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牛血清白蛋白范文1
【關鍵詞】熒光光譜法 可卡因 牛血清蛋白 相互作用
【Abstract】Objective To study the interaction of bovine serum albumin（BSA） with cocaine at different temperature and mechanisms underlying.Methods The quenching of fluorescence was determined by measuring fluorescence quenching spectra and synchronous fluorescence spectra of BSA interacted with cocaine.The type of binding foece was estimated according to the themodynamic equation.Results The fluorescence of BSA interacted with cocaine was quenched regularly .The values of binding constants（Ks）to be 1.38×103 L/mol （30℃），and6.19×103 L/mol （37℃），amounts of binding sites（1），and themodynamic parameters（ΔH： 167.44 KJ/mol，ΔS： 612.71J/mol?K ，ΔG： -18.21 KJ/mol（30℃）and-22.50（37℃））were obtained by analyzing and processing the fluorescence quenching data according to Stern-Volmer equation， Lineweaver-Burk equation and themodynamic equation，respectively.Conclusion It was shown that the fluorescence quenching process of BSA with Cocaine was attributed to static quenching. The force of the reaction was mainly due to hydrophobic action.
【Keywords】Fluoro-spectroscopy； Cocaine；Bovine serum albumin；Interaction
可卡因 （ cocaine） 化學名為苯甲酰甲基芽子堿 ，又稱古柯生物堿。導致其濫用的主要原因是其強烈的中樞神經系統興奮作用（ 欣） [1]?？煽ㄒ虻臑E用可導致機體多個系統、臟器的損傷[2]，嚴重者可誘發心律紊亂、全身抽搐、呼吸衰竭而致死。對于長期小劑量濫用所致的慢性中毒，主要是心理依賴性反應， 生理依賴很輕[3]。
血清白蛋白是人和動物血清中含量最豐富的一種蛋白質，與各種帶正電荷的物質及電中性物質均有一定程度的相互作用。各類藥物進入人體首先與血清白蛋白結合，通過血漿的存貯和運輸，到達受體部位產生藥理作用[4]。研究各種藥物與血清白蛋白的結合，來獲取藥物分子對蛋白質分子構象的影響以及藥物的藥理等有用信息，已經引起了生命科學、化學、藥學及臨床醫學科研工作者的普遍關注。目前研究生物大分子與藥物小分子相互作用的方法主要有熒光光譜法[5]、紫外光譜法[6]、圓二色譜法[7]、拉曼光譜法[8]、電化學法[9]和核磁共振法[10]等。
熒光光譜法是研究生物大分子與藥物小分子化合物之間相互作用很有效的方法，發射峰的位置、熒光偏振、能量轉移、熒光壽命等指標均可以對蛋白質中熒光發色團的結構及其所處的微環境提供有用的數據信息[11]。
本文采用熒光光譜法，在模擬生理條件下，定性研究可卡因與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用機理，分析其作用力類型，確定其結合常數和結合位點數，再通過同步熒光法確定可卡因對BSA構象的影響方式，進而分析可卡因對人體的作用和運轉代謝情況，獲得蛋白質分子的構象及其變化和可卡因的藥理效應等信息。
1實驗部分
1.1儀器與試劑
1.1.1儀器
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer型熒光分光光度計（Aglient Technologies）；FA1104N電子分析天平（上海恒平科學儀器有限公司）；HH-2數顯恒溫水浴鍋（上海葉拓儀表有限公司）。
1.1.2試劑
牛血清白蛋白（BR，國藥集團化學試劑有限公司）；鹽酸可卡因（BR，公安部物證鑒定中心）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（BR，國藥集團化學試劑有限公司）；鹽酸（HCl）（AR，上海久億化學試劑有限公司）；氯化鈉（NaCl）（AR，西隴化工股份有限公司）。
1.1.3溶液配置
牛血清白蛋白（BSA）標準儲備溶液：準確稱取純度大于99%的牛血清白蛋白0.335g于50ml容量瓶中，以pH =7.4的0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）-鹽酸緩沖液（其中含0.1mol/L NaCl維持離子強度）定容為50ml，濃度為1.0×10-4mol/L，低溫（≤4℃）保存于冰箱。
可卡因標準儲備溶液：用電子天平準確稱取4mg標準品于100ml的容量瓶中，以pH =7.4的 Tris-HCl緩沖液（其中含0.1mol/L NaCl維持離子強度）溶解并定容，濃度為40.0μg/mL，低溫（≤4℃）保存于冰箱。
實驗時所需濃度由Tris-HCl緩沖溶液（ pH =7.4，內含0.1mol/L NaCl維持離子強度）稀釋而得。所用試劑均為分析純，實驗用水為怡寶純凈水。
1.2實驗方法
于編號為 0-7的4mL離心管中分別加入2mL 1.0×10-4mol/L的BSA溶液， 使用移液槍分別加入的40mg/L 鹽酸可卡因工作液0、10、20、30、40、50、60、70 μL，充分搖勻，并分別在T=30℃和T=37℃的條件下恒溫水浴1h 。采用1cm石英比色皿，選擇激發波長為292.03 nm ，狹縫寬度均為5nm ，光電管負高壓為400V，掃描速率1200nm/min，掃描并繪制300-500 nm 的熒光光譜，以及固定熒光激發與發射的波長差λ=15nm和λ=60nm的同步熒光光譜。
2結果與討論
2.1 熒光猝滅光譜
按照實驗方法分別測定了30℃、37℃ 溫度下不同濃度的可卡因對牛血清白蛋白的熒光猝滅光譜，30℃ 時的猝滅光譜見圖1。由圖1可知，隨著可卡因濃度的逐漸增加，牛血清白蛋白的熒光特征峰逐漸降低。這是由于BSA中存在的色氨酸和酪氨酸，使其具有內源熒光[12]，當固定BSA的量而不斷增加可卡因的濃度時，可卡因與BSA之間的相互作用導致BSA內源熒光強度有規律性的猝滅。
2.2 熒光猝滅機理及猝滅常數的測定
引起BSA熒光猝滅的原因可能有動態猝滅和靜態猝滅兩種。動態猝滅過程遵循 Stern-Volmer 方程[13]：
F0/F = 1 + Ksv[Q] = 1 + Kqτ0[ Q ] （1）
式中，F0和F表示不存在和存在猝滅劑時熒光物質的熒光強度，[Q]為猝滅劑的濃度， Ksv為動態猝滅常數（又稱為 Stern-Volmer 猝滅常數）， Kq 是由擴散過程控制的雙分子動態猝滅速率常數。τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命，生物大分子熒光壽命約為10-8s[14]。
靜態猝滅過程遵循下式：
F0/F = 1 + Ks[Q] （2）
