 毫克/分升)為邊緣升高;4.14毫摩爾/升(160毫克/分升)以上為升高?？梢娦碌闹改蠈⑷齻€水平的判定標準都提高了。這是因為人群中的LDL-C水平均有升高。我們應該以這一新標準作為臨床判斷。
根據血LDL-C水平和其他危險因素,包括年齡(男≥45,女≥55歲)、吸煙、高密度脂蛋白減低、肥胖和缺血性心血管病的家族史,可進一步判斷患者發生心腦血管病的危險程度。指南中將危險程度分為低危險性(低危)、中危險性(中危)和高危險性(高危)三類。判斷時,如LDL-C在邊緣升高范圍,則
1. 無高血壓且其他危險因素不足3個者為低危。
2. 無高血壓且其他危險因素有3個或更多者為低危。
3. 有高血壓且其他危險因素1個或更多者為中危。
4. 有冠心病及相等的疾病者為高危。
如LDL-C在升高范圍,則:
1.無高血壓且其他危險因素不足3個者為低危。
2.無高血壓且其他危險因素有3個或更多者為中危。
3.有高血壓且其他危險因素1個或更多者為高危。
低密度脂蛋白范文2
血脂代謝異常是造成動脈粥樣硬化和脂肪肝等多種疾病的重要危險因素。據《中國18歲及以上人群血脂異常流行特點研究》報告，中國人群血脂水平和血脂異?；疾÷孰m然低于多數西方國家，但仍然是威脅我國人民健康的重要危險因素1，需引起人民群眾的重視。同時研究亦表明，血脂中的低密度脂蛋白（LDL-C）升高是冠心病和缺血性腦卒中的獨立危險因素之一，因此對于健康人群和患有心血管疾病人群的LDL-C值達標管理不能一概而論，需要根據不同臨床情況來進行目標值的管理。為此，對前來就診的352例本社區人群的LDL-C值情況進行分析研究，結果如下。
資料與方法
2012年5～8月廣州市越秀區光塔街社區衛生服務中心住院或門診就診有進行LDL-C檢測的社區居民352例，男94例，女258例，年齡35～77歲，平均56歲。并根據患者臨床情況按表1進行分組，其中A組47例（13.35%）；B組47例（13.35%）；C組108例（30.68%）；D組150組（42.61%）。
分組標準：根據歐洲心臟病學會（ESC）、歐洲動脈粥樣硬化學會（EAS）于2011年聯合首個《歐洲血脂異常管理指南》中按不同臨床情況進行危險分層作為分組標準2，見表1。
方法：全部社區居民均為空腹抽取靜脈血，采用選擇性抑制法檢測，該試劑LDL-C的參考值范圍1.4～3.5mmol/L。
統計學處理：應用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，計數資料用X2檢驗。
結果
分析每組各人的LDL-C值，與檢測試劑的參考值范圍比較，高于參考值范圍的即為按參考值范圍標準不達標；同時也與表1中每組的LDL-C目標值比較，高于其目標值即為按危險分層標準不達標，見表2。
討論
血脂通常包括總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）。而LDL-C是血漿中含量最多的一種載脂蛋白，其膽固醇的含量在一半以上，血漿中膽固醇約65%是在其內。許多實驗都證實LDL-C與心血管疾病的發生有密切關系，隨其濃度的增加，而成遞增關系。事實上，早在2008年《美國心臟病學會和美國糖尿病學會在對高危人群的血脂管理共識》（ACC/ADA）中，即提出LDL-C“低一點，好一些”的觀點，特別是在已經明確心血管疾病（CVD）患者中。共識指出，理論上，所有人都應該將LDL-C維持在1.3mmol/L（50mg/dl）的“新生兒”水平，以預防動脈粥樣硬化，CVD患者也應該控制在類似低的水平3。由此，可以明確，LDL-C控制目標日趨嚴格，尤其對我國CVD患者，只有嚴格控制LDL-C水平，才能有效降低發病率及死亡率，改善臨床結局。
目前，我國不少醫院在治療CVD患者LDL-C的方面，治療目標通常定在了參考值的高值，即低于參考值高值就為控制達標，高于參考值高值就為控制不達標。此法有利于全國標準的統一及醫患雙方的掌握及認識。但是，對于不同臨床情況的患者（即已經出現心、腦、腎等臟器損害及糖尿病、高血壓的患者），選擇了同一的降LDL-C治療目標，顯然是不足的，會導致患者啟動調脂治療的標準被抬高和極高危、高?；颊叩貌坏綇娀抵委?。
