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免疫組化技術范文1
【摘要】目的,探討液基細胞學薄層涂片技術在體液免疫組化中的應用。方法對經巴氏涂片檢查發現癌細胞的胸腹水36例分別采用液基細胞學涂片技術和傳統涂片方法涂片，然后進行免疫組織化學檢查。結果,采用液基細胞學薄層涂片技術制作36片，優質片36片，其優片率100%；采用傳統涂片方法制片36片，優質片30例，其優片率83.3%，兩者間差異顯著。結合免疫組化結果有助于診斷和鑒別診斷間皮瘤和腺癌，結論,采用液基薄層細胞學涂片技術制片提高了制片的質量，對間皮瘤和腺癌的診斷和鑒別診斷提供了有效的方法，提高了脫落細胞學對間皮瘤和腺癌的診斷價值。
【關鍵詞】活組織檢查；細胞學技術；免疫組織化學；間皮瘤/診斷；腺癌/診斷
在體液細胞學檢查與診斷研究中，涂片及染色質量的好壞直接影響到病理診斷及研究結果的正確判斷，而免疫組化結果有助于診斷和鑒別診斷間皮瘤和腺癌。傳統的巴氏涂片在免疫組化質量上不能令人滿意，如細胞重疊，色調不正、雜質多等，而我科在工作中經過不斷的摸索，發現了液基細胞學薄層涂片技術應用于免疫組化中，獲得了較滿意的效果。
1、材料與方法
1.1材料來源：我科2010—2011年間以經巴氏涂片檢查發現癌細胞的胸腹水36例，其中男20例，女16例，年齡35～80歲。所有病例都有手術標本的組織學對照，排除了腫瘤者為陰性病例。
1.2方法：新鮮胸、腹水250～500ml，留置時間復季＜2h，冬季＜4h。
1.2.1胸、腹水沉淀與固定將胸、腹水置于2個50ml的離心管中，每管50ml，2000～2500r/min離心10min，棄上清液，吸出部分沉積物常規涂片，剩余沉積物稀釋后直接加入裝有低濃度乙醇細胞保存液的保存瓶內備用，在保存瓶內至少放置15min以上。然后經thinprep-2000系統進行電腦程序化處理，制成直往為13mm的薄層細胞涂片（制作免疫組化涂片時，液基薄層制片機的染料臨時用95%的無水乙醇代替），自然干片后，按常規免疫組織化學染色，封片、讀片診斷。
1.2.2免疫組化用ElivisionTMPlus法?？贵w有CEA、Calretinin、Cytokeratin5/6、CD68，均購自福州邁新生物技術開發有限公司。
2、結果
采用液基細胞學薄層涂片技術制片36片，優質片36片，其優片率100%；采用傳統涂片方法制片36例，優質片30例，其優片率83.3%，兩者間差異顯著。
3、討論
液基細胞學檢測是90年展起來的一項制片新技術，已成功的應用于婦科細胞學，并取得了成熟的經驗。目前已經廣泛用于宮頸癌的篩查，但在體液免疫組化中應用甚少。胸腹腔積液在常規細胞學檢查中仍然是目前臨床常用的診斷方法之一，傳統的巴氏涂片法在體液的腫瘤細胞篩查上應用已超過半個世紀，但容易出現漏診或誤診，主要原因是其標本的制作往往受到體腔積液的新鮮程度、細胞數量、退變程度、血細胞含量或炎細胞干擾、黏液過多涂片厚薄，固定狀態等多方面因素的影響，造成涂片質量差，導致較高比例的假陰性率，假陽性率出現或干擾因素多導致免疫組化結果無法準確判讀［1]，有作者認為背景中血細胞的多少與涂片質量有明顯的關系，血細胞越多，往往有核細胞成分則少見，癌細胞也稀少，單個存在或不典型［2]。本文選用的液基細胞學薄層涂片技術對標本采集，制片技術及程序比傳統涂片具有以下優點［3]：（1）通過離心，細胞均勻涂布形成一個直徑13mm的細胞薄層，結構清晰，背景干凈，改變手工涂片細胞擁擠、重疊，形態特點不易觀察的缺點；（2）避免了細胞過度干燥造成的假象；（3）可以同時處理1～48份標本，并在全自動制片過程中同時完成細胞染色，也減少技術員對標本的接觸。
