前言：中文期刊網精心挑選了細胞核范文供你參考和學習，希望我們的參考范文能激發你的文章創作靈感，歡迎閱讀。
細胞核范文1
1．知識目標
①概述細胞核的結構和功能。
②能夠區別原核細胞和真核細胞。
③描述染色質組成以及與染色體的關系。
2．能力目標
①通過資料分析，提高實驗設計的能力。
②嘗試制作真核細胞的三位結構模型。
3．情感目標
①認同細胞核是細胞生命系統的控制中心
②確立生物體結構與功能相統一的辯證觀點。
③在合作探究與交流中體驗學習的樂趣。
【教學方法與策略】
1.探究式教學
利用多媒體課件展示克隆羊培育過程；傘藻實驗和變形蟲實驗，實驗展示過程中步步設疑，層層深入，啟發學生帶著問題去思考、去觀察，讓學生自己在探究過程中通過分析得出結論，掌握細胞核的功能。
2.導學案教學
精心設計編寫導學案，通過導學案，激發學生的探究興趣，提高學生自主學習的能力。
【學情分析】
經過初中階段的學習，學生對細胞的基本結構有了一定的認識，有了“細胞核控制生物的遺傳”的基本理念，但對于細胞核如何通過控制蛋白質合成來控制生物遺傳和代謝還不了解，因此要把握好知識的延展，另外學生對克隆羊、傘藻嫁接等實驗又很感興趣，因此通過實驗設計的探究，可以引發學生進行實驗的興趣，提高學生設計實驗的能力。
【教學過程】
引入新課
【創設情境】
出示植物細胞和細菌的亞顯微結構圖片，要求學生觀察比較兩者的不用，同時說出細胞內各結構的名稱。
【講述】原核細胞和真核細胞最主要的區別是有無細胞核，以及細胞核中結構的區別，等我們學完這節課之后，再來完成兩者細胞核的不同之處。
學生觀察、回憶，說出各結構名稱，同時通過比較，得出兩者的區別。
植物細胞：有細胞核和各種細胞器，為真核細胞。
細菌細胞：沒有細胞核，只有核區，只有核糖體，為原核細胞。
一、細胞核的結構
【提問】大家閱讀課本，思考：
真正的細胞核具有什么樣的結構呢？
學生通過閱讀，回答：細胞核包括：核膜（2層膜，有核孔，是大分子物質出入的通道）、核仁（與核糖體的形成有關），染色質（由DNA和蛋白質組成，是遺傳物質的主要載體）。
【講述】染色質、染色體：主要有DNA和蛋白質組成，呈細長絲狀，因易被堿性染料染成深色而得名。若細胞要分裂，染色質就螺旋化，縮短變粗，形成棒狀或桿狀的染色體（用自制的教具講解）。
學生閱讀課本填寫染色質與染色體比較表。
二、細胞核的功能
【提問】具備這些結構的細胞核具有什么功能呢？
資料一：多莉羊的培育過程，使學生對細胞核的功能有初步的認識。
【提問】
1.多莉最像哪只羊？為什么？
2.從多莉的培育過程，你得出什么結論？
學生觀察多莉的培育過程，回答：多莉最像B母羊。因為B母羊提供細胞核；得出的結論是細胞核控制著細胞的遺傳。
資料二：美西螈核移植實驗。
【提問】
1.移植長大后的美西螈是什么體色？為什么？
2.由此你認為生物性狀的遺傳主要由什么控制呢？
學生觀察實驗步驟，預測實驗結果，得出結論。
【探究活動】驗證細胞核控制著細胞的遺傳
【提示】傘藻嫁接實驗
實驗設計思路：學生小組探究設計實驗
依據學生的設計思路，以圖示來表示實驗過程。
【結論】傘藻的嫁接實驗說明細胞核控制著細胞的遺傳。
【小結】通過以上的實驗，我們得出結論，細胞核是細胞進行生命活動所必需的。
三、原核細胞和真核細胞核區的比較
【提問】那么原核細胞中核區的功能與真核細胞的細胞核是否一樣？結構又有什么不同呢？
（根據學生的回答，完成表格。）
【課堂小結】
細胞核是真核細胞特有的細胞器，它是真核細胞重要的組成部分。細胞核中包含著攜帶細胞全部基因組的染色體。由于絕大多數遺傳信息貯存在細胞核中，DNA復制、RNA轉錄都在細胞核中進行，因此，它成為細胞生命活動的控制中心。
【作業布置】
教師：現在同學們已經學習了細胞各個結構的特點及功能，對細胞有了一定的認識，我們可以通過特殊的方法對已學的知識進一步的加深和鞏固，這種方法就是建立模型。
注意：科學性、準確性應放第一位，還應考慮藝術性、成本低廉等等。
【板書設計】
細胞核范文2
一、教學設計思路清晰，教學目標明確，教材處理得當，符合學生發展
譚老師用黑綿羊能否生出一個美羊羊為問題導入，新穎又能激起學生學習的興趣。
緊接著用展示四個資料，每一個資料推出一個細胞核的功能，最終總結出細胞核的功能，培養了學生歸納總結的能力。而且這四則資料并沒有按照教材上的順序按部就班，而是作了細微的調整，讓學生更加容易接受。這四個材料并不是散的，每個環節都緊緊相扣，讓學生明白下一個環節應該做什么。
二、注重學生能力的培養
譚老師采用啟發誘導的方式來培養學生良好的思維習慣，思考問題和解決問題的能力?？偣菜膭t材料，首先前兩則資料由老師通過提問方式引導學生回答，而且每一個資料分析完得出結論之后都會問：如何驗證這一結論？讓學生積極思考。在前面老師的引導下形成一定的思維模式之后，后面兩個資料就放手讓學生自己進行分析。達到了良好的效果。
通過課前模型的構建，課上模型分享，培養了學生的動手能力以及語言表達能力。讓學生加深對細胞結構的理解和記憶。整個分享過程輕松愉悅，讓學生在快樂中學習。
三、舉例生活化，形象，易于接受
本節內容相對來說較為抽象，看不見摸不著，除了用模型讓抽象的東西具體化來幫助學生理解之外，譚老師的舉例也是一大亮點。比如說，在區別染色質和染色體的時候，用彈簧比作染色體，鐵絲比作染色質。讓學生一下子就明白了染色質螺旋化形成染色體，染色體解螺旋形成染色質的涵義。
四、其他方面
在整個教學過程中，指向性明確；效率高。課堂上沒有一句廢話，教材上的重點語句達到一字不差的境界，語言相當精準，讓學生第一次接觸內容就能夠很標準的記憶，對于以后的答題標準化幫助很大。在最后模型分享環節能做到根據學生分享內容做到及時點評糾正，注重細節。
五、建議