為此，中華醫學會心血管病分會組織開展的中國膽固醇教育計劃建議：在血脂化驗單上增加指南危險分層信息，切實提高臨床醫生和患者了解不同人群不同臨床情況的膽固醇的控制目標，對屬于不同危險層級的患者進行個性化治療，提高血脂治療的達標率，從而更有效地降低心腦血管事件的發生4。歐洲心臟病學會（ESC）、歐洲動脈粥樣硬化學會（EAS）日前聯合首個《歐洲血脂異常管理指南》更是進一步強調了降低LDL-C的重要性，并且設定了更為嚴格的目標值5。
從本研究可以看出，采用參考值范圍標準進行分析，有37.22%的人超過標準，可診斷為高低密度脂蛋白血癥。而采用危險分層標準后重新定義高低密度脂蛋白血癥，有44.89%的人可診斷為高低密度脂蛋白血癥，明顯高于參考范圍標準下的高低密度脂蛋白血癥人數。提示存在7.66%的人群被漏診或被認為低密度脂蛋白水平降至正常了，可能導致這部分的人群未能進行及時降脂治療或不再進行持續的血脂干預治療。
而存在臨床情況的人群（即屬于危險分級A、B、C組的人群）中，如果采用參考值范圍標準進行分析，則有38.12%的人（77/202）被認為血脂升高或血脂不達標；采用危險分層標準后，則有63.36%（128/202）的人被認為血脂高或控制不達標，較參考值標準高出25.24%。此類人群如果不繼續進行調脂治療，低密度脂蛋白血再次升高或再次發生心腦血管事件的危險性大大增加。
對于無臨床情況（即屬于危險分級D組的人群），被參考值范圍標準認為高低密度脂蛋白血癥36%，而被危險分層標準劃分為高低密度脂蛋白血癥的占20%，較參考值范圍標準的低16%，而這16%的人群可能正在進行或許沒必要的降脂治療。
綜上所述，可以看出幾點：①在社區，有必要對所有人群尤其是對有臨床情況的人群的LDL-C值按臨床情況進行危險分層，按層級管理，在血脂化驗單上增加危險分層信息，無論對于有臨床情況的人群還是醫師本人，都能得到很好的提示和提醒，促使他們和醫生更好地朝目標LDL-C值改善；②采用危險分層標準進行LDL-C值的管理，更貼近臨床，目標更加明確，對指導臨床治療更有意義，使更多的有臨床情況的人群在降脂治療中獲益，有效降低心血管事件的發生。
參考文獻
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低密度脂蛋白范文3
關鍵詞：冠心病； 超敏C-反應蛋白；低密度脂蛋白
【中圖分類號】R446.11【文獻標識碼】B【文章編號】1672-3783（2012）11-0119-01
冠心?。–HD）就是由于冠狀動脈粥樣硬化使血管腔阻塞導致心肌缺氧而引起的心臟病。超敏C-反應蛋白（hs-CRP）是近年來大量前瞻性臨床研究所證實的診斷和預測心血管事件發生及發展的極有意義的指標，它不僅是一種慢性全身性炎癥反應的標志物，而且還直接參與了動脈粥樣硬化形成的過程。隨著生活水平的提高，冠心?。–HD）的發病率越來越高。研究表明炎癥反應在心肌梗死發病機制中起重要作用。超敏c反應蛋白（hs-CRP）是人體的急性時相反應蛋白血管炎癥反應的標記物，hs-CRP血清水平有助于區分血管疾病患者，而在CHD的發病中，低密度脂蛋白膽固醇（LDL—C）起著重要的作用。本文通過對98例（CHD）患者血清hs-CRP及低密度脂蛋白LDL-C資料綜合分析，探討hs-CRP、LDL-C與CHD關系。
1材料與方法
1.1對象：觀察組選取2010年6月至2012年7月住院的冠心病患者，男性60例，女性38例，年齡43-76歲，所有入選患者均排除腫瘤、免疫性疾病、風濕、瓣膜病、糖尿病、貧血及其它炎性反應性疾病。對照組為我院98名健康體檢者均排除冠心病，其中男性60名，女性38名，年齡45-69歲。試驗組及對照組年齡和性別等方面無顯著性統計學差異。
1.2方法：兩組患者標本采集前分別于清晨空腹采血，分離血清后測定hs-CRP和LDL-C含量。