傳統的制片方法是將體腔積液離心后直接涂在普通的玻片上。這種涂片質量常不穩定，涂片厚薄不均勻，細胞重疊較重，而背景中又有較多的蛋白黏液，紅細胞和各類炎細胞及間皮細胞相混雜在一起，影響細胞的觀察，有些異常細胞甚至被遮蓋，這些都容易影響診斷的準確性［4]。而液基細胞學薄層涂片幾乎保留了離心后的所有細胞,并均勻分布于玻片上，去除了黏液、紅細胞、炎細胞的干擾，腫瘤細胞形態保存完整、細胞核、核質、核仁更清楚，獲得了三維立體結構。此外，標本儲存在保存液中，可重復制片，抗原性不受影響，也可用來作特殊染色，采用液基薄層細胞學涂片技術制片提高了制片的質量，對腺癌和間皮瘤的診斷和鑒別診斷提供了有效的方法，提高了脫落細胞學對腺癌和間皮瘤的診斷價值,與傳統制片方法相比，液基細胞學薄層涂片用于免疫組化中還節約抗體量，從而節約成本,值得推廣應用［5]。
參考文獻
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免疫組化技術范文2
【關鍵詞】 黃芪 肝損傷 小鼠
Abstract：Objective To investigate the protective effects of Compound Astragalus Extract (CAE) on liver injury in mice. Methods The acute liver injury models were induced by D-galactosamine (D-GalN， 800 mg/kg， ip) and Bacillus Calmette Guerin (BCG，1×107/0.2 mL， iv) plus Lipopolysaccharide (LPS 7.5 μg/0.2 mL， iv) in mice. ALT， AST， MDA content in liver homogenate were assayed by sepctrophotometry. IL-1 activity and ConA-induced splenocytes proliferation were detected by [3H] TdR incorporation assay. TNF-α activity was determined by assay of cytotoxicity against L929 cell. Results CAE (60， 120， 240 mg/kg) could obviously lower the elevated liver index， ALT level in serum and MDA content in liver homogenate in D-GalN mice and in the immunological liver injury mice. It also decreased ALT， AST level in serum， recovered ConA-induced splenocytes proliferation. It had inhibitory effect on inflammatory factors TNF， IL-1 secreted by PMφs. Conclusion CAE showed significant protective effects on chemical and immunological liver injury in mice.
Key words：CAE；liver injury；mice
黃芪始載于《神農本草經》，具有補氣升陽、固表止汗等功效[1]。現代臨床研究認為，黃芪粗制劑對慢性肝炎均有較好的療效，使大鼠肝纖維化程度明顯減輕[2]。我們多年的研究還發現，黃芪總苷有抗炎、抗氧化、免疫調節、誘導肝癌細胞凋亡以及抗肝纖維化等作用[3-6]。由此，根據臨床經驗并結合中醫理論，提取與分離了黃芪有效部位群(黃芪多糖、皂苷、酮及酚)，再依據體外正交實驗結果首次組成黃芪多部位組合(compound astragalus extract，CAE)。本實驗進一步對其抗小鼠肝損傷進行研究。
1 實驗材料