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綜上所述，腫瘤細胞與正常細胞之間的蛋白表達一定存在著某種差異，使得凋亡素在腫瘤細胞中被特異地修飾。本實驗通過蛋白質組學的方法來尋找腫瘤細胞與正常細胞核內的蛋白表達差異，以期望能夠進一步探討凋亡素誘導腫瘤細胞特異凋亡的機制。
2．材料和方法
2.2 pEGFP-C1-apoptin 載體的提取按照 Promega 公司PureyieldTM Plasmid Midiprep System 提取試劑盒進行質粒的提取。
2.7 細胞核蛋白的雙向電泳將提好的細胞核蛋白樣品分裝，送公司進行雙向電泳。
3．實驗及結果分析
3.2 雙向電泳結果我們通過雙向電泳進行初步分析，發現HepG2 與L02 細胞核蛋白表達存在差異。
4．討論凋亡素能夠特異引起腫瘤細胞與轉化細胞的凋亡，這種細胞凋亡是非P53 依賴的，而不能夠導致正常細胞的凋亡。同時我們觀察到，凋亡素在細胞內的定位與其凋亡功能密切相關。將凋亡素的基因轉染進細胞，24 小時后，我們發現凋亡素無論在腫瘤細胞還是正常細胞，都定位在細胞核內，都不引起細胞的凋亡。48 小時后，凋亡素在腫瘤細胞核內聚集，行使凋亡功能，而凋亡素卻從正常細胞的核內出來，在胞質內聚集，不能引起正常細胞的凋亡。于是我們推測，凋亡素行使凋亡功能與其在腫瘤細胞核內受到某種修飾，而停留在細胞核內有關。而這種修飾在正常細胞的核內是沒有的，因此腫瘤細胞與正常細胞之間一定存在著某種蛋白表達的差異。
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【摘要】
目的探討粉防己堿（Tet）對肝星狀細胞（HSC）增殖的調控機制。方法培養大鼠HSC，MTT法測Tet對HSC增殖的影響，免疫細胞化學法測Tet對HSC增殖細胞核抗原（PCNA）和細胞周期素D1（CyclinD1）表達的影響。結果 Tet在0.5～1 mg/L的范圍內顯著抑制大鼠肝星狀細胞的增殖(P
【關鍵詞】 粉防己堿 肝星狀細胞 增殖細胞核抗原 細胞周期素D1 免疫細胞化學
Abstract：ObjectiveTo observe the effect of tetrandrine on the proliferation and expression of PCNA， CyclinD1 of hepatic stellate cell.MethodsHepatic stellate cells were cultured in RPM1640 medium . The effect of tetrandrine with various concentrations on the proliferation of hepatic stellate cell was observed with the MTT method. The effects of tetrandrine with various concentrations on the expression of PNCA， cyclinD1 of hepatic stellate cells were observed with immunocytochemistry. Results①From 0.5 mg/L to 1mg/L， tetrandrine inhibited the proliferation of hepatic stellate cell in a concentration dependence manner (P
Key words：Tetrandrine； Hepatic stellate cell； PCNA； CyclinD1； Immunocytochemistry
粉防己堿（Tetrandrine，Tet）是粉防己的主要活性成分，有著廣泛的藥理作用，應用前景廣闊，抗纖維化是其重要的藥理作用，Tet是抗肝纖維化的有效藥物［1］。各種致病因素引起肝臟損傷，細胞因子刺激肝星狀細胞激活增殖及轉化，細胞外基質(ECM)合成增多及降解減少，繼而沉積在細胞間隙，從而發生纖維化。Tet不僅能直接抑制肝貯脂細胞的增殖及轉化，而且可阻斷血小板衍生因子的促肝貯脂細胞增殖及膠原合成作用。Tet可通過轉化生長因子-β信號抑制體外培養大鼠肝星狀細胞活性［2］。但是Tet抑制肝星狀細胞增殖的具體機制不是很清楚，本研究觀察Tet對肝星狀細胞增殖過程中增殖細胞核抗原（PCNA）和細胞周期素D1(CyclinD1)的表達的影響，從細胞周期調控角度探討Tet影響肝星狀細胞增殖的機制。
1 器材與方法
1.1 材料大鼠肝星狀細胞株，瀘州醫學院附屬醫院傳染免疫實驗中心保存。
1.2 儀器與試劑CO2恒溫培養箱（美國Shel-Lab公司）；YJ-1450型醫用凈化工作臺（蘇州長春電子儀器廠）；1X71型倒置相差顯微鏡（日本Olympus光學儀器有限公司）。
粉防己堿（成都四川省藥檢所）；RPMI1640培養基（美國Gibco公司）；小牛血清（成都哈里生物公司）； PCNA單克隆抗體（NeoMarkers公司）； CyclinD1單克隆抗體（NeoMarkers公司）；ABC免疫組化試劑盒（深圳晶美生物有限公司）。其余試劑均為市售分析純產品。
1.3 大鼠肝星狀細胞培養 用含10%小牛血清的RPMI1640培養基將肝星狀細胞培養于37℃，5%CO2孵箱中，換液1次/d，當細胞貼滿培養瓶瓶底約80%時，用0.25%胰蛋白酶消化貼壁的細胞，進行傳代培養，并細胞及時凍存備用。