式中，Ks是靜態猝滅常數（即配合物的締合常數）。隨溫度升高動態猝滅常數增大，而靜態猝滅常數減小，可由此判斷熒光猝滅類型。
以F0/F對相應的[Q]作圖，得到可卡因對BSA之間猝滅的 Stern-Volmer 曲線，繼而得到不同溫度下可卡因對BSA熒光猝滅的 Stern-Volmer 方程。由 Stern-Volmer 方程得到在30℃和37℃時 Ksv分別為：Ksv30 =2.1162×104 ； Ksv37 =1.3099×104 。
由于生物大分子的熒光壽命約為10-8s，由方程：
Ksv = Kqτ0 （3）
可以得到不同溫度下的可卡因和BSA之間猝滅過程的速率常數 Kq數量級均為1012。Kq大于各類猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅速率常數2.0×1010 L/mol？S[15]，所以加入可卡因導致BSA熒光猝滅不是由動態碰撞引起的，可以初步判斷猝滅過程是以靜態猝滅為主，而隨溫度升高，Stern-Volmer 方程的斜率（即動態猝滅常數）逐漸減小，進一步表明猝滅過程是以靜態猝滅為主。
2.3 結合常數及結合點數的測定
當小分子與大分子結合時，其表觀結合常數K與結合位點數n可由下式求得[16]：
K + n （4）
式中：K為結合常數；n為結合點數。
對30℃和37℃時的lg[（Fo-F）/F]-1-lg[Q]-1作雙對數圖，如圖3。
根據截距和斜率求得不同溫度下的結合常數K和結合點數n（見表1）。由表可知在實驗條件下結合位點數n接近1，說明鹽酸可卡因與BSA可形成1個結合點數。而在30℃和37℃時的K值處于同一數量級，則更加印證了可卡因對BSA的猝滅方式為靜態猝滅。
2.4 BSA與可卡因結合反應的熱力學參數和作用力的確定
分子間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等4種。當溫度變化不大時，反應的焓變ΔH可認為是常數。根據反應前后的熱力學參數焓變H和熵變S的相對大小， 可以確定分子間的相互作用力類型： 當H0時為疏水作用力[5]。由熱力學公式： （5） （6） （7）
結合K，分別計算出不同溫度時可卡因與BSA作用的自由能變ΔG、焓變ΔH和熵變ΔS（結果見表2），可得30℃，37℃時的可卡因和BSA的熱力學參數ΔH均為167.44KJ/mol，自由能變（ΔG）分別為-18.21，-22.50KJ/mol，ΔS均為612.71J/mol?K。
根據Ross等總結出的判斷生物大分子與小分子結合力性質和生物大分子自身結合力性質的熱力學規律[17]，推斷出可卡因與BSA之間的作用力以疏水作用力為主。
2.5 同步熒光光譜
對于蛋白質的同光熒光光譜，λ=15nm時僅表現為酪氨酸殘基的熒光，λ=60nm時則顯示色氨酸殘基的熒光。因芳香族氨基酸殘基的最大發射波長與所處環境極性有關，若其最大發射波長改變，說明殘基所處的微環境發生了改變，由發射波長的改變可判斷BSA中芳香氨基酸殘基所處微環境的變化[12]。
由λ為15nm和60nm的同步熒光光譜（如圖4）可知，酪氨酸殘基和色氨酸殘基的特征熒光光譜峰均隨可卡因濃度的增加而產生猝滅，但對酪氨酸和色氨酸特征峰的位置影響不大，表明可卡因對牛血清蛋白構象的改變不大[18]。相比之下，色氨酸殘基熒光猝滅程度比酪氨酸殘基更顯著，表明結合位點更接近于色氨酸殘基。
在可卡因與牛血清白蛋白相互作用的過程中，隨可卡因濃度升高，牛血清白蛋白的熒光強度呈有規律下降。在可卡因對牛血清白蛋白的熒光猝滅過程中，隨溫度升高，猝滅常數降低，猝滅方式為靜態猝滅。兩者以物質的量比1：1結合，作用力類型為疏水作用力；同步熒光掃描結果顯示，可卡因對牛血清白蛋白的構象影響不大，兩者的結合點可能位于色氨酸上。
3 結語
本文采用熒光光譜法研究可卡因與牛血清白蛋白之間的相互作用。結果表明：可卡因對BSA的熒光猝滅為靜態猝滅，兩者相互作用的結合常數K分別為1.38×103 L/mol （30℃）和6.19×103 L/mol （37℃）、結合位點數n為1、熱力學參數ΔH、ΔS、ΔG分別為167.44KJ/mol、612.71J/mol?K、-18.21 KJ/mol（30℃）和-22.50 KJ/mol（37℃）。根據分子間相互作用力和熱力學參數間的關系，可推斷兩者的相互作用力主要是疏水作用力。從同步熒光光譜法可知：由于兩者之間的反應，BSA的熒光強度顯著降低，并推測可卡因和BSA的結合點位于色氨酸殘基上。
參考文獻：
[1]孫文平，盧延旭.可卡因毒理學研究進展[J].中國藥理學通報，Chinese Pharmacological Bulletin， 2004，20（11）：1212-1214.
[2]夏瑞，馬紅霞.可卡因毒性研究.文章編號：1003-8507（2007）11-2091-03中圖分類號：R996文獻標識碼： c.
[3]Kramer LD，Locke GE，Ogunyemi A，et al.CocaineCrelated seizures in adults[J].Am J Drug Alcohol Abuse，1990，16：307-317.
[4]胡艷軍，劉義，侯安新.稀土雜多酸鹽EuHSiMo10W2O40 ？ 25H2O與BSA相互作用的研究[J].化學學報，2004，62（16）：1519-1523.
[5]梁彥秋，臧樹良，趙雪.頭孢他啶與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用[J].光譜實驗室.2009，26（6）：1638-1642.
[6]崔艷，陳建秋，嚴拯宇.鹽酸土霉素與牛血清白蛋白的相互作用研究[J].光譜實驗室，2010，27（3）：1064-1069.
[7]閆淑蓮，樊媛潔，葉玲，等.咪唑斯汀與牛血清白蛋白的作用研究[J].首都醫科大學學報，2008，29（3）：305-307.
[8]陶清，韓莉，徐金光 等.諾氟沙星與牛血清白蛋白相互作用的拉曼光譜研[J].河南科學，2007，25（3）：391-394.
[9]曹福悅，任鳳蓮，宋鴿 等.秋水仙堿與牛血清白蛋白相互作用的電化學研究[J].分析化學室，2012，31（6）：92-95.
[10]吳麗敏，張美玲，婁依依 等.小檗堿與牛血清白蛋白相互作用的核磁共振研究[J].分析化學，2011，39（8）：1223-1227.
[11]徐麗繁，王瑞玲，黃振鐘 等.4-（4-三氟甲基）苯基-2，6-二（4-氨基苯基）吡啶與BSA相互作用的研究[J].分析試驗室，2013，32（7）：20-25.
[12]尚永輝，李華，孫家娟.熒光光譜法研究木犀草素、芹菜素或葛根素與牛血清白蛋白的相互作用機理[J].理化檢驗-化學分冊，2009，47（2）：186-190.
[13]YANG Manman，XI Xiaoli，YANG parison of Reasonableless of the Fluorescence Quenchrng and Enhancement Equations at Different Temperatures[J].Acta Chim Sin，2006，64（14）：1437-1445（in Chinese）.
[14]Lakow icz J R，W eberG. Quenchig of Proterin Fluorescence by Oxygen Detection of Structural Fluctuations in Proteins on the N anosecond Time Scale[J]. Biochemistry，1973，12（21）：4171-4179.
[15]孫麗莉，陳寧生，夏雪文.噻嗪酮與牛血清白蛋白相互作用的光譜法研究[J].分析科學學報，2011，27（2）：223-226.
[16]劉永春，胡之德.藥物與蛋白質相互作用的熒光光譜法研究概述[J].寶雞文理學院學報（自然科學版），2005，25（1）：42-49.