1.3儀器及試劑：儀器為日立7180全自動生化分析儀，hs.CRP試劑為西班牙 BIOSYSTEMS原裝進口試劑。LDL-C試劑為日本關東原裝進口。試驗檢測嚴格按照操作說明進行，質控均在范圍。
1.4統計學方法：采用SPSS 13.0軟件進行統計學處理，計量資料以表示，組間比較采用方差分析，P
2結果
對照組與觀察組是血清hs-CRP和LDL-C比較顯示，觀察組冠心病患者的濃度明顯高于對照組，兩組有顯著性的統計學差異（P
3討論
Hs-CRP是炎癥的一種敏感性指標，炎癥在動脈粥樣硬化的發生和發展中起著非常重要的作用。有研究報道hs-CRP可以反映動脈粥樣硬化斑塊的成分并預測斑塊破裂的可能性，即CHD、急性冠脈綜合征患者hs-CRP明顯升高，其升高水平與冠狀動脈梗阻程度、CHD終末事件的發生及預后、充血性心力衰竭的程度等均有顯著相關性。本研究結果表明，hs-CRP是與動脈粥樣硬化發生、演變和發展相關的促炎因子，hs-CRP在急性炎癥反應導致的斑塊不穩定性中起重要作用。說明hs-CRP水平可以預測冠狀動脈病變的嚴重程度和發生心血管事件的危險性，對評估CHD具有重要的臨床意義。目前有大量的基礎研究結果證實LDL顆粒小、可透過內膜、進入動脈內皮下層。潴留在內皮下的LDL被氧化修飾后可被巨噬細胞攝入，繼而變成泡沫細胞，后者融合并破裂，釋放出大量膽固醇，是構成粥樣斑塊核心（脂質池）的主要成分。所有已知的易損斑塊特性均與斑塊炎癥機制有關。LDL顆粒水平升高及隨后產生的氧化LDL水平升高可能是主要的炎癥激活因子，進而導致脂質核心生長（在內皮下酶水解后）；纖維帽變薄和全身炎癥標志物水平升高。從而增加斑塊易損性，導致AS，危及患者生命。從基礎研究的結果支持，LDL是動脈粥樣硬化性脂蛋白，是CHD發病的重要基礎。因此，在CHD的防治中降低LDL—C水平顯得極為重要。雖然TC測定的研究資料也很有價值，且與測定LDL-C作為觀察指標的研究結果基本一致。但是，由于TC水平同時受HDL-C水平的影響，所以LDL-C能更準確地反映個體患冠心病的危險程度。由此可見LDL-C與hs-CRP聯合檢測可以判斷冠心病的嚴重程度，對于冠心病的診斷和治療有重要參考價值，值得臨床推廣。
參考文獻
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低密度脂蛋白范文4
關鍵詞 姜黃素 肝癌細胞 低密度脂蛋白受體 基因表達 小鼠 流式細胞儀
血清低密度脂蛋白膽固醇酯(LDL-C)的增高是引起動脈粥樣硬化及心血管疾病的主要危險因子之一。現在已很清楚低密度脂蛋白受體介導的內吞作用在低密度脂蛋白的代謝過程中起著重要作用。因此，通過藥物調節低密度脂蛋白受體的表達是控制血漿低密度脂蛋白膽固醇酯水平的一個有效途徑。近年的研究顯示姜黃素具有顯著降低血清脂質過氧化物，增加高密度脂蛋白膽固醇，降低血清總膽固醇含量水平，以及調節脂蛋白代謝相關酶活性的作用[1-3]。肝臟是LDL-C代謝的主要器官，肝細胞膜上有表達豐富的低密度脂蛋白受體。為探討姜黃素調節血脂作用的分子機理，實驗以小鼠肝癌細胞系Hca-F為材料，用姜黃素處理后，應用激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細胞儀對肝細胞攝取胞外DiI-LDL，進行定性、定量分析。
1 材料與方法
1．1 材料：小鼠肝癌細胞系Hca-F購自中國科學院細胞庫；PRMI-1640培養基（Lot#1165062）為美國Gibcobrl公司產品；新生牛血清購自杭州四季青生物制品有限公司；姜黃素為標準品，購自安徽甙爾塔天然有機化合物信息中心；健康成人血漿購自浙江省中心血站；DiI熒光素（Lot#970807）購自美國Biotium公司；細胞培養板與培養瓶購自丹麥Nunclon公司；AKTA prime蛋白純化系統為瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司產品；Biofuge stratos超速冷凍離心機為德國Heraeus公司產品；80MX超高速離心機為日本日立公司產品；激光掃描共聚焦顯微鏡和FACSort流式細胞儀（美國ABBOTT）。