1.1 動物與細胞株
昆明種小鼠，雄性，6～8周，體重(18±2)g；C57BL/6J小鼠，雄性，6～8 周，體重(20±2)g；均購于安徽醫科大學實驗動物中心(合格證號：皖醫實動準字01號)。小鼠成纖維細胞瘤(L929)細胞株：南京軍事醫學研究所朱敏生教授惠贈。
1.2 藥物與試劑
CAE，合肥恒星醫藥研究所提供，批號20030508；研缽碾為細粉，0.5%羧甲基纖維素鈉溶液(CMC-Na)混懸。護肝片，黑龍江五常葵花藥業有限公司產品，批號20041016；卡介苗(BCG)，上海生物制品有限公司產品，用前以滅菌生理鹽水配成所需濃度；D-氨基半乳糖胺(D-GalN)重慶醫科大學生物醫學工程研究室，批號020327；硫代巴比妥酸(TBA)，上?；瘜W試劑公司；谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)試劑盒，上海榮盛生物技術有限公司產品；[3H]TdR比放射性為37 MBq/mL，中國原子能研究院同位素研究所產品；新生小牛血清(NBS)，杭州四季清生物制品公司產品；RPMI-1640培養粉，美國Gibco公司產品；脂多糖(LPS)、Hepes、刀豆蛋白A(ConA)均為美國Sigma公司產品。
1.3 儀器
Napco-6100型CO2培養箱，美國杜邦公司產品；YJ-1450型醫用凈化工作臺，蘇凈集團安泰公司制造；LDR4-8.4低溫離心機，北京醫用離心機廠生產；XSZ-D倒置顯微鏡，重慶光學儀器廠產品；GL20A全自動高速冷凍離心機，湖南儀器儀表總廠離心機廠；LS-6500型液體閃爍計數儀，美國Beckman公司產品；內切式組織勻漿機，浙江機械廠產品。
2 實驗方法
2.1 D氨基半乳糖胺誘導小鼠急性肝損傷模型的建立及處理[7]
昆明種小鼠60只，隨機平均分組：正常組、模型組、CAE 3個劑量組(60，120，240 mg/kg)和護肝片組(800 mg/kg)。灌胃給藥或溶媒，1次/d，共7 d，腹腔注射D-GalN 800 mg/kg，給藥容積0.1 mL/10 g，正常對照組腹腔注射等量的生理鹽水。造模后24 h眼眶采血、摘取肝臟，進行血清ALT、肝勻漿丙二醛(MDA)的測定。
2.2 卡介苗＋脂多糖誘導小鼠免疫性肝損傷模型的建立及處理[8]
昆明種小鼠60只，隨機平均分組(同上)。造模第1天每鼠尾靜脈注射給予BCG 2.5 mg/0.2 mL(5×107菌體)。正常鼠尾靜脈注射0.2 mL生理鹽水，2 h后灌胃給藥或溶媒，連續12 d。第12天每鼠靜脈注射LPS 7.5 μg/0.2 mL，禁食12 h。眼眶采血供ALT、AST的測定；同時進行ConA誘導的脾細胞增殖反應檢測及腹腔巨噬細胞的培養，收上清供腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與白細胞介素-1(IL-1)的檢測。
2.3 指標檢測
2.3.1 血清ALT、AST檢測
采用賴氏法，按試劑盒說明書步驟操作。
2.3.2 肝勻漿MDA測定[9]
采用TBA比色法。由標準曲線計算樣本含量，結果以nmol/g表示。
2.3.3 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖反應的測定[10]
采用[3H]TdR摻入法。常規制備1×1010/L C57BL/6J小鼠脾細胞懸液，加入96孔板，每孔100 μL；再加含ConA(終濃度5 mg/L)的10%小牛血清RPMI 1640培養液100 μL。設3個復孔，37 ℃、5% CO2培養48 h。終止培養前6 h，加[3H]TdR 20 μL(終濃度370 bq/mL)，培養結束后，收集細胞，液閃計數儀測dpm值。
2.3.4 小鼠腹腔巨噬細胞(PMΦs)分泌TNF-α及IL-1活性的檢測
參照文獻[11-12]方法，分別采用小鼠L929殺傷法和小鼠[3H]TdR摻入法。
2.4 統計學方法