牛血清白蛋白范文2
1結果與分析
1.1BSA與AP-AuNPs的物理吸附結果電泳檢測蛋白質可以通過物理作用吸附在納米顆粒表面。從圖1可以看出，從左至右，隨著BSA濃度的增加，BSA與AP-AuNPs的吸附量也隨之增多。通過與純的AP-AuNPs相比較我們認為，圖中與AP-AuNPs在同一水平位置的條帶為沒有吸附上BSA的AP-AuNPs，圖中微滯后的條帶為吸附上一條BSA的AP-AuNPs。選取吸附1個BSA的樣品進行分析。
1.2蛋白酶K酶切AuNPs-BSA的電泳檢測結果本文中選取蛋白酶K(proteinaseK,ProK)對吸附在AP-AuNPs表面的BSA進行酶切。與AP-AuN-Ps-BSA相對比，隨著ProK濃度的增加，AP-AuNPs-BSA的遷移率逐漸的增大，但最終還是小于AP-Au-NPs的遷移率，說明吸附結合在AP-AuNPs表面的BS段隨著ProK濃度的增加而減少，但是還是有部分BSA的片段吸附在AP-AuNPs的表面，沒有受到ProK的酶切(圖2)。
1.3SDS洗脫及吸附在AP-AuNPs表面肽段的PAGE膠鑒定十二烷基硫酸鈉(SDS)是一種陰離子表面活性劑。用10%的SDS對AP-AuNPs-BSA(酶)進行處理。通過2%的瓊脂糖凝膠電泳我們看出，10%的SDS可以將吸附在AP-AuNPs表面的蛋白片段洗脫下來(圖3A)。然后將洗脫后的樣品進行SDS-丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳，來對洗脫下來的蛋白多肽片段進行鑒定。從圖3B中我們可以看出，經過SDS洗脫的后的樣品中，在分子量約26kD處，有一條帶出現，經與其它的樣品比較，我們認為，該條帶則為吸附在AP-AuNPs表面的BS段。
2討論
本實驗選取BSA與AP-AuNPs通過簡單的物理吸附作用結合在一起，通過瓊脂糖凝膠電泳結果可以看出，BSA可以穩定地吸附在AP-AuNPs的表面。在經過蛋白酶K酶切的電泳結果可以推測，BSA穩定的吸附在AP-AuNPs的表面是BSA中的一段氨基酸序列吸附在AP-AuNPs的表面所導致的。在經過SDS洗脫及SDS-PAGE電泳結果證明，BSA與AP-AuNPs是通過BSA的一段固定的多肽序列結合在AP-AuNPs所到導致的。該實驗結果的發現，對于功能化的納米顆粒在生物體內高效、穩定的應用奠定了堅實的基礎。
3材料與方法
3.1AP合成AP合成的方法參照文獻(Zhangetal.,2011)。簡要概述：稱取3.084g(15mmol/L)的聚異丁烯馬來酸酐置于500mL的圓底燒瓶中，2.7g(15mmol/L)的十二胺干粉溶于100mL的四氫呋喃后與聚異丁烯馬來酸酐混合，超聲，使得溶液完全澄清。將混合液55~60℃加熱、攪拌1h。用旋轉蒸發儀將溶液濃縮到30~40mL后攪拌、過夜。次日，將溶液完全抽干，加入40mL的氯仿重新溶解。最終得到單元結構濃度(Cmononier)為0.5mol/L的兩性聚合物。
3.2有機相AuNPs的合成合成方法參照文獻(Linetal.,2008)。簡要描述：稱取2.17g四辛基溴化銨溶于80mL的甲苯中。稱取300mg氯金酸溶于25mL的超純水中。將兩者混合至分液漏斗中，輕微震蕩后棄水相，將有機相轉移到圓底燒瓶中。稱取334mg硼氫化鈉溶于25mL的超純水中，并迅速的加入到有機相中，攪拌60min后轉移到250mL的分液漏斗中，分別加入NaCl、NaOH洗滌3次，棄水相后在轉移到250mL的圓底燒瓶中，磁力攪拌，過夜。加入10mL十二烷硫醇，65℃水浴加熱，攪拌3h。分裝在40mL的小瓶中，2000r/min離心5min，收集上清。加入等體積的甲醇，2000r/min離心5min，棄上清，晾干，加入氯仿重新溶解。
3.3AP包裹AuNPs包裹的方法參照文獻(Zhangetal.,2011)。簡要概述：根據每個AuNP的有效表面積每平方納米含有200個polymer單元結構比例混合。每個AuNP的有效表面積的計算方法為：Aeff=4•仔•(deff•2-1)2，其中的deff為油相納米金顆粒的有效動力學直徑。由于AuNP和polymer的體積小，密度大，使得它們在溶液中分布比較密集。由于氯仿揮發的太快，在進行真空抽氣時不能夠將polymer均勻的包裹在AuNP表面。在進行包裹時，先加入少量的氯仿有利于將polymer均勻的包裹在AuNP表面，真空抽氣直到將氯仿全部抽干。加入適量的SB12緩沖液進行攪拌，直到混合物完全溶解且澄清。這樣就將油相的AuNP轉移至水相中(AP-AuNP)。
3.4BSA與AP-AuNPs的物理吸附實驗取PCR管分別編號1~10，按表1中比例加入AP-AuNPs與BSA混勻，反應體系為30滋L，不足由超純水補齊。室溫下反應30min。
牛血清白蛋白范文3
[關鍵詞] BrdU；免疫組織化學染色；胰酶抑制劑；牛血清白蛋白；漂片法
[中圖分類號] R392-33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2012）02（b）-0016-03
Improvement in technique of BrdU immunohistochemical staining by bleach section
GUO Jingjing1 SHAN Lidong2 WU Gang3
1.Department of General Surgery, Huashan Hospital Baoshan Branch of Fudan University, Shanghai 200431, China;
2.Department of Neurobiology and Medical Psychology, School of Preclinical Medicine and Biological Sciences,Medical School of Suzhou University, Jiangsu Province, Suzhou 215123, China;3.Department of General Surgery, Huashan Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 200040, China
[Abstract] Objective To reduce the tissue slice breakage, explore the technique of 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) immunohistochemical staining by blocking buffer in bleach section. Methods BrdU, which was detected by ABC immunohistochemistry on bleach section of brain slides, was used to incorporate the new born cells which were promoted proliferation by motor-driven wheel running. The different blocking effects of Goat serum, trypsin inhibitor and bovine serum albumin were compared in the process of immunohistochemistry. Results In the group of motor-driven wheel running in the dentate gyrus of the hippocampus in rats, the number of BrdU-positive cells was more than the control group. The breaking rate of slides was reduced obviously, especially in the groups with bovine serum albumin and trypsin inhibitor, after being added different blocking reagents. But cells in trypsin inhibitor group were appeared without specific staining. Conclusion Bovine serum albumin is preferable blocking buffer.