1．2 DiI-LDL的制備：取健康成人血漿，用序列超速離心法,以NaBr調節密度至1．019g/ml，用RT50轉頭，40000r/min，4℃離心22h。上層為乳糜微粒（CM）和極低密脂蛋白（VLDL），小心吸去。將余下血漿用NaBr調節密度至1．060g/ml，同樣條件離心22h，所得上層溶液即為LDL。小心收集至50ml離心管，共得15ml。將得到的LDL裝入透析袋，在4℃冰箱中用1000ml含0．02%NaN3的生理鹽水透析，以除去高濃度的NaBr。12h換透析液1次，透析24h。取出后用聚乙二醇6000濃縮2h，最終得2ml濃縮液。進一步純化使用Sepharose 6B柱，以含0．9%NaCl、0．02%NaN30．01mol/L的PBS溶液作為洗脫液，用AKTA prime蛋白純化系統分離蛋白質。分離條件：加樣量：2ml；流速：0．3ml/min；收集：2ml/管；測定電壓：1mV；走紙：0．2mm/min。對分離所得的第二個蛋白質洗脫峰用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳分析，證實該蛋白質確為LDL。根據記錄儀所顯示的LDL峰，取相應試管中的液體，合并為一管，共得34ml。將得到的LDL裝入透析袋，再用聚乙二醇6000濃縮5h，得到10ml的LDL，以Folin-Lowrry氏法測定LDL蛋白質濃度。取2ml的LDL溶液與100mg不溶性馬鈴薯淀粉置于試管中渦旋震蕩，然后加入60μl DiI(用甲醇溶解，濃度為10mg/ml)4℃放置1h，液氮迅速冷凍，真空干燥器冷凍干燥，然后加入2ml 10mmol/L的Tricine azide(pH8．2)，4℃冰箱中孵育48h，每隔一定時間取出混勻1次。4℃2000r/min離心15min，去淀粉沉淀。取上清，用Biofuge stratos超速冷凍離心機于4℃下12000r/min離心15min，取上清，重復離心1次，所得的上清含DiI-LDL，以Folin-Lowrry氏法測定上清液中的蛋白質濃度[4]。分裝，充氬氣，4℃保存（該試劑不可冰凍，4℃下可保存1～2個月）。
1．3 細胞培養與LDL的吸收測定：取一塊24孔培養板，將小鼠肝癌細胞系Hca-F培養在含10%新生牛血清的RPMI-1640培養液中，1．0×106個細胞/ml，2．5ml1640培養液/孔。實驗設給藥組、對照組、背景控制組。給藥組（又分4組）：培養孔中分別加入姜黃素貯存原液，使其終濃度分別達到10、20、30、40μM。對照組和背景控制組不用姜黃素處理。24h后，各孔取1．5ml細胞液分別至1．5ml離心管中，3500r/min離心5min，去上清。各管加1ml無血清PRMI-1640培養液洗細胞2min，3500r/min離心5min，去上清。背景控制組，加1ml4%的甲醛固定細胞10min，使LDL受體功能失活。3500r/min離心5min,去上清。加1ml含15μg/mlDiI-LDL的無血清PRMI-1640培養液。其它各組分別直接加1ml含15μg/ml的DiI-LDL的無血清PRMI-1640培養液。各管在37℃下孵育4．5h，然后4℃下孵育0．5min，3500r/min離心5min,去上清。加1ml4%的甲醛固定細胞10min)。接著用PBS洗3次[5]。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察各組細胞，并用流式細胞儀定量測定細胞對DiI-LDL的吸收量。
2 結果