各組數據均以—x±s表示，組間比較用SPSS11.5軟件進行t檢驗。
3 結果
(見表1～表3)表1 CAE對D-GalN誘導的小鼠肝損傷血清ALT、肝勻漿MDA及肝指數的影響(略)注：與正常組比較，##P
4 討論
我們前期體外研究結果表明，黃芪多糖、皂苷、酮及酚等4個有效部位均能不同程度的抑制LPS誘導的大鼠腹腔巨噬細胞產生IL-1、TNF-α及NO的水平。依據體外實驗(正交設計)組成的CAE在11.3～90 mg/L濃度范圍內同樣對LPS誘導的大鼠腹腔巨噬細胞產生上述炎癥因子有明顯的抑制作用[13]。但CAE對急性肝損傷小鼠有無作用？本實驗首先采用了類似人類病毒性肝炎的D-GalN化學性肝損傷模型[7]，結果表明，口服不同劑量CAE(60、120、240 mg/kg)均能明顯降低D-GalN升高的血清ALT的水平、肝臟指數及肝勻漿MDA的含量，表明CAE對D-GalN性肝損傷有保護作用，提示CAE的抗氧化和抗炎作用可能是其抗肝損傷作用的機制之一。
早期的研究發現，許多慢性肝炎患者存在諸多抗體，從而認為病變遷延不愈的本質可能與免疫有關，于是人們采取了多種方法建立了免疫性肝損傷模型[14]。BCG＋LPS是常用的免疫性肝損傷模型。BCG可使多形核中性細胞、單核巨噬細胞聚集于肝臟，其后用低劑量LPS攻擊，可激發這些細胞釋放一些對肝細胞有毒性作用的炎癥介質如氧自由基、白三烯和細胞因子TNF-α、IL-1等，從而造成類似人類肝病免疫性肝損傷[8，15]。它是篩選保肝藥物的一種可靠的免疫性肝損傷模型。本實驗成功地復制了BCG＋LPS免疫性肝損傷模型。研究表明，CAE使小鼠升高的血清ALT、AST水平降低，而且明顯上調脾淋巴細胞增殖反應，恢復低下的免疫功能，表明CAE對小鼠免疫性肝損傷有明顯的保護作用和免疫調節作用，并提示CAE對小鼠免疫性肝損傷的保護作用可能與其免疫調節作用有關。
TNF-α主要是由激活的單核巨噬細胞產生的一種內源性細胞因子，具有廣泛而重要的生物學作用，肝臟中大量枯否細胞(KC)的增生活躍是TNF-α水平增加的基礎。國內外學者認為，TNF-α與病毒性肝炎關系密切，是引發急性肝壞死的重要介質[16]。TNF-α又可作為肝損傷的第一介質，引起許多與肝損傷有關的第二介質的出現，如IL-1、IL-6、IL-8及蛋白酶的產生[17]。而IL-1也是由激活的單核巨噬細胞產生的另一種內源性細胞因子，它加強TNF-α的肝損傷程度[18]，因此，本實驗檢測了PMΦs分泌TNF-α和IL-1的含量。結果表明CAE對BCG＋LPS過度激活的小鼠PMΦs產生TNF-α、IL-1有明顯的下調作用。結合體外CAE直接抑制PMΦs分泌TNF-α、IL-1研究結果，推測CAE抗免疫性肝損傷作用可能與其抑制TNF-α、IL-1等炎癥因子有關。但CAE是否直接抑制肝中的KC分泌TNF-α、IL-1等炎性因子，值得進一步深入研究。
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免疫組化技術范文3
[關鍵詞] 免疫組化；質量控制；標準化管理
[中圖分類號] R446.8 [文獻標識碼] C [文章編號] 1673-9701（2013）31-0134-03
免疫組化染色技術在現代病理診斷中的應用日益廣泛， 對各類腫瘤的確診及鑒別診斷具有重要意義，而且在腫瘤患者個體化治療、靶向治療方案的選擇及預后判斷方面越來越受到臨床醫生的青睞，已經成為病理診斷中不可或缺的輔助手段[1]。因而很多單位，包括基層醫院也開展了這個項目。隨之而來的是，免疫組化質量控制問題也凸顯出來了。這其中有實驗員操作不當的因素，也有其他的因素，如組織固定不好、試劑效價和試劑盒質量問題等等，各免疫組化實驗室質量管理水平參差不齊[2，3]。目前國內尚無免疫組化標準化管理的統一標準，因而在眾多繁雜的條件中，探索找到一個相對穩定的免疫組化質量控制的條件，即所謂的標準化管理方法具有重要意義。筆者根據本科室的實際情況，總結免疫組化室內質控管理的一點心得體會，從實驗前、實驗中、實驗后三方面淺談免疫組化室內質量控制如何實現標準化管理。