[Key words] BrdU; Immunohistochemical staining; Trypsin inhibitor; Bovine serum albumin; Bleach section
5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU）是胸腺嘧啶核苷的類似物，在細胞周期的S期摻入到增殖或分裂細胞的核內，只要細胞不消亡，BrdU 將永久地存留在胞核DNA 中，且在體或離體都能通過免疫組織化學的方法檢測到，可用于標記BrdU暴露期間進行DNA合成的細胞[1]。故BrdU陽性細胞可被看作是具有增殖活性的細胞。
1 材料與方法
1.1 材料
動物：SD大鼠，雌雄不拘，體重220~230 g，蘇州大學實驗動物中心提供。試劑：BrdU（ Roche Diagnostic Co.）。
1.2 分組
踏轉輪運動對成年大鼠海馬齒狀回細胞增殖的影響。實驗分兩組，①踏轉輪運動組：轉輪速度為10 m/min，每天訓練2次（09:00，15:00），每次訓練30 min，連續6 d；②對照組：動物置于轉輪中，速度為0。放置次數與時間同運動組。在染色過程中每一組又分為三個亞組，分別為加入羊血清組、胰酶抑制劑組和牛血清白蛋白組。
1.3 BrdU標記
踏轉輪運動的第4天開始給藥，于每次運動前1 h腹腔注射BrdU（50 mg/kg，美國ROCHE公司），2次/d，連續3 d。末次給藥后24 h處死動物，從前囟后3.3~5.1 mm作連續冰凍切片，進行BrdU染色。
1.4 BrdU免疫組織化學
切片經2 mol/L HCl（室溫30 min）變性， 用0.01 mol/L PBS 充分漂洗后轉入0.1%胰酶中（37℃ 15 min）消化后，0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），分別加入羊血清組、胰酶抑制劑組和牛血清白蛋白組，室溫下30 min, 然后加入小鼠抗BrdU單克隆抗體（1∶200，Biosource）室溫孵育16 h，0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），轉入羊抗小鼠二抗（1∶200，Vector）室溫孵育2 h，再用0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），移入親和素生物素試劑（avidin-biotin complex，ABC，1∶200）室溫孵育2 h，最后用含0.03% H2O2的0.05% DAB顯色3~5 min， 0.01 mol/L PBS終止顯色。常規脫水、透明、封片。鏡檢BrdU陽性細胞計數。
1.5 統計學方法
隨機選取每只大鼠位置相同的5張不連續切片，光學顯微鏡下（×200）計數每張切片雙側海馬齒狀回顆粒細胞層（granular cell layer，GCL）免疫反應陽性細胞數。陽性細胞的均數作為統計數據，以均數±標準差（x±s）表示。用SPSS 10.0軟件作方差分析（one-way ANOVA）檢測組間差異性。
2 結果
2.1 踏轉輪運動對成年大鼠齒狀回細胞增殖的作用
經過6 d的踏轉輪運動訓練后，各組BrdU陽性細胞見圖1。免疫組織化學結果顯示，海馬齒狀回BrdU陽性細胞數，對照組為（22.55±1.91）個/切片，踏轉輪組為（57.89±1.90）個/切片，兩組相比差異有高度統計學意義（P < 0.001）。由此可見，踏轉輪運動可增加BrdU陽性細胞，促進齒狀回細胞增殖。
a、a′為對照組， b、b′ 為踏轉輪組。a、b分別是a′、b′的高倍視野
圖1 踏轉輪運動6 d后海馬齒狀回BrdU陽性細胞數
2.2 不同的封閉液對組織片染色效果的影響
末次給藥后24 h處死動物，從前囟后3.3~5.1 mm作連續冰凍切片，將切片隨機分成三組。在染色過程中，這三組分別加入羊血清、胰酶抑制劑和牛血清白蛋白作為封閉液和終止胰酶作用的抑制劑。各組BrdU陽性細胞如圖2所示。免疫組織化學結果顯示，三種方法均能使BrdU著色，但各組的本底顏色和非特異性著色程度不同：羊血清組中雖然陽性細胞與非特異性著色細胞有明顯區別，但非特異性著色細胞顯色度較深，且遍布整個視野。胰酶抑制劑組陽性細胞與非特異性著色細胞也有明顯差異，而且非特異性著色細胞顯色度較淺，整個本底相對較為干凈、清爽。牛血清白蛋白組幾乎見不到非特異性著色細胞，本底顏色非常淡。
除了本底顏色和非特異著色的觀察外，筆者還重點觀察了組織切片的破損情況。實驗結果顯示：牛血清白蛋白和胰酶抑制劑組無切片破損，而羊血清組有少部分腦片破損。細胞計數顯示：羊血清組為（23.22±2.38）個/切片，胰酶抑制劑組為（22.54±2.12）個/切片，牛血清白蛋白組為（23.14±3.12）個/切片，各組間差異無統計學意義（P > 0.05）。
3 討論
自從20世紀末神經干細胞發現以來，其目前已經成為神經科學研究的熱點之一。而研究在體或移植后的神經干細胞的增殖、遷移、分化中常用的標記新生細胞的方法有BrdU、3H、Ki-67、 PCNA（proliferating cell nuclear antige）[2-3]，前兩者在細胞增殖時整合入細胞以后，即使在細胞靜止期仍能表達；后兩者是細胞增殖過程中表達的內源性蛋白，當細胞處于靜止期時，它們并不表達。因此，BrdU和3H是常用的追蹤細胞的標記物，而BrdU的檢測又較3H更為方便、簡單，所以BrdU是最為常用的標記細胞增殖的標記物。
豐富環境對神經發生有影響，而在各種環境因素中，運動對其影響較為顯著[4-5]。本課題的前期研究建立了踏轉輪運動的模型[6]，并發現運動對神經發生的作用具有強度依賴性，這早于國內外的相關報道[7-8] 。故本課題選用運動作為促進細胞增殖的方法，觀察了不同的染色方法對切片及結果的影響。
組織切片BrdU染色時，常用的方法有貼片法和漂片法。漂片法與貼片法相比有一定的優點：前者能使抗體從兩側滲透，更有利于抗體與抗原充分反應，相應的在洗片時，也能使未結合的抗體充分漂洗干凈；漂片法比貼片法所使用的抗體數量少，而且必要時抗體還可以回收，重復利用。標本量大時，漂片法比貼片法更省時、省力。但是，用漂片法進行BrdU染色時，由于在加入抗體前要用鹽酸和胰酶對腦片進行預處理，經過處理（尤其是胰酶處理）后，進行染色的腦片極易破損，從而導致整個染色過程無法正常完成，或最終所得到的腦片極少。因此，在本實驗中針對胰酶的消化作用，筆者分別選用了與二抗同源的羊血清、牛血清的主要成分白蛋白（牛血清白蛋白）及胰酶抑制劑來抑制（或終止）胰酶的消化作用。
羊血清是免疫組織化學中常用的封閉液，但是，在本實驗中并未取得預期的成果，雖然羊血清能終止胰酶的消化作用，但并未能有效地封閉非特異性染色。其原因目前仍不清楚，有待進一步研究。胰酶抑制劑（取自火雞蛋清）組和牛血清白蛋白組非特異性染色較少，尤其是牛血清白蛋白組。其原因可能是二者的成分單一，純度較高。
[參考文獻]
[1] Brent AR，Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of themammalian central nervous system [J]. Science，1992，255（5052）：1707-1710.
[2] Cameron HA，Mckay RD. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus[J]. J Comp Neurol，2001，435（4）：406-417.
[3] Kee N，Sivalingam S，Boonstra R，et al. The utility of Ki-67 and BrdU as proliferative markers ofneurogenesis [J]. J Neurosci Methods，2002，115：97-105.
[4] Praag van H，Kempermann G，Gage FH. Running increases cell proliferation and neurogenesis in themouse dentate gyrus[J]. Nat Neurosci，1999，2（3）：266-270.
[5] Zhao C，Deng W，Gage FH. Mechanisms and functional implications ofneurogenesis [J]. Cell，2008，132（4）：645-660.
[6] Xu WP，Shan LD，Gong S，et al. Forced running enhances neurogenesis in the hippocampal dentate gyrus ofrats and improves learning ability [J]. Acta Physiologica，2006，58（5）：415-420.
[7] Kronenberg G，Bick-Sander A，Bunk E，et al. Physical exercise prevents age-related decline in precursor cell activity in the mouse dentate gyrus [J]. Neurobiol Aging，2006，27（10）：1505-1513.