1.4 MTT法測Tet對細胞增殖的影響 取對數生長期細胞，于加藥前24 h消化后以1×104/ml接種于96孔板中，置于37℃，5%CO2孵箱中培養，待細胞生長達70%融合，將細胞分為 5 組:空白對照組（正常培養基）、0.25 mg/L組（培養基含0.25 mg/L Tet）、0.5 mg/L組（培養基含0.5 mg/L Tet）、1 mg/L組（培養基含1 mg/L Tet）、2 mg/L組(培養基含2 mg/L Tet)，每組設12個復孔。 加藥前以無血清培養基洗細胞3次。Tet處理24 h后 ，每孔加入 MTT溶液(5 μg/m1)20 μl，37℃繼續培養 4 h后終止反應，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，用酶標儀測各孔波長在490 nm的OD值，并以下列公式計算細胞抑制率 ：細胞抑制率=(空白對照組平均OD值-處理組平均OD值)／空白對照組平均OD值×l00%。
1.5 免疫細胞化學實驗取對數生長期細胞，于加藥前24 h消化后以4×104/ml接種于置有經多聚賴氨酸處理的蓋玻片的24孔板中，置于37℃，5%CO2孵箱中培養，待細胞生長達70%融合，將細胞分為3組：空白對照組（正常培養基）、0.5 mg/L組（培養基含0.5 mg/L Tet）、1 mg/L組（培養基含1 mg/L Tet）。加藥前以無血清培養基洗細胞3次。Tet處理24 h后上，PBS洗細胞3次，4%多聚甲醛固定細胞15 min，4%Tri-tonX-100通透細胞 30 min，過氧化物酶阻斷劑孵育10 min，非免疫性動物血清中孵育10 min，加一抗4℃冰箱過夜后，生物素標記的二抗中孵育10 min，加SABC復合物孵育10 min，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，照相。以 PBS代替一抗作陰性對照。每組細胞各進行6次獨立性實驗。 PCNA、cyclinD1陽性結果判斷：PCNA染色：細胞核著色，染成棕黃（褐）色為陽性，淺（灰）藍色視為陰性；cyclinD1染色：細胞核著色，染成棕黃（褐）色為陽性，淺（灰）藍色視為陰性。400倍鏡下，PCNA、cyclinD1指數通過隨機選擇5個高倍視野，每視野計數100個細胞中的陽性細胞數。取平均數作為計數指標。
1.6 統計學分析結果用 ±s表示，數據統計分析利用SPSS 14.0軟件完成，比較采用單因素方差分析，以 P
2 結果
2.1 Tet對肝星狀細胞增殖的影響用MTT法檢測了不同濃度藥物對細胞增殖的影響， Tet在0.5～1 mg/L的范圍內顯著(P
表1 不同濃度Tet對肝星狀細胞增殖的影響（略）
與對照組比較，*P
2.2 Tet對肝星狀細胞PCNA表達的影響PCNA以細胞核表達為主，細胞質也有表達。Tet 0.5，1 mg/L濃度組PCNA陽性表達細胞數與對照組有顯著性差異(P
2.3 Tet對肝星狀細胞CyclinD1表達的影響CyclinD1以細胞核表達為主，細胞質也有表達。Tet 0.5，1 mg／L濃度組CyclinD1陽性表達細胞數與對照組有顯著性差異(P
表2 Tet對肝星狀細胞PCNA及CyclinD1表達的影響（略）
表身中數據為每視野中個數；與對照組比較，﹡P
圖1 各組PCNA陽性表達情況，SABC法染色，×400（略）
圖2 各組CyclinD1陽性表達情況，SABC法染色，×400（略）
3 討論
粉防己堿（Tetrandrine，Tet）是從中草藥粉防己的根塊中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿，是粉防己的主要活性成分。Tet是天然的非選擇性的鈣通道阻滯劑，又是鈣調蛋白的拮抗劑，有著廣泛的藥理作用，應用前景廣闊，抗纖維化是其重要的藥理作用， Tet是抗肝纖維化的有效藥物［1］。本研究通過MTT法發現在一定濃度范圍內，Tet能夠濃度依賴性的抑制大鼠肝星狀細胞增殖。在真核細胞的細胞周期調控中，G0/G1-S期之間的調控點(restriction point，又稱R點)是細胞內外信號經傳遞、整合，匯集到細胞核對細胞增殖進行調控的關鍵點，由G1期周期蛋白cyclinD1等調控［3，4］。細胞能否通過限制點從G1期進入S期很大程度上取決于G1期內CyclinD1的積累［5］。CyclinD1可與細胞周期蛋白依賴激酶 (cyclin dependent kinase，CDK)結合形成復合物，在 CDK激酶的介導下發生磷酸化，從而促進某些基因的表達 ，這些基因的表達產物可促使細胞通過G1-S調控點 ，使細胞進入自主分裂程序［6，7］。本實驗通過免疫細胞化學進一步研究發現大鼠肝星狀細胞中存在CyclinD1的表達，在一定范圍內，隨著Tet濃度的增加，大鼠肝星狀細胞CyclinD1蛋白的表達逐漸減少。說明Tet可通過降低細胞周期素CyclinD1的表達而抑制大鼠肝星狀細胞增殖。PCNA又稱作細胞周期蛋白、DNA聚合酶6輔助因子等，在細胞DNA復制、細胞周期運行中發揮重要作用，PCNA合成與細胞增殖狀態關系密切。PCNA從細胞G1后期開始出現表達，S期達高峰，M期表達出現下降，G0期則不表達。各種刺激因子可通過不同的途徑誘導肝星狀細胞增殖，但都必須通過PCNA的表達這一中間環節，因而它是細胞增殖的必經之路。本研究發現在一定范圍內，隨著Tet濃度的增加，大鼠肝星狀細胞PCNA表達也逐漸減少。說明PCNA表達減少也參與了Tet抑制大鼠肝星狀細胞增殖的機制。
可見Tet可以通過降低大鼠肝星狀細胞CyclinD1、PCNA表達，進而發揮抑制大鼠肝星狀細胞增殖的作用，具體途經可能是Tet通過阻滯鈣離子通道，降低細胞內鈣離子濃度，抑制鈣離子信號途徑，降低Cyclin D1蛋白表達進而減少PCNA蛋白表達，后者則阻止細胞通過G1-S調控點進入S期，使其停滯于 G0/G1期，如此細胞無法進入自主分裂程序，細胞增殖便受到抑制。
【參考文獻】
［1］ Chen YW， Li DG．Progress in study of tetrandrine on antihepatofibrosis［J］.Zhonghua Xiaohua Zazhi， 2000，20:47.