1實驗前的標準化管理
1.1 組織處理的標準化
組織處理得當是成功制片的關鍵，對免疫組化染色結果的影響尤其重要，主要包括取材、固定、脫水等環節。如果組織處理不良，那么在其后的任何階段均難以補救。組織或細胞固定的目的是使細胞內蛋白質凝固，終止或減少外源性或內源性酶的反應，防止細胞自溶，以保持組織細胞的固有形態和結構，更重要的是保存組織或細胞的抗原性，防止抗原的丟失或彌散。因此，標本應盡可能保持新鮮并及時進行固定。我們科室積極與臨床一線溝通，宣傳固定的意義、方法和要求，擬定以下標準：手術標本離體后30分鐘內，用10%中性緩沖福爾馬林固定。固定時間為小標本6～12 h，大標本12～24 h。組織取材厚度為3～4 mm，放入全自動脫水機進行脫水[4]。組織處理不好對抗原修復也產生影響，熱修復時脫片的概率將會增大。
1.2 免疫組化切片的標準化
1.2.1 玻片處理及切片厚度 用于免疫組化的玻片一般都需要進行防脫片涂膠處理，目前常用的有氨丙基三乙氧基硅烷和L-多聚賴氨酸，防脫片的效果對比其他粘附劑都要好[5]。我們采用的是L-多聚賴氨酸，效果很好。采用3～4 μm連續切片[6]，切片厚度不能過于求薄，太薄由于抗原的減少，會導致抗體陽性表達的減弱，也不宜太厚，太厚在熱修復過程中容易導致脫片。
1.2.2 抗原修復方法 福爾馬林固定組織導致組織中抗原決定簇封閉，也就是組織細胞經福爾馬林固定后，導致抗原決定簇的三維結構發生異常改變，使抗原決定簇被掩蓋或原來位于表面的一些抗原決定簇因折疊而形成隱蔽的抗原決定簇，因此抗原的理化性質發生了顯著的變化，表位空間結構改變導致許多抗原免疫活性丟失。但這一變化是可逆的，可通過抗原修復。目前抗原修復有兩種方法：酶消化法和熱修復法。
抗原修復方法的選擇關系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色結果有很大影響。有很多文獻比較了各種抗原修復方法的優劣，目前，被認為效果最好、最常用的修復方式為高壓加熱修復[7-9]。我們將微波加熱與高壓加熱的方法進行比較，發現陽性定位于細胞核的抗體，如P53、Ki-67等的核表達，在高壓修復后明顯強于微波修復，因此我們選擇高壓加熱修復，抗原修復液為檸檬酸鹽，修復時間為高壓鍋出氣后2 min自然冷卻，時間過短，抗原暴露不夠，時間過長，導致背景過深。
1.2.3 抗原修復液的選擇 加熱抗原修復緩沖液有多種如檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）、Tris（pH7～8）、EDTA（pH8.0）等，目前首選檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），優點是染色背景清晰， 適合于大多數抗體。Tris和EDTA兩種修復液對部分抗原修復效果較強，但其染色背景同時加深，如使用不當易造成假陽性結果。值得注意的是，沒有一種抗原修復液能適合于所有的抗體，檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）可作為免疫組化常規使用的抗原修復緩沖液，但也不能除外某些抗體適于用EDTA和Tris緩沖修復液。一般抗原比較難于表達的抗體多選擇后兩者。
1.3 試劑管理的標準化
1.3.1 試劑清單及使用記錄的管理 試劑的種類、公司有很多，為了方便管理，我們創建了一個“免疫組化試劑登記表”Excel電子表格，進行試劑清單的管理，簡潔又規范（圖1）。登記表的內容包括抗體名稱、類型、稀釋度、是否修復、克隆號、編號、批號、公司名稱、庫存量、有效期、接收日期、啟用日期、用完日期等，也可以根據各單位實際情況自己添加內容。所有試劑應保證在有效期內使用，只有這樣才能確保抗體的效價。因此，登記表中有效期、用完日期的記錄要求完整準確，過期試劑或者失效試劑應丟棄不用，并備注原因。每種試劑的使用情況都要記錄在案（圖2），與圖1表格建立超鏈接。下圖1為本科室免疫組化試劑登記表部分的截圖，利用Excel條件格式將不同字體顏色顯示不同指代意義，如紅色提示超過有效期等。