牛血清白蛋白范文4
【關鍵詞】 腦梗死 腦卒中 小牛血清去蛋白注射液
腦梗死作為臨床常見的突發病，目前尚無有效的治療方法，其發病率和致殘率極高，嚴重威脅著人們的健康，小牛血清去蛋白注射液對腦細胞缺血缺氧具有保護作用，其主要成分為磷酸肌醇寡糖和小分子激活肽［1］，其通過增強腦代謝儲備力，延長細胞生存時間，可以持續多靶點抑制缺血瀑布的啟動和運行，并能抑制缺血再灌注損傷，同時能夠促進神經細胞的修復。本文對我院2006年10月-2007年11月應用小牛血清去蛋白注射液治療腦梗死進行了觀察，旨在探討小牛血清去蛋白注射液治療腦梗死患者的療效及對患者運動功能和日常生活能力康復的影響。
1 資料與方法
1.1 病例入選標準
(1)發病1周內的頸內運動系統腦梗死患者，診斷符合全國第四屆腦血管疾病會議通過的診斷標準［2］，均經螺旋CT或核磁共振檢查證實，肌力4級以下(包括4級)，FMA(Fugl-Meyer Assessment)的上下肢運動功能評分總分≤50分；(2)年齡在30歲以上，首次發病或過去發病未留下神經功能缺損者；(3)無嚴重并發癥及嚴重認知功能障礙和智力障礙者。
1.2 分組與治療
符合入選條件的入院病例共74例，按入院日期分為研究組和對照組，其中研究組38例，對照組36例。兩組患者治療前基礎情況相似，具有可比性；兩組病人均給以抗凝、降血壓、溶栓等基礎治療，研究組在基礎治療上加用小牛血清去蛋白注射液20mL溶于生理鹽水250mL中靜脈滴注，1次/日，2周為1個療程。對照組加腦蛋白水解物20mL溶于生理鹽水250mL中，1次/日，2周為1個療程。如出現消化道癥狀及顱高壓等嚴重并發癥時可對癥治療，有高血壓、冠心病、糖尿病者可繼續服用相應的藥物。
1.3 療效評定
采用1995年全國第四屆腦血管病會議制定的評定方法［2］；(2)臨床神經功能缺損程度評分(Mess)：采用1995年第四屆全國腦血管病學會議制定的腦卒中患者臨床神經功能缺損程度評分草案及治療判斷標準［2］進行評定；(3)偏癱的運動功能評定采用Fugl-Meyer運動功能(FMA)評分法［3］：上肢FMA最高分為66分，下肢FMA為34分，上下肢運動總分為100分。
1.4 統計學方法
數據以(±s)表示，采用χ2檢驗。
2 結果
2.1 兩組患者的療效比較(表1)
研究組治療有效率高于對照組(χ2=5.01，P＜0.05)。
表1 兩組患者的療效比較（略）
與對照組比較χ2=5.01，P＜0.05
2.2 兩組患者治療前后神經功能缺損程度評分比較(表2)
神經功能缺損程度評分研究組和對照組患者治療后均低于治療前，對照組又明顯低于治療組(P＜0.05或0.01)。
表2 兩組治療前后神經功能缺損程度評分比較（略）
與治療前比較 P＜0.01，兩組比較*P＜0.05
2.3 兩組患者治療前后FMA評分的比較 (表3)
研究組患者治療后上下肢FMA評分均高于治療前(P＜0.01或0.05)，對照組治療后上肢FMA評分高于治療前(P＜0.01)。
表3 兩組治療前后FMA評分比較（略）
與治療前相比P＜0.01；兩組比較*P＜0.05
2.4 不良事件和副反應
兩組在治療過程中均未發現不良事件和副反應。治療前后患者的肝腎功能及血尿常規無明顯變化，心電圖亦無明顯的改變。
3 討論
腦梗死是臨床常見病，其發病率和致殘率極高，嚴重威脅著人們的健康。腦卒中后如何促進中樞神經系統(CNS)功能恢復一直是人類研究的課題，PET和MRI的出現，使大腦和脊髓的可塑性和功能重組得到了客觀的證據，證明了神經元的內在發育特性和內部微環境是主要的內因，而外部環境的豐富，中樞神經刺激和藥物是主要的外因［4］。
小牛血清去蛋白注射液主要成分為磷酸肌醇寡糖(IPOS)和小分子激活肽。藥理研究表明：小分子激活肽是神經細胞蛋白質合成的主要成分，通過激活細胞代謝S6激活酶的活性，促進缺氧狀態下神經細胞的修復和再生［5］。另外一個主要成分磷酸肌醇寡糖能夠激活葡萄糖載體，能促進葡萄糖向細胞內轉運，并且通過特殊的IPOS載體使得IPOS也可以進入細胞內，從而糾正能量代謝障礙；可以增加線粒體的呼吸能力和高能磷酸的合成而促進細胞對氧的利用，從而促進能量物質ATP的生成。它能使神經細胞由糖酵解的代謝途徑轉變為糖有氧氧化的途徑，糾正缺血神經細胞的酸中毒，增強腦代謝的儲備能力，延長細胞的生存時間。
小牛血清去蛋白注射液能夠減輕腦缺血后再灌注損傷。通過抑制一氧化氮合成酶(eNOS)的活性，從而降低NO的過多形成，進而延遲腦缺血后的細胞毒性水腫，延緩腦缺血損傷的進程［6］。基礎試驗表明，小牛血清去蛋白注射液能夠顯著減少大腦皮層含水量，同時，使氧自由基破壞反應的產物丙二醛顯著減少［7］，說明小牛血清去蛋白注射液能夠減少氧自由基的生成。
本研究結果顯示，應用小牛血清去蛋白注射液治療腦梗死療效確切，其總有效率為92.11%，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。我們在研究中還發現小牛血清去蛋白注射液能夠改善腦梗死患者的日常生活能力，提高生活質量，降低患者的致殘率，并且能促進腦梗死后神經功能的恢復，對腦梗死的康復具有增強作用，在治療過程中無不良反應，不失為腦卒中后神經功能恢復新的途徑。
參考文獻
［1］ 呂媛，權菊香.小牛血清去蛋白注射液對腦細胞缺血缺氧的保護作用及臨床應用［J］.中國臨床藥理學雜志，2006，22(2)：141-144.
［2］ 陳清棠.腦卒中患者臨床神經功能缺損程度評分標準(1995)附件一、附件二及附件三［J］.中華神經科學雜志，1996，29(6)：381-382.
［3］ 董秀蘭，馮雪梅，朱紅.應用Fugl-Meyer評價針刺治療腦卒中偏癱的臨床療效［J］.中國臨床康復，2003，7(19)：2711-2722.
［4］ 謝財忠，陳光，唐軍凱.急性腦卒中患者早期康復的臨床研究［J］.現代康復，2001，11(5)：72-73.
［5］ Fabbro D，Imber R，Huggel K，Baschong W.Growth-promoting effect of a protein-free hemodialysate used in situations of hypoxia and for tissue repair as measured via stimulation of S6-kinase［J］.Arzneimittelforschung，1992，42(7)：917-920.