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［3］ Bellacosa A， Almadori G， Cavallo S， et al. CyclinD1 gene amplification in human laryngeal squamous cell carcinomas: prognostic significance and clinical implications［J］.Chin-cancer-Res.1996， 2:175.
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［5］ 曹躍瓊， 喬守怡，趙壽元. 細胞周期抑制蛋白cyclinD1及INK4研究進展［J］.國外醫學分子生物學分冊，1998， 20:1.
細胞核范文5
關鍵詞 糖尿病足 中醫證型 脛后動脈 血管細胞核增殖相關抗原 臨床研究
糠尿病足是糖尿病的嚴重并發癥，據統計1996年全球糖尿病患者1．2億，預計到2025年，將達到2．5億以上，而大約15％的糖尿病患者將在其生活的某一時間發生足潰瘍或壞疽[1]。目前對于糖尿病足病因及發病機制雖然還不是完全清楚，但大家公認糖尿病合并大血管病變導致動脈粥樣硬化是糖尿病足發病的最主要因素?，F將2004年10月～2005年5月間我們收治的32例糖尿病足患者的截肢動脈標本的血管細胞核增殖相關抗原(Ki67)與其中醫辨證分型的相關性研究情況報告如下。
1 臨床資料
1．1 一般資料：32例均為天津醫科大學代謝病醫院和天津中醫學院第一附屬醫院2004年10月～2005年5月間的住院患者，其中男性24例，女性8例；年齡50～86歲，平均年齡69．2歲；糖尿病病程最長30年，最短6年，平均18±2．4年。
1．2 診斷標準：糖尿病足的診斷標準采用2000年中華醫學會糖尿病學會第二屆糖尿病足會議所制訂的“糖尿病足(肢端壞疽)檢查方法及診斷標準”。
1．3 截肢標準：參照國際糖尿病足工作組編寫的《糖尿病足國際共識》中關于“大截肢的定義、標準和指標”[2]執行。
1．4 中醫辨證分型標準：參照《中醫外科學(第七版)》及《中藥新藥臨床研究指導原則?脫疽》之中醫辨證分型方案分為氣陰兩虛瘀阻證、脈絡瘀熱證、氣血兩虛瘀阻證、脈絡熱毒證四型。
2 觀察方法
2．1 標本取材：壞疽截肢標本32例，其中按中醫辨證分型氣血兩虛瘀阻組10例，脈絡瘀熱組10例，氣陰兩虛瘀阻組4例，脈絡熱毒組8例，取各例標本下肢脛后動脈。標本經過10％福爾馬林固定，常規石蠟包埋，備用。
2．2 設備、試劑：美國PENGUIN-600CL自動圖像分析系統，細胞核增殖相關抗原(Ki67)抗體PV9000試劑盒DAB購于北京中山生物技術有限公司。
2．3 免疫組織化學法：標本常規石蠟包埋，4μm連續切片，采用PV法進行免疫組化染色，染色過程嚴格按試劑盒染色程序進行，選取已知的陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。觀察細胞核增殖相關抗原(Ki67)，陽性物質呈棕黃色細顆粒狀于細胞核表達，采用美國PENGUIN-600CL圖像分析系統進行圖像分析，選取病變處每500個細胞Ki67的陽性表達率作為其陽性表達指數。統計學處理應用SPSS10．0軟件包進行方差分析。
3 結果
3．1 中醫各證型所占比例以及年齡、性別分布：各證型比例，氣血兩虛瘀阻組10例（31．25%），脈絡瘀熱組10
例（31．25%），氣陰兩虛瘀阻組4例（12．5%），脈絡熱毒組8例（25．0%）。年齡、性別分布情況，見表1。
表1 32例患者年齡、性別分布 n（%）
性別n50~60歲61~70歲71~80歲80歲以上男24（ 75．0）4（12．5） 8（25．0）11（34．4）1（3．1）女 8（ 25．0）1（ 3．1） 3（ 9．3） 4（12．5）0 總計32（100．0）5（15．6）11（34．4）15（46．9）1（3．1）3．2 免疫組織化學法觀察各證型Ki67表達差異：具體情況見表2。
表2 各證型Ki67陽性表達指數比較 （%）
證型Ki67陽性表達指數脈絡熱毒 4．87±1．01*氣陰兩虛瘀阻1．86±0．47脈絡瘀熱1．49±0．13氣血兩虛瘀阻0．30±0．18注：與氣血兩虛瘀阻型比較，*P
氣血兩虛瘀阻證、脈絡熱毒證、脈絡瘀熱證、氣陰兩虛瘀阻證中均可見部分細胞Ki67呈陽性表達，在脈絡熱毒證中表達指數最高，氣血兩虛瘀阻證中表達指數最低，二者比較具有顯著性差異(P
4 討論
Ki67抗原為細胞核內與細胞分裂增殖相關的蛋白抗原，分子量為345kd和395kd，其編碼基因位于第10號染色體上。Ki67的表達出現于G1中期到晚期，S期和G2期逐漸增加，有絲分裂期達高峰，分裂后迅速降解或丟失抗原決定簇，到G0期則不表達，半衰期為lh或更短[3]。有人認為它可能是具有蛋白結合特性的重要結構，在有絲分裂中起著維持DNA規則結構的重要作用[4]，是一個反映細胞增殖的敏感指標。