2．1 DiI-LDL配體熒光法檢測結果：通過LDL-R介導的內吞作用，肝細胞能夠吸收溶液中的DiI-LDL。細胞內積累的熒光染料量反映了細胞表面LDL-R的活性[6]。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結果表明10～40μM濃度的姜黃素誘導具活性的LDL-R的表達，增加肝細胞LDL-R的活性（詳見圖1）。
2．2 流式細胞儀定量測定結果：應用流式細胞儀可檢測和定量分析細胞對DiI-LDL的攝取量。結果表明10～40μmol/L濃度的姜黃素顯著增加肝細胞LDL-R的活性(詳見圖2、圖3)。
3 討論
根據LDL受體介導的內吞途徑，一個LDL受體往返細胞內外1周約需10min，因此在其20h的壽命中可以往返達數百次。這就意味著一個有功能的LDL受體可以攝取數百個LDL顆粒進入細胞。利用LDL受體的這一功能，我們可以通過對其配體LDL進行熒光素標記后，與細胞一起孵育，應用激光掃描共聚焦顯微鏡即可快速地定性檢測，應用流式細胞儀則可方便、準確、
快速地進行定量分析。選用小鼠肝癌細胞系Hca-F，一方面，肝臟是LDL-C代謝的主要器官，肝細胞膜上有表達豐富的低密度脂蛋白受體。另一方面，Hca-F為懸浮培養細胞，非常適合用流式細胞儀分析。提高LDL-R的活性和降低血清LDL水平是防止動脈粥樣硬化及心血管疾病的有效途徑。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶是肝細胞合成膽固醇的限速酶。它的抑制劑，如他汀類，有些已作為降膽固醇藥用于臨床，但最近的研究表明，他汀類藥物存在一些潛在的副作用，如肝損傷、肌痛、多發性神經疾病等[7-8]。
現代藥理實驗和臨床試驗也證明中藥姜黃可以通過調節血脂水平而起到治療高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化癥的作用，進一步的研究顯示姜黃素是這一藥物中最具活性的調脂化合物，并證明具有上調小鼠巨噬細胞[9]和人永生化淋巴細胞LDL受體基因表達的作用[5]。本實驗進一步證明姜黃素是一個非常強的LDL受體基因表達促進劑，能極其顯著地增加肝細胞對LDL的攝取。
如果病人的LDL-R都是沒有活性的，那么僅僅增加其表達量是沒有意義的。但是絕大數家族性高膽固醇血脂的患者是LDL-R缺陷型的雜合子。他們產生二分之一數量功能正常的LDL-R，他們血漿中LDL顆粒的數量比正常人平均要高2．5倍[10]。實驗表明姜黃素足以能夠將巨噬細胞和肝細胞的LDL-R數量調高1倍，從而降低異常升高的血漿LDL水平。很顯然，姜黃素將是一個潛在的有效降膽固醇新藥。
4 參考文獻
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低密度脂蛋白范文5
【關鍵詞】腦梗死;血漿同型半胱氨酸;氧化低密度脂蛋白
傳統的腦血管疾病的危險因素是高血壓、高脂血癥、糖尿病、吸煙、頸動脈斑塊及家族史等。近年來,血漿同型半胱氨酸 (homocysteine,Hcy)增加作為腦血管疾病的危險因子越來越受到重視。研究證實血栓性疾病患者血漿 Hcy水平增高[1,2]。氧化低密度脂蛋白(oxidativelow density lipoprotein, ox2 LDL)作為腦梗死的獨立危險因素已被認同。本研究重點分析腦梗死患者血漿Hcy與ox2 LDL 之間的關系,為腦梗死的臨床防治提供理論依據。
1 資料與方法
1. 1 研究對象 觀察組:2005年4月至2007年1月于我院神經內科住院的腦梗死患者 85 例,男 67 例,女18例,年齡(65. 16 ±9.74)歲 。所有患者均符合第四屆全國腦血管病會議制訂的診斷標準[3],并經頭顱影像學檢查〔包括頭顱 CT 和(或) MRI〕證實。研究對象之間無親緣關系,排除近 9 個月內用過抗癲癇藥、 多巴胺類藥物、 葉酸和 B 族維生素等,且排除心肌梗死、 心絞痛、 糖尿病、 肝腎功能不全和癌癥。對照組:健康成人 32 例,男 24 例,女 8 例,年齡 ( 58.31 ±9.27)歲。 上述入選者經臨床檢查除外貧血、 嚴重肝腎功能不全、 甲狀腺疾病、 惡性腫瘤等疾病。