牛血清白蛋白范文5
【關鍵詞】 中藥活性成分； 牛血清白蛋白； 甘草次酸； 藥物-藥物相互作用
Abstract：ObjectiveTo evaluate the influence of glycyrrhetinic acid (GA) on the binding of active ingredients of Chinese herbs with serum albumin. MethodsSpectroscopic method and capillary electrophoresis frontal analysis were utilized to determine the binding data. Stern-Volmer equation and Scatchard plot were used to process the data. ResultsBinding constant and sites etc of GA with BSA were got. Binding constants of active ingredients of Chinese herbs and influence of GA on the binding of them were aslo obtained. ConclusionThere are two kinds of binding sites (high and low) in BSA while binding with GA and the total binding sites are eight. The binding percentages of GA are up to 95% when the ratio of BSA to GA is 0.38. In the presence of GA， binding constants of active ingredients of Chinese herbs decrease up to 67%， which may exert an influence on their pharmacological action
Key words：Active ingredients of Chinese herbs; Bovine serum albumin; Glycyrrhetinic acid; Drug-drug interaction
近年來，中藥活性成分與血清白蛋白結合的研究已經出現熱潮，如，桑色素［1］， 巖白菜素［2］， 芒果苷［3］， 大黃素［4］等。然而絕大多數研究以獲得活性成分的結合特征為目的，只有極少數研究探討中藥活性成分相互之間對結合的影響。如中國藥科大學李萍研究小組最近對中藥湯劑的整體成分與血清白蛋白的結合進行了研究，發現當歸補血湯成分間對各自與BSA的結合有顯著影響［5］，在金銀花整體活性物質與牛血清白蛋白相互作用中，綠原酸等3種成分在整體成分與BSA結合時比單個成分與BSA結合程度低，而咖啡酸、蘆丁則相反［6］?？梢?，中藥活性成分與蛋白結合時相互之間確實存在協同效應。甘草是最常用的中藥之一，也是常用食品添加劑；甘草中甘草酸含量較大（3%～10%）［7～9］，是甘草中最具特色的活性成分之一；甘草酸在體內代謝后以甘草次酸的形式吸收進入血液。因此，本文研究了甘草次酸對中藥活性成分與血清蛋白結合的影響，嘗試從成分之間血漿蛋白結合的協同效應（藥物-藥物相互作用）探討甘草的配伍規律，同時對甘草及相關藥物的安全、合理用藥提供參考。
1 儀器與材料
1.1 儀器
F-4500型分子熒光分光光度計（Japan，Hitachi）；Tu-1800SPC型紫外-可見光分光光度計(北京普析公司)；1cm石英比色皿；微量注射器；微型旋渦混合器，精密天平（Germany，Sartorius），pHS-3酸度計。J-810圓二色分光光度計（Japan，Jasco）；彩陸毛細管電泳系統（北京，中科院化學所），配紫外檢測器和HW-001色譜工作站（中國，千譜軟件有限公司）；未涂層石英毛細管，52 cm ×50 μm i.d.，有效長度為44 cm（中國河北永年光學纖維公司）；超濾管，截留分子量15 000（PALL FILTER CO.， LTD， USA）；TGL－16型高速臺式離心機（湘儀）。
1.2 試劑
牛血清白蛋白（Roche），以水配成2.0×10-5 mol/L的儲備溶液，4 ℃保存備用；18β－甘草次酸（GA，≥97%，Fluka， product of Spain）；槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷、山萘酚、大黃酸、大黃素對照品，購自中國藥品與生物制品檢定所（中國北京）；甲基蓮心堿（由中南大學湘雅醫院藥劑科劉韶惠贈，HPLC純度大于98％）；中藥活性成分均以90%甲醇配成2.5×10-3 mol/L的溶液；pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液；Tris（淮安和元化工有限公司），氯化鈉二水磷酸二氫鈉（河南焦作），鹽酸（湖南師范大學化學試劑廠）。除已標明者外，試劑均為分析純；水為雙重蒸餾水。
2 方法
2.1 光譜實驗方法
2.1.1 熒光猝滅方法
在10 ml 容量瓶中依次加入2 ml 0.50 mol/L NaCl 溶液、2 ml pH 7.40 的Tris-HCl 緩沖溶液、2 ml BSA儲備溶液，以水定容為10 ml， 搖勻， 在一定溫度下靜置30 min。取該溶液1 ml于石英比色皿中，依次加入一定體積的中藥活性成分溶液（加入總量＜0.03 ml)，旋渦混勻。經指定溫度下恒溫放置3 min后，在280 nm的激發波長下，掃描290～420 nm熒光光譜。在相同條件下，測其紫外光譜。甘草次酸對中藥活性成分的影響是在蛋白中先加入GA，然后按照上述方法進行。在實驗條件下活性成分在290～450 nm范圍內吸收很小，熒光內濾作用可以忽略，故直接對數據進行處理，結果為3次平行實驗的平均值。
2.1.2 圓二色（CD）譜方法
光源系統用氮氣保護(流量為5 L/min)，樣品池的光徑為0.1 cm。測量參數：掃描速率100 nm/min。分辨率0.1 nm，響應時間1 s，累積次數3次，掃描波段為190～250 nm，BSA濃度為2×10-6 mol/L，實驗時向BSA中分別加入不同量的甘草次酸，混合均勻后測量，得到其CD譜。
2.2 毛細管電泳前沿分析（CE-FA）方法
CE運行緩沖是pH 7.40，67 mmol/L的磷酸鈉，由適量的二水磷酸二氫鈉溶解于水，然后在pH計上用2 mmol/L NaOH調節到指定的酸度，再經過0.45 μm濾膜過濾。BSA儲備液（200 mmol/L）是通過溶解適量的BSA粉末于運行緩沖中得到，并于4度冰箱保存。工作蛋白由儲備液用運行緩沖稀釋而得。藥物儲備液（2 mmol/L）由運行緩沖配制，內含30％（V/V）以下甲醇。藥物工作液由其儲備液通過運行緩沖稀釋而得，其中甲醇含量小于3％（V/V）。藥物的標準溶液也用于配制其校準曲線，游離濃度由校準曲線求得。所有測試溶液在應用前進行脫氣。
一系列BSA溶液中（20，30，35，40，45，50，55，60 μmol/L） ，加入等量的GA至 160 μmol/L，再加入緩沖至1 ml，渦旋混合30 s。然后在36℃水浴加熱孵化2 h，再于室溫下平衡2 h。若要進行超濾，則于室溫平衡后進行，即取適量平衡液于超濾管，然后16 000 r/min下進行分離，濾液由CE進行測定。試樣重復兩份，結果取平均值，毛細管電泳在室溫下進行。
新毛細管要做預處理，以1 mol/L HCl 沖洗30 min，水沖洗5 min，1 mol/L NaOH沖洗30 min，然后水沖洗5 min，磷酸鹽緩沖沖洗15 min。為了獲得較好的峰形和遷移時間的重現性，毛細管在每天實驗開始按照下列程序進行沖洗和平衡：水沖洗2 min，1 mol/L氫氧化鈉沖洗2 min，水沖洗2 min，緩沖沖洗5 min。
在每次測量之間，毛細管以水沖洗2 min，1 mol/L氫氧化鈉沖洗2 min，水沖洗2
min，再以緩沖沖洗2 min。在這樣的條件下，可以保證消除蛋白的吸附。平衡后的BSA-GA液或超濾液重力進樣60 s（毛細管進出口高度差為30 cm）。運行電壓為19 kV，常規極性運行，典型電流為85 mA，紫外檢測波長為254 nm。
3 結果
3.1 甘草次酸與BSA作用的研究