在糖尿病足的不同辨證分型中氣血兩虛瘀阻證、脈絡熱毒證、脈絡瘀熱證、氣陰兩虛瘀阻證中Ki67表達均呈陽性，在脈絡熱毒證中表達最強、氣血兩虛瘀阻證中表達最弱，二者相比具有顯著性差異(P＜0．05)。根據Ki67陽性指數可以判斷細胞增殖的活性，指明細胞增殖與糖尿病足動脈病變的關系。在糖尿病足的不同辨證分型中動脈的硬化閉塞程度由輕到重依次是脈絡熱毒證、氣陰兩虛瘀阻證、脈絡瘀熱證、氣血兩虛瘀阻證。Ki67的陽性表達與糖尿病足動脈硬化閉塞程度呈負相關。而在通過對32例糖尿病足截肢的動脈進行病理學觀察的過程中發現糖尿病足血管病變主要體現在中動脈的病理學變化，其中脈絡熱毒、氣陰兩虛瘀阻兩證型以動脈周圍及全層的炎癥性改變為主；脈絡瘀熱、氣血兩虛瘀阻證以中膜鈣化、平滑肌細胞萎縮、變性、壞死及膠原纖維增多及內膜粥樣斑塊形成為主，炎癥表現不明顯；而Ki67的陽性指數與血管炎癥病變程度呈正相關。這說明炎癥在糖尿病的大血管病變的過程中起了重要的作用，特別是在脈絡熱毒證、氣陰兩虛瘀阻證兩型，這對臨床具有重要的指導意義。
5 參考文獻
1 Boulton A J. The diabetic foot：a global view. Diabetel Metab Res Rev，2000，16(1)：2．
2 許樟榮，敬華．糖尿病足國際共識．中華糖尿病學會第二屆足病第一次足病研討會．2002，435．
細胞核范文6
關鍵詞：癲癇；大針手法；督脈；海馬；核轉錄因子-κB
中圖分類號：R742.1 R246 文獻標識碼：A
doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2014.04.045
文章編號：1672-1349（2014）04-0471-04
Effects of Nuclear Factor-kappa B Expression in Hippocampal Nerve Cells of Epileptic Rats through Dazhen Acupuncture Manipulation on Du Meridian
Ni Wenjie，Zhao Lixin，Duan Shuqin，et alShanxi Hospital of Traditional Chinese Medicine（Taiyuan 030012）
Abstract：Objective To study the effects of nuclear factor-kappa B（NF-κB） expression in hippocampal nerve cells of epileptic rats through dazhen acupuncture manipulation on Du Meridian，then explore the mechanism of anti-epilepsy through dazhen acupuncture manipulation on Du Meridian，provide new theoretical basis for clinical acupuncture treatment of epilepsy.Methods Thirty health rats were randomly and enenly divided into blank control group（group A），epilepsy model group（group B），dazhen acupuncture manipulation group（group C），Lithium chloride and pilocarpine were injected the rats’ enterocoelias of group B and group C，induce status epilepticus（SE） model.The rats’ behavior changes were observed.Equal dose of normal saline were injected the rats’ enterocoelia of group A.Any treatment was not given to group A，dazhen acupuncture manipulation was applied at points of Du Meridian ：Fengfu，Dazhui，Taodao，Wuming，Shenzhu，once a day，20 minutes every time，treatment for 14 days.The pathological morphological changes in the hippocampal nerve cells of the three groups were observed by using HE staining.The expression of NF-κB P65 in hippocampal nerve cells of the epileptic rats were observed by immunohistochemistry.Results The status epilepticus were induced in group B and group C，one rat dead in two groups.The rats in group B had obvious pathological morphological changes，the pathological morphological change in group C had obvious improvement. There was no obvious pathological morphological changes in group A.Immunohistochemical staining：The expression of NF-κB P65 was（13.95±6.99） in group A，（28.75±8.80） in group B，（19.25±8.60） in group paring each two groups，the differences are statistically significant（P