1. 2 標本的收集及測定 患者入院后在服用調血脂藥物之前,清晨空腹安靜狀態下采靜脈血,以全自動熒光偏振免疫分析法[4]測定 Hcy,用 E LISA方法測定ox2 LDL。
1. 3統計學處理 計量資料數據以( x ±s )表示,兩均數間比較采用非配對 t 檢驗,相關性用直線回歸分析,以 P < 0.05為差異有統計學意義。
2結果
2. 1 85 例腦梗死患者與對照組血漿 Hcy分別為(14. 73 ± 5. 32)μmol/ L 和(9. 32 ±4. 72)μmol/ L,兩者比較差異顯著(P< 0. 01) 。
2. 285例腦梗死患者與對照組血ox2 LDL 分別為(712. 83 ± 213. 92)μg/ L 和(402. 13 ± 187. 61)μg/ L,兩者比較差異顯著(P< 0. 01) 。
2. 3 在腦梗死患者中 Hcy與ox2 LDL 呈顯著正相關( Y = 0. 76, X = 1. 9, r = 0. 725, P
3討論
近年來大量研究證實,高 Hcy 血癥是動脈粥樣硬化疾病的獨立危險因素之一,并與缺血性腦血管病密切相關,血漿同型半胱氨酸水平升高是中風的一個獨立危險因子.可能是 Hcy 促進氧自由基和過氧化氫的生成,引起血管內皮細胞損傷和毒性作用以及促進動脈平滑肌細胞的增生,并激活血小板的黏附和聚集,導致患者動脈粥樣硬化和栓塞[5]。本研究表明, 腦梗死組血漿 Hcy 水平顯著高于正常對照組,表明 Hcy 參與腦梗死的發生發展過程。研究表明,ox2 LDL 是LDL 在體內經多種自由基離子或其它致氧化因素修飾后形成的,這一過程無負反饋調節作用導致大量膽固醇蓄積,因而ox2 LDL被認為是致動脈粥樣硬化的關鍵因素或始動因子[6]。本研究表明, 腦梗死組血漿ox2 LDL 水平顯著高于對照組,進一步證實了ox2 LDL 參與腦梗死的發生發展過程。我們對腦梗死患者的 Hcy 和 ox2 LDL進行相關分析,發現兩者呈顯著的正相關,說明他們可能是通過共同的機制參與了腦動脈硬化的形成,從而引起腦梗死的發生。
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低密度脂蛋白范文6
關鍵詞：氧化低密度脂蛋白；THP-1細胞；細胞凋亡；內質網應激
中圖分類號：R329.2 文獻標識碼：A 文章編號：1672-1349（2011）08-0973-03
近年來,細胞凋亡在動脈粥樣硬化的形成和進展中的作用日漸成為研究熱點,斑塊破裂伴血栓形成是造成動脈粥樣硬化臨床急性癥狀的主要原因,而大量的細胞凋亡直接造成斑塊不穩定［1］。巨噬細胞通過對斑塊內脂質含量、炎癥反應、纖維成分的降解及新血管形成等方面來影響動脈粥樣硬化病變的進展,在動脈粥樣硬化形成的所有階段都起著極其重要的作用［2］。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）是動脈粥樣硬化重要的危險因素,ox-LDL被巨噬細胞大量吞噬后會導致巨噬細胞胞漿內大量膽固醇的聚集并進一步形成泡沫細胞，同時會導致血循環中的單核細胞向內皮表面黏附并不斷向內皮下趨化,并在內皮下分化成常駐的巨噬細胞［3］。內質網是細胞內重要的細胞器，內質網功能的損傷引起內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS），通過激活未折疊蛋白質反應（UPR）以保護由ERS所引起的細胞損傷，長期過強的內質網應激便會誘導內質網相關性細胞凋亡［4］。不同于經典的凋亡途徑，內質網應激反應性凋亡途徑是一種最近提出的新的凋亡途徑，研究其發生機制可為動脈粥樣硬化等相關疾病的預防和治療提供新的方向。本研究主要探討ox-LDL對人單核巨噬細胞（THP-1）凋亡的影響及其引起凋亡的內質網應激機制。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗儀器 CO2孵箱（HERA cell 150）,倒置顯微鏡（Nikon TS100，日本）,超凈工作臺（LONGHONG，中國）,恒溫水浴箱（HS-4，成都儀器廠）,低溫臺式離心機（Labofuge 400R，Heraeus），FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）。