3.1.1 甘草次酸對BSA 的熒光猝滅光譜甘草次酸在與BSA 作用的過程中能顯著地猝滅BSA 的熒光，這種猝滅在GA加入便可迅速觀察到，這提示［10］BSA的一個高親和結合位點位于色氨酸殘基的附近。測得297 K甘草次酸對BSA的熒光猝滅光譜見圖1。在此過程中，GA/BSA=3時，最大發射峰由341 nm變為最終的337 nm，略有藍移，顯示色氨酸殘基所處環境的疏水性增加。并最終移至334 nm，在研究范圍內熒光強度下降87.6％，說明GA和BSA發生了結合作用，并使BSA的構象發生了變化。此外，可以觀察到色氨酸熒光下降幅度比酪氨酸大。見圖1。
3.1.2 熒光猝滅作用的Stern-Volmer分析見圖2。圖2是根據Stern-Volmer 猝滅方程（方程1）作圖，式中，F為有猝滅劑時BSA 的熒光強度， F0為無猝滅劑時BSA 的熒光強度， ［Q］為猝滅劑濃度，KSV 為動態猝滅常數，Kq 為動態熒光猝滅速率常數， 各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態熒光猝滅速率常數約為2.0×1010 L·mol-1·s-1［1］；τ0 為無猝滅劑時熒光分子的平均壽命。從圖2可見，在pH 7.40時，猝滅呈現兩種不同的模式，這表明，GA與BSA的有兩類不同的結合位點。由斜率求的前半段（［GA］/ ［BSA］≈3），得在297K，Kq=2.47×1013 L·mol-1·s-1， R=0.999 1；在292 K， Kq=2.26×1013 L·mol-1·s-1， R=0.997 5；在287 K， Kq=2.11×1013 L·mol-1·s-1， R=0.998 8。而GA與BSA濃度比大于3之后也有較好的線性，297 K時Kq為2.74×1012 L·mol-1·s-1。很顯然，由于由于各類猝滅劑對生物大分子最大擴散控制的碰撞猝滅常數為2.0×1010 L·mol-1·s-1，而由GA引起的BSA的猝滅速率常數遠遠大于此值，由此可見，GA對BSA的兩類猝滅不是動態而是靜態猝滅。
F0/F＝1＋KSV［Q］＝1＋Kqτ0［Q］ ①
3.1.3 結合常數假定小分子在生物大分子上有n個相同且獨立的結合位點，則小分子與生物大分子的結合平衡可以由方程②［11］ 表示。
lg(F0-F)/F) =lgK+nlg［Q］②
這里，K表示某類結合位點的結合常數；n表示一個BSA中某類結合位點能夠結合的小分子數目，即結合位點數；［Q］表示游離小分子濃度，在研究中通常以其總濃度代替。根據方程②，以低濃度的GA（GA/BSA＜3）進行試驗，求得GA的結合常數和結合位點數分別為：在297 K， K =8.28× 105 L·mol-1， n =1.12 (R=0.998 5) ；292 K ，K =1.60× 105 L·mol-1 n =1.04 (R=0.996 0)；在287 K， K =1.60× 105 L·mol-1， n=0.986 (R=0.998 1) 。
CE-FA測定的藥物-蛋白結合數據通過Scatchard作圖（方程③）進行處理，方程中，r是結合的藥物濃度于蛋白濃度的比率，Df是游離藥物濃度，K是結合常數，n是一個蛋白分子的結合位點數。藥物結合的百分數（PB）用方程④進行計算。
r/Df ＝－Kr＋nK
③
PB (℅) ＝100 (Dt－Df)/ Dt ④
圖3是GA與BSA結合的Scatchard作圖。圖中呈現兩類不同的線性，根據Scatchard方程，直線在X軸的截距即為結合的位點數，分別為3.0和5.3，所對應的高低親和位點的結合常數分別為6.70×105 L·mol-1和5.49×104 L·mol-1，該數值與熒光法的結果相近。160 μmol/L的GA在不同濃度的BSA中的結合率如表1所示。蛋白與藥物濃度之比為0.375時，結合率已高達95.2％，因此，可以預測，GA在體內是與血清蛋白高度結合的。表1 GA在不同濃度BSA中的結合百分數 （略）
3.1.4 甘草次酸與BSA結合的熱力學參數及作用力藥物小分子與生物大分子的作用力包括氫鍵，范德華力，靜電引力，疏水作用力等，藥物不同，與牛血清白蛋白作用力類型也不相同。當溫度變化不大的時候，反應的焓變可以視作常數，根據van't Hoff熱力學方程（方程⑤）可以計算出藥物小分子與生物大分子作用間的有關熱力學常數：G0=-RTlnK=H0-TS0; lnK=-H0/RT+S0/R ⑤
H0， G0， S0分別表示焓，自由能和熵的變化。根據方程②的結果，在pH 7.40，第一類結合位點的H0 = 117KJ/mol ，S0＝507 J/(K.mol)，H0>0 ，S0>0，可以推斷，GA與BSA的結合力在pH7.40是典型的疏水作用［12］
3.1.5 甘草次酸在BSA結合位點的確定血清白蛋白至少有三個特異的高親和藥物結合位點，分別稱為藥物結合的site Ⅰ～Ⅲ。血清白蛋白的重要結合位點位于site I 和siteⅡ，分別對應于ⅡA和ⅢA亞結構域。許多藥物對血清白蛋白的結合具有特異性，如苯基保泰松（PB）結合于site I，氯滅酸（FA）和布洛芬（IB）結合于siteⅢ，地高辛（digitoxin）結合于site Ⅲ，這些藥物可以用作位置探針（site-probe）。本試驗利用PB、FA和IB作為位置探針，研究GA與這些藥物的競爭結合情況。在與BSA等物質的量的PB、FA和IB存在下，利用方程進行計算，相應的結合常數K的數值分別為，1.72×105，R=0.999 6; 9.04×105，R=0.999 2；9.48×105， R=0.994 8。 考慮到在同樣條件下，無探針時結合常數K是8.28×105，顯然GA與BSA的結合受到PB的影響較大而幾乎不受FA和IB的影響。因此，可以推斷site I是GA的高親和結合位點之一。
3.1.6 甘草次酸與BSA結合距離GA的吸收光譜和BSA的發射光譜存在重疊。根據Fster［11］-偶極非輻射能量轉移理論。求重疊光譜的積分，J＝8.926×10-15 cm3·L·mol-1。用K2=2/3， N=1.36， Φ=0.15［1］，求得R0＝2.47 nm，而計算得能量轉移效率E＝0.514，最后可以得到GA到色氨酸殘基的距離r=2.45 nm。r和R0的數值均在理論的范圍內，轉移的距離r
3.1.7 圓二色譜研究甘草次酸對BSA構象的影響圖4是BSA在GA存在下的圓二色譜。由圖可見，BSA在210 nm和220 nm附近有明顯的負峰，GA加入使峰強度呈現減少的趨勢，GA濃度不大時，強度變化不大。根據文獻［11］計算方法，得不同GA濃度下BSA中α螺旋的比例的變化情況（表2），結果表明GA加入對BSA構象產生影響，α螺旋的比例下降。表2 GA存在下BSA (2 μmol/L) 中α螺旋的變化（略）
3.2 甘草次酸對中藥活性成分與BSA作用的影響用熒光猝滅法對槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷、山萘酚、大黃酸、大黃素、甲基蓮心堿與BSA的結合進行了研究，同時探討了甘草次酸對活性成分結合的影響。所選取的黃酮（苷）和大黃酸、大黃素等都能明顯地猝滅BSA的熒光，猝滅數據直接按照方程①、②、⑥行處理，結果（3次平行試驗）列于表3。從表可以看出，黃酮比相應的黃酮苷的結合要強，苷元的結合要比對應的苷的結合強。甘草次酸對黃酮苷的結合有很大的影響，結合常數下降54.6%～67.3%。甘草次酸的存在使山萘酚和槲皮素的結合常數有所下降，而對大黃酸、大黃素和甲基蓮心堿的結合常數影響較少。從結合常數看，黃酮苷一般在104，而其它幾種物質與GA都為105，可見中藥活性成分與GA結合常數的相對大小可能是影響甘草次酸能否對其結合產生影響的一個重要因素之一。故甘草次酸可能對其它中藥活性成分的藥理作用產生影響。表3 甘草次酸對中藥活性成分與BSA結合的影響（略）
(F0-F)-1=F0-1+K-1F0-1［Q］-1 ⑥
4 小結
利用多種光譜技術和毛細管電泳前沿分析方法對甘草次酸與BSA的結合進行了研究，獲得甘草次酸與BSA結合的結合常數、熱力學參數、作用力類型、位點數等參數，位置探針方法確定GA的結合位點，并通過能量轉移確定GA與色氨酸殘基的距離，同時以圓二色譜考察GA對BSA構象的影響。結果顯示光譜方法獲得的結合常數與毛細管電泳前沿分析方法的結果基本一致，但是兩種方法在確定位點數時差距較大。結果還表明甘草次酸對中藥活性成分與BSA的結合有較大影響，可能對其它中藥活性成分的藥理作用產生影響。
參考文獻
［1］Qi ZD， Zhang Y， Liao FL， et al. Probing the binding of morin to human serum albumin by optical spectroscopy［J］. J Pharm Biomed Anal，2008，46(4):699.