Key words：epilepsy；dazhen acupuncture manipulation；Du meridian；nucler factor-kappaB
癲癇（Epilepsy）是由多種原因引起的腦部興奮性過高以致某些神經元突然過度異常放電，導致腦部功能短暫異常，臨床表現為陣發性意識改變或喪失，同時可有陣發性抽搐、感覺異常、特殊感覺現象或行為障礙的一種慢性臨床綜合征。持續而頻繁的癲癇發作可導致大腦神經元細胞的凋亡，本病長期反復發作，不僅使患者軀體遭受痛苦，而且在一定程度上導致精神及社會心理障礙，在智能及人格方面均受到損害。
許多實驗研究發現，在癲癇發病中，核轉錄因子-κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）作為轉錄因子參與了急性炎癥過程，作為細胞因子參與了神經興奮和/或神經膠質瘢痕的形成。因此，本實驗研究NF-κB在癲癇大鼠海馬中的表達，進而研究大針手法對癲癇大鼠神經NF-κB表達的調節作用，對針刺治療癲癇的作用機制進行研究，為針灸臨床治療癲癇提供新的理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物 Wistar大鼠30只，體重200 g～250 g，雌雄各半，由山西省中醫藥研究院中心實驗室提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（晉）2010-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（晉）2010-0002，實驗動物合格證號：0000014，室溫22 ℃～26 ℃室內，濕度70%，分籠喂養。
1.2 試劑與儀器 氯化鋰（Lithium chloride，美國Sigma公司），毛果蕓香堿（匹魯卡品，Pilocarpine hydrochloride，美國Sigma公司），水合氯醛（Chloral hydrate，天津市科密歐化學試劑有限公司），多聚甲醛（Paraformaldehyde，天津市化學試劑研究所），兔抗NF-κB多克隆抗體（sc-372，美國Santa Cruz公司），山羊抗兔IgG （sp-9001，北京中杉金橋），DAB顯色試劑盒（ZLI-9032，北京中杉金橋公司），切片機（德國萊卡RM2015），離心機（北京離心機廠LDZ5-2型），電子天平（瑞士METTER AE100型），移液器（德國EPPENDORF），干燥箱（日本三洋MIR-153型），低溫冰箱（日本三洋MDF-382E型），恒溫水浴箱（江蘇太倉醫用儀器廠DSHZ-300型），醫用微波爐（浙江臨安愛迪儀器廠YWY781B型），顯微鏡（日本OLYMPUS公司 BX51T-PHD-J11），計算機圖像處理系統CMOS（日本OLYMPUS公司），多功能真彩色細胞圖像分析管理系統（美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus）。
1.3 實驗方法
1.3.1 動物分組及模型制作 30只大鼠隨機分為3組：空白對照組（Α組）、癲癇模型組（Β組）、大針手法組（C組），每組10只，雌雄各半。Α組：腹腔注射同等容量的生理鹽水代替氯化鋰和匹魯卡品；Β組：腹腔注射氯化鋰3 mmol/kg，24 h后腹腔注射匹魯卡品30 mg/kg，分3次注射，每次間隔10 min，直至出現無間歇的癲癇持續狀態；C組：腹腔注射氯化鋰3 mmol/kg，24 h后腹腔注射匹魯卡品30 mg/kg，分3次注射，每次間隔10 min，直至出現無間歇的癲癇持續狀態。
參考Racine分級標準（0級～V級）：0 級，正常；Ⅰ級，濕狗樣顫動，面肌痙攣，如眨眼、動須、節律性咀嚼等；Ⅱ級，節律性點頭； Ⅲ級，前肢陣攣；Ⅳ級，站立伴雙側前肢陣攣； Ⅴ級，跌倒失平衡，四肢抽動。B組、C組大鼠誘導出Ⅳ級～Ⅴ級癲癇持續狀態（SE）且SE發作持續1 h視為造模成功，SE發作持續1 h后，予大鼠腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）終止發作，若注射水合氯醛30 min后未終止發作，予150 mg/kg重復注射，直至終止發作（以3次為最高限）。記錄大鼠行為學變化。
1.3.2 治療方法 Α組、Β組不做任何治療；C組用1寸不銹鋼針，針刺大鼠督脈穴：風府、大椎、陶道、無名（2～3胸椎棘突之間）、身柱（取穴參照《實驗針灸學》中大鼠的穴位），每日1次，每次20 min，中間行針1次，平補平瀉，治療14 d。
1.3.3 海馬取材 針刺14 d后，第15天時對大鼠腦組織進行取材。各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射，每只1 mL，過度麻醉，迅速剪開胸腹腔，暴露心臟肝臟，先經左心室快速灌注4 ℃生理鹽水300 mL（灌注針由左心室進針穿入主動脈，止血鉗固定，剪破右心耳，快速灌注生理鹽水300 mL），后接含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS，0.1 mol/L，pH=7.4）300 mL，先快后慢，灌注固定，大鼠迅速出現四肢顫動，頸部變硬，尾部變硬伸直，待大鼠全身僵硬后，迅速斷頭開顱取腦，將修整后的腦組織置于4%多聚甲醛中，4 ℃冰箱保存。24 h后，將大鼠腦組織移入含20%蔗糖的0.1 mol PB溶液（磷酸鹽緩沖液，pH=7.4，4 ℃）中至沉底。待腦組織下沉后，每個大腦半球于背側海馬最大斷面處，切取3 mm厚的組織，制成石蠟包塊，再做冠狀切片，厚度為4 μm（冰凍切片機切取），每只大鼠切取4張切片，貼于經明膠處理過的載玻片上。