1.1.2 實驗試劑 人 THP-1單核細胞購自中科院上海細胞庫。ox-LDL由北京醫科大附屬醫院實驗室饋贈。RPMI1640培養基（GIBCO公司，美國）,10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）,胰蛋白酶（solarbio,Spain），PMA（Sigma,美國），鼠抗人GRP78、Caspase-12、CHOP一抗及羊抗鼠IgG二抗均購自Santa Cruz美國公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養與誘導 將人THP-1單核細胞懸浮于含10%胎牛血清的1640培養液中，在5% CO2、37℃、飽和濕度培養箱中靜置培養。在光學顯微鏡下可見細胞呈球形，懸浮狀態。視細胞生長情況進行傳代、換液，選擇生長良好的第3代～第5代細胞用于實驗。實驗前在培養液中加入終濃度為100 mmol/L的PMA孵育48 h，誘導THP-1細胞分化為巨噬細胞。在光學顯微鏡下可見細胞轉化為貼壁狀態，并伸出偽足，呈現巨噬細胞形態。
1.2.2 實驗分組 對照組:細胞置1640培養基中于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養箱中培養。ox-LDL組:在細胞培養瓶中分別加入ox-LDL（25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL）在1640培養基中于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養箱中培養48 h。在細胞的培養瓶中加入ox-LDL 75 μg/mL在1640培養基中于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養箱中培養24 h、48 h、72 h。
1.2.3 細胞凋亡的檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙標記染色法進行檢測，分組分孔收集細胞（1×106個），1 000 r/min離心5 min，棄上清液，每管用200 μL PBS重懸成單細胞懸液。加入10L Annexin V-FITC和5L PI，加入300L Binding Buffer輕輕混勻，避光室溫反應15 min，流式細胞儀檢測，以凋亡的巨噬細胞占巨噬細胞總數的百分比為凋亡率。
1.2.4 Western blot測GRP78、Caspase-12、CHOP的表達 分組分孔收集細胞（1×106個）,進行免疫印跡法（Western Blot）檢測GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表達。將每管細胞洗滌,離心,用細胞裂解液裂解細胞,在其中加入等體積的樣品緩沖液混勻，沸水煮沸5 min，使蛋白質變性，將蛋白質分裝并凍存于-70 ℃冰箱中保存。取樣品蛋白質100 μg,用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白、轉膜、封閉，依次加入一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育2 h后，ECL發光液孵育5 min后，置于圖像分析系統進行圖像掃描及強度分析。
1.2.5 統計學處理 所有數據以均數±標準差（x±s）表示，使用SPSS 13.0統計軟件對實驗數據進行單因素方差分析，多重比較采用LSD法，P