［2］Zhang Y， Dong L， Li Y， et al.Characterization of interaction between bergenin and human serum albumin in membrane mimetic environments［J］. J Fluoresc， 2008 ，18(3-4):661.
［3］Yue Y， Chen X， Qin J， et al. Characterization of the mangiferin-human serum albumin complex by spectroscopic and molecular modeling approaches［J］. J Pharm Biomed Anal. 2008，12（24） ［Epub ahead of print］.
［4］Sevilla P， Rivas JM， García-Blanco F，et al. Identification of the antitumoral drug emodin binding sites in bovine serum albumin by spectroscopic method［J］. Biochim Biophys Acta，2007，1774(11):1359.
［5］Wen XD， Qi LW， Chen J， et al. Analysis of interaction property of bioactive components in Danggui Buxue Decoction with protein by microdialysis coupled with HPLC-DAD-MS［J］. J Chromatogr B， Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007，852(1-2):598.
［6］Qian ZM， Wen XD， Li HJ，et al. Analysis of Interaction Property of Bioactive Components in Flos Lonicerae Japonicae with Protein by Microdialysis Coupled with HPLC-DAD-MS［J］. Biol. Pharm. Bull. 2008， 31(1) 126.
［7］潘學軍，劉會洲，曾家豫，等. 從甘草中提取甘草酸不同提取方法的比較［J］. 過程工程學報，2001，1（1）：102.
［8］王雪梅，高素蓮. 甘草中甘草酸粗品最佳提取條件研究［J］. 安徽大學學報（自然科學版），1999，23（1）：86.
［9］范云鴿，史作清，何炳林. 甘草酸、甘草次酸的提取分離及應用概況［J］. 天然產物研究與開發，1996，8（4）：93.
［10］Silva D， Cortez C M， Cunha-Bastos J， et al. Methyl parathion interaction with human and bovine serum albumin［J］. Toxicology Letters， 2004， 147:53.
牛血清白蛋白范文6
[關鍵詞] 類風濕因子； 膠乳凝集試驗； 臨床應用
[中圖分類號] R446.6 [文獻標識碼] B [文章編號] 1005-0515（2011）-12-345-01
類風濕因子(rheumatoid factor,RF)是在類風濕性關節炎病人血清中發現。是一種以變性IgG為靶抗原的自身抗體，無種屬特異性。主要存在于類風濕性關節炎患者的血清和關節液中，它是一種抗變性IgG的抗體，屬IgM型?？膳cIgGFc段結合。RF有IgG、IgA、IgM等多種Ig類型，以IgM類型多見。檢測RF對類風濕性關節炎(RA)的診斷、分型和療效觀察有著重要的意義。
RF是一種主要發生于類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)病人體內的抗人變性IgG自身抗體，可與IgG的Fc段結合。膠乳凝集試驗是將變性IgG包被于聚苯乙烯膠乳顆粒上，這種致敏膠乳在與待測血清中的RF相遇時，于一定時間內發生肉眼可見的凝集。
1 對象與材料
1.1 研究對象 1)體檢健康組：在本院體檢中心體檢健康者410例，其中：男性：180例，女性：230例，年齡 25-75 歲。2)類風濕性關節炎組：經臨床診斷為類風濕性關節炎的患者42例，其中：男性：9例，女性：33 例，年齡 29-76歲。
1.2 標本采集與保存 空腹采集靜脈血3ml，30min后離心分離血清，當日完成檢測，或置2-8℃保存，第2天完成檢測。
1.3 方法與試劑 手工操作法。類風濕因子(RF)測定試劑盒(膠乳凝集法)。
1.4 試劑主要成份 膠乳液成份：類風濕因子膠乳、牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液；陽性對照成份：羊抗人IgG抗血清、牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液；陰性對照成份：牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液。
1.5 測定原理 膠乳凝集試劑是由純化的人IgG和羧化聚苯乙烯膠乳共價交聯而成的抗原膠乳。RF膠乳超過20U/ml即出現肉眼可見的凝集顆粒。
2 實驗與結果
2.1 定性實驗 試劑自冰箱取出后恢復至室溫(18-25℃)；輕輕混勻膠乳試劑；核對陽性和陰性對照，在反應板孔中加一滴未稀釋血清(20ul)；然后加一滴膠乳試劑在血清中；攪勻、輕輕搖動使其充分混合，二分鐘后于直射光下觀察結果。每次試驗均設陽性與陰性對照。
2.2 半定量實驗 血清以生理鹽水(0.9g氯化鈉溶解于蒸餾水中，稀釋至100ml)倍比稀釋。見表1。
2.3 結果判定 定性實驗：2min出現肉眼可見凝集者為陽性(RF＞20U/ml)；無凝集出現者為陰性(RF＜20U/ml)。半定量試驗：1:2稀釋血清出現凝集者為40U/ml；1:4稀釋血清出現凝集者為80U/ml；1:8稀釋血清出現凝集者為160U/ml；1:16稀釋血清出現凝集者為320U/ml。
2.4 參考范圍 正常人血清RF＜20U/ml。
2.5 初步臨床應用 在健康體檢者的410例測定中，RF出現凝集(＞20U/ml)的19例占4.6%。已確定的42例類風濕性關節炎患者中，RF出現凝集(＞20U/ml)的38例占90.4%。
3 討論 膠乳凝集法主要是測定IgM類RF(IgG、IgA類RF極少)，據全國臨床檢驗操作規程報道：70%-90%的類風濕性關節炎(RA)患者的RF呈陽性。因此，RF測定是美國風濕病學會1987年類風濕性關節炎診斷標準之一。但是RF陰性也不能排除類風濕性關節炎(RA)診斷。除RA外，還有其他很多疾病RF亦可陽性，如干燥綜合征，混合性結締組織病，2型混合性冷球蛋白血癥，慢性活動性肝炎、亞急性細菌性心內膜炎，全身性紅斑狼瘡，多種細菌真菌、螺旋菌等，健康人群中約有5%的人RF陽性。
本研究結果說明，膠乳凝集法90.4%的類風濕性關節炎(RA)患者的RF呈陽性，健康人群中約有4.6%的人RF陽性。此結果與全國臨床檢驗操作規程報道的結論相符。此方法可定量或半定量，靈敏度高，血清用量少、操作簡單、便于在基層醫院推廣使用。
參考文獻
[1] 呂繩凱等.抗鏈球菌溶血素“O”膠乳試驗快速試劑的研究[J].上海醫學檢驗雜志,1989,4(2):97.