1.3.4 HE染色 石蠟切片經常規脫蠟入水后，在蘇木素溶液浸染10 min，1%鹽酸酒精分色3 s～5 s（當深藍紫色變為淡粉色則中止）；氨水反藍5 min（由淡粉紅色變為淡藍色），自來水沖洗，終止反應，鏡下觀察，細胞核清晰染色呈藍紫色，細胞漿及其他背景基本無色即可。伊紅溶液染色5 min，自來水沖洗，鏡下觀察，細胞漿呈紅色，細胞核藍色即可。隨后經梯度乙醇脫水（從低濃度到高濃度，70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇，100%乙醇，每級5 min），每次2 min，二甲苯透明2次，每次10 min，最后用中性樹膠封片。光鏡下觀察大鼠海馬神經元形態學改變。
1.3.5 免疫組化染色 切片常規脫蠟至水，3%雙氧水室溫下作用10 min后，以蒸餾水沖洗3次，每次30 s，滴加復合消化液，室溫下作用10 min，以蒸餾水沖洗3次，每次30 s，滴加正常山羊血清封閉液室溫20 min，甩去多余液體，吸水紙吸取多余水分，滴加兔抗鼠NF-κB多克隆抗體（1∶50），4 ℃過夜；取出后自然復溫30 min，PBS（pH7.4）沖洗3次，每次5 min；滴加生物素標記山羊抗兔IgG（1∶100），37 ℃孵育20 min，PBS（pH7.4）沖洗3次，每次3 min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（1∶100），37 ℃孵育20 min，PBS（pH7.4）沖洗3次，每次3 min；DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒內AB試劑各一滴，混合后加至切片。室溫下顯色，鏡下控制反應時間， 約5 min～20 min。然后用蒸餾水充分沖洗。蘇木素復染。乙醇梯度脫水（70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇，100%乙醇，每級5 min）。二甲苯透明5 min，中性樹膠封片，晾干即可。每張切片測5個視野，以人機交互方式，由計算機計算出每個視野的NF-κB P65陽性細胞數及平均光密度，取其平均值。計算機圖像處理系統由CMOS及多功能真彩色細胞圖像分析管理系統組成。
1.3.6 主要觀察指標 各組大鼠造模過程中行為學變化；各組大鼠海馬神經細胞病理改變；各組大鼠海馬神經NF-κB P65表達的變化。
1.4 統計學處理 采用SPSS17.0 統計軟件對NF-κB P65陽性細胞數進行統計學分析。實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，P
2 結 果
2.1 各組大鼠行為學觀察 A組大鼠腹腔注射生理鹽水后，行為活動無異常，無死亡。B組和C組大鼠腹腔注射氯化鋰（3 mmol/kg）后，所有大鼠行為活動均無異常，24 h后，腹腔注射匹魯卡品（30 mg/kg，分3次注射，每次間隔10 min）2次或3次后，2 min～15 min內，大鼠逐漸出現外周膽堿能反應：立毛、流涎、顫抖、流血淚，同時或先后出現刻板行為：凝視不動、咀嚼、吸鼻或探索行為、濕狗樣震顫、反復頭頸上仰，隨后出現眨眼、面肌痙攣、點頭，口吐白沫，嘴唇、四肢皮膚發紺，甚至大小便失禁，最后出現反復雙側前肢陣攣伴直立、跌倒或翻轉，部分動物出現四肢強直-陣攣發作。開始發作尚不頻繁，隨著時間延長，發作頻率增高，全部達到Ⅳ級～Ⅴ級癲癇持續狀態。SE狀態1 h后，B組和C組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）終止發作。終止發作后，B組死亡1只，存活率90%，C組死亡1只，存活率90%，A組存活率100%。B組與A組存活率比較，差異無統計學意義；C組與A組存活率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。詳見表1。
2.2 各組大鼠海馬神經細胞的病理改變 經HE染色后，光鏡下觀察海馬組織病理改變： A組海馬CA1區神經元結構正常，排列整齊，形態完整，細胞核圓或橢圓形，規則，核膜清楚完整，染色質分布均勻，胞質內可見尼氏小體，核仁清晰可見。
B組海馬CA1區神經元排列不整齊，正常神經元數量顯著減少，細胞間隙增大，部分神經元形態不完整，核膜結構不清楚，細胞核開始出現固縮，核仁不明顯，胞漿濃縮深染，呈空泡樣變，大部分細胞尼氏體消失，還可見變性壞死的神經細胞。
C組海馬CA1區神經元排列較整齊，接近正常，正常結構的神經元較多，大部分神經元細胞核、核膜結構清楚，少部分細胞尼氏體消失或胞漿濃縮深染，變性或壞死的細胞較少，損傷程度較癲癇模型組輕。
2.3 各組大鼠海馬NF-κB P65陽性細胞數的表達 免疫組化結果：A組大鼠海馬CA1區，棕黃色的NF-κB P65陽性反應物在胞漿、胞核染色非常弱，且幾乎都分布于胞漿中，胞核中的陽性物質很少甚至沒有。
B組大鼠海馬CA1區可見很多NF-κB P65陽性細胞表達，神經元細胞核、胞漿內棕黃色的NF-κB P65的陽性反應物染色較正常組明顯加深，多呈團塊狀分布，且胞核內染色較胞漿深。