2 結 果
2.1 ox-LDL對THP-1細胞凋亡的影響 各組細胞經流式細胞儀檢測結果發現,對照組細胞生長良好， ox-LDL處理的細胞則出現凋亡細胞。與對照組相比差異有統計學意義（P
表1 不同濃度ox-LDL作用THP-1細胞
48 h后凋亡情況（x±s）%
表2 75 μg/mL ox-LDL作用于THP-1細胞
凋亡情況（x±s）%
2.2 各組細胞GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表達 常規培養的對照組無GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白的表達，用50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL濃度的ox-LDL培養細胞48 h后 GRP78、CHOP、Caspase-12表達均增加。詳見圖 1。
注：1為對照組，2為50μg/mL組，3為100μg/mL組，4為200 μg/mL組。
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圖1 各組細胞GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表達
3 討 論
細胞凋亡是動脈粥樣硬化病變的主要特征之一,其中巨噬細胞凋亡貫穿動脈粥樣硬化的整個過程。巨噬細胞泡沫化及其最終凋亡的過程中泡沫細胞聚集壞死形成脂核并使其不斷增大,導致臨件發生［5］。內質網是細胞內蛋白質折疊和鈣離子存儲的主要場所，對多種生理功能的完成具有重要意義。然而，細胞內外環境的改變導致內質網腔內氧化環境被破壞，鈣代謝紊亂，突變的蛋白質產生或蛋白質的二硫鍵不能形成，大量異常的蛋白質聚集在細胞內，內質網的穩態失衡，這種內質網功能紊亂狀態被稱為內質網應激［6］。 GRP78被認為是內質網穩態的中心調節劑，也被認為是內質網應激的標志，但是過強或時間過長的內質網應激可能會導致細胞死亡［7］。Caspase-12 激活是觸發內質網應激相關凋亡途徑的重要信號轉導通路。Caspase-12 以酶原形式存在于內質網膜胞漿側,在ERS 時被特異激活而誘導細胞凋亡［8］。CHOP也是觸發內質網應激相關凋亡途徑的重要信號轉導通路。CHOP 又稱生長停滯及DNA 損傷基因（Growth Arrestand DNA Damage Induciblegene 153,GADD 153）,存在于細胞漿內,在ERS 時被活化轉位至細胞核,通過下調Bcl-2 表達而促進細胞凋亡。 本實驗以不同濃度的ox-LDL與THP-1細胞共同培養不同時間,結果發現ox-LDL以時間和濃度依賴的方式誘導THP-1細胞的凋亡。ox-LDL濃度為100 μg/mL作用48 h最明顯。隨著時間的延長和濃度增加THP-1細胞凋亡呈遞增后遞減變化。內質網應激啟動的凋亡途徑是近年才發現的一種新的凋亡途徑，用ox-LDL培養人THP-1細胞并檢測Caspase12、CHOP、GRP78蛋白的變化來探討ox-LDL是否通過內質網應激途徑誘導細胞凋亡。結果發現100 μg/mL 的ox-LDL作用于細胞48 h后,GRP78、Caspase-12、CHOP的表達都明顯增加,提示ox-LDL可以通過內質網應激引發細胞凋亡。 不同于線粒體介導的凋亡途徑，ERS引起的細胞凋亡有一套自身的信號傳遞通路，稱為內質網相關性死亡（ER-associated death，ERAD）途徑，而且參與ERS 的分子伴侶和感受蛋白是ERS 特異誘導的，因此能夠作為治療相關疾病的有效靶點。
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作者簡介：張峰娟（1981―），女，醫師，現為山西醫科大學2008級研究生（郵編：030001）；邊云飛，工作于山西醫科大學第二醫院；劉金帥，工作于潞安集團總醫院。