C組大鼠海馬CA1區可見較少NF-κB P65陽性表達細胞，NF-κB P65陽性反應物在胞核、胞漿棕黃色染色非常淺，在胞核內的棕黃色染色較癲癇模型組染色淺，接近空白對照組，未見棕黃色染色團塊狀分布。詳見表2。
3 討 論
目前，對癲癇的發病機制尚未完全明了，在治療癲癇方面，所有的抗癲癇化學藥物都有不良反應。因此，探尋防治癲癇的新途徑、新方法具有重要的意義。
針灸治療癲癇早在《內經》中就有記載，也是現在臨床上較為有效的辦法。針灸治療癲癇選穴多樣，但總的是以任、督穴位為多。彭光超[1]取穴鳩尾、筋縮、腰奇、間使、豐隆，痰熱較盛加太淵；肝熱加太沖；體弱加足三里，痊愈34例，顯效10例，好轉4例，無效6例。張智龍[2]用意氣行針法治療癲癇35例，取絲竹空、三陰交、太沖、陰陵泉、陽陵泉、豐隆、內關（均雙側）、鳩尾、關元，從頭到足依次取穴，針絲竹空得氣后密切注意守氣勿失，拇指向前捻轉180°，緊捏針柄不動，意守針尖，以意聚氣，待針下有跳動感時，以意行氣，余穴用平補平瀉法，痊愈25例，顯效7例，好轉2例，無效1例，總有效率97.14%。翟文生等[3]用醒腦開竅針法治療60例，治愈9例，顯效18例，好轉30例，無效3例。許永迅[4]采用芒針治療102例，大椎透靈臺，至陽透筋縮，脊中透命門，腰奇透長強，神庭透囟會，百會透后頂，璇璣透膻中，鳩尾透中院、內關（雙）、豐隆、太沖、雙側頂顳前斜線，顯效54例，有效25例，效差10例，無效13例。
已有研究表明，針刺可對癲癇動物中樞神經的腦電活動、神經遞質、環核苷酸等產生影響[5]，張穎[6]研究了針刺對電刺激癲癇大鼠模型的作用，發現針刺可顯著降低癲癇大鼠的放電平均波幅、放電最高波幅及放電頻率，提高其腦電基本頻率，說明針刺可顯著抑制癇性放電、控制癲癇發作。楊帆等[7]發現大鼠癲癇模型組腦內興奮性氨基酸天門冬氨酸、谷氨酸升高明顯，而抑制性氨基酸γ-氨基丁酸明顯降低，經電針百會、風池后γ-氨基丁酸、丙氨酸明顯升高，而谷氨酸降低明顯。楊帆等[8]用戊四唑（PTZ）制作的點燃型癲癇大鼠模型海馬結構內環磷腺苷（cAMP）、環磷鳥苷（cGMP）含量均有增加，其中cGMP增加非常明顯，經電針百會、風池、風府后cAMP、cGMP含量均明顯降低，電針對PTZ點燃型癲癇大鼠海馬結構內cAMP、cGMP含量的改變有一定的調節作用，對cAMP的調節迅速但持續時間短，而對cGMP的調節緩慢而持久。
NF-κB在癲癇發病機制中的作用也是目前研究熱點之一，NF-κB是一種重要的核轉錄因子，參與真核細胞多種基因的表達調控，影響細胞的許多生物學功能[9]，其活化形式通常是P50和P65，當細胞處于靜息狀態時，NF-κB和其抑制因子IB結合存在于細胞質中，當細胞受到各種刺激后，許多實驗研究發現，在癲癇發病中，NF-κB作為轉錄因子參與了急性炎癥過程，作為細胞因子參與了神經興奮和/或神經膠質瘢痕的形成。Blondeau研究發現，海人藻酸可快速增加NF-κB與DNA的連接活動度，使其亞單位產生核移位，認為NF-κB活化作為癲癇發病機制的基礎信號轉導通路的一個關鍵步驟[10]。Matsuoka等[11]利用大鼠海人藻酸點燃模型發現癇性發作后4 h～16 h內海馬神經元NF-κB活化明顯增加，并伴膠質細胞NF-κB持續活化。Crespel利用合并海馬硬化的顳葉癲癇患者術后病理切片進行免疫組化分析發現，膠質細胞和大腦錐體細胞NF-κB/P65過度表達，并推測癲癇形成過程是由NF-κB介導的炎癥反應過程，其過程是一個被癇樣發作反復、短折激活的慢性過程[12]。
用大針手法治療癲癇是我院針灸專家馮尚武和郭耀康老師在長期的臨床工作中，發現的一種治療癲癇的針刺方法，療效確切，已得到臨床驗證。此法是用21號、長3寸～4.5寸的不銹鋼針，針刺督脈穴的風府、大椎、陶道、無名（胸椎2～3之間）、身柱。操作時，先用捻轉法進針，當針尖到達兩椎骨棘突之間時，改用緩慢推進法（不捻轉慢慢向前推進），約當針尖達脊髓腔時，其方向為：若針風府穴，須使針和耳垂成水平線，緩慢推進；若針大椎、陶道、無名、身柱，均按45°～60°角向斜上方緩慢推進（注意：不可用力過猛，更不可行捻轉搗刺術）。針到適應處時，患者常尖叫一聲，全身抽動一次，此時立即停止針刺，患者意識不清的可能稍轉清醒，有的可出現胸部灼憋悶，全身發麻發軟，顏面蒼白，瞳孔散大，全身肌肉松弛，出冷汗等癥狀，屬正常反應，可留針15 min～30 min。若在針刺狂躁厲害或體格強壯的患者時，未出現上述諸癥之一者，可再行抽刺，抽刺時一般采用扇形往兩側抽刺，每抽刺一下，患者的腿隨即跳動一下，抽刺后有的患者可出現雙下肢的暫時性癱軟，一般在1 h～2 h后即可恢復，必要時可架扶慢慢行走或適當休息。另外，如患者體質比較虛弱，可選用26～28號針進行針刺，以減少刺激。
本實驗通過大針手法治療癲癇大鼠，研究大針針刺督脈對癲癇大鼠神經NF-κB表達的影響。證實癲癇大鼠的海馬神經發生病理改變，大針手法針刺督脈穴位可以改善海馬神經的病理改變，癲癇大鼠的海馬神經NF-κB P65陽性細胞數的表達增多，減少海馬神經NF-κB P65陽性細胞數的表達。針灸治療癲癇可能是通過抑制海馬神經細胞NF-κB的表達，從而減輕了NF-κB作為轉錄因子參與的急性炎癥過程，減少了NF-κB作為細胞因子參與的神經興奮和/或神經膠質瘢痕的形成，從而減少正常海馬神經細胞的凋亡，達到治療癲癇、減輕癲癇癥狀的目的。
參考文獻：
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