圖1 免疫組化試劑登記表（部分）
圖2 試劑盒使用記錄表（圖1中超鏈接）
1.3.2 冰箱溫度控制及試劑的擺放 所有的試劑均應在試劑公司建議的溫度下保存，儲存試劑的冰箱應每天檢查，建立一個冷藏冰箱溫度監測表，并按時記錄溫度值。不管是濃縮型還是即用型試劑，如果是一堆地放在冰箱里，要用或配置的時候找起來比較麻煩費事，我們自己設計制做了幾個試劑擺放的木架子，將免疫組化試劑按首字母AZ排列，同系列的按數字從小到大依次排列，如Actin、AFP、Bcl-2、CA125、CD10、CD117等依次排列（如圖3所示），這樣找試劑比原來方便許多，節省時間，看起來也比較整潔。
圖3 試劑的擺放
圖4 陽性與陰性對照
1.3.3試劑配置 免疫組化的試劑分為即用型和濃縮型兩種，濃縮試劑的配置，需要對抗體滴度（稀釋比）進行評估。我們參考公司推薦的抗體滴度，在其前后各增加一個實驗滴度，如公司推薦1∶200，我們配置1∶100、1∶200、1∶400三種滴度，進行預實驗，以觀察陽性細胞染色強度及非特異性染色，驗證試劑的可靠滴度，然后才能在常規的實驗中應用。
2實驗中的標準化管理
2.1 檢測方法的選擇
免疫組化的檢測方法有很多種，大致分為生物素型和非生物素型兩大類。因組織中含有內源性生物素，所以會干擾免疫組化的染色結果，在生物素型檢測方法的操作過程中，要阻斷內源性生物素干擾。非生物素型聚合物檢測，可以有效地防止內源性生物素的影響，并且靈敏度高，操作簡便，為很多實驗室采用，是目前免疫組化標準化染色的首選方法。我們采用的是非生物素型EliVision二步法，檢測方法比較穩定，效果也好。
2.2 免疫組化染色操作標準化
目前，免疫組化染色分手工操作和全自動免疫組化儀操作。在手工染色過程中，或多或少要受到實驗員個人因素的干擾。全自動免疫組化儀的出現，避免了操作過程中人為因素的干擾，增加了染色結果的可靠性，有助于免疫組化質量控制的標準化管理。我們采用全自動免疫組化儀進行染色，與手工染色相比，具有以下技術優勢：①精確的抗體孵育時間控制，確保染色質量，避免背景非特異性著色。②精確的抗體濃度以及量的控制，避免因實驗員手法不同而導致抗體濃度被稀釋，影響染色強度的表達，還可以避免交叉污染和非特異性染色的產生。③二維碼的識別，可以使滴加試劑的時候不會產生滴錯的現象，避免人工滴加錯誤，導致假陰性或假陽性結果的發生。④可根據實驗員的工作需要，統籌安排，能更加合理高效地利用時間。⑤程序結束后可以保存整個進程，如果出現問題，可以在實驗結束后復審，以便查找出問題的原因[10]。
2.3 陽性與陰性對照
每一次免疫組化染色必須嚴格設立陽性對照和陰性對照[11]。我們的方法是，每個抗體都備有一個陽性對照的小蠟塊，陽性對照小蠟塊的準備：取材的同時，從大體標本中重新取材，制作成大小約為0.4 cm×0.3 cm×0.3 cm的組織塊，一起脫水包埋。時間應控制在48 h之內，用以保存組織抗原；常規HE切片染色，鏡下觀察有癌組織后，進行所需抗體表達測定，評估適合作為陽性對照后放置備用。陽性對照小蠟塊主要目的針對試劑的不同批次、重新配置、滴度預試驗等，用來評估試劑的可靠度。在實驗過程中將待測組織與陽性對照小蠟塊組織裱于同一張切片（圖4），PBS代替一抗作為陰性對照，然后進行染色，實驗結果更可靠、更節約成本，這一方法值得推廣應用。
3實驗后的標準化管理
3.1 染色結果判斷的標準化
免疫組化切片應是陽性標記強而非特異性染色淡或無，兩者形成鮮明的對比，陽性表達必須在細胞或組織特定的部位，細胞邊界清楚；每批染色都要有陽性對照、陰性對照和自身對照才能對染色結果作出正確判斷。判斷標準常根據陽性細胞的百分比或陽性細胞的染色深度來判斷，其顏色深淺反映抗原量的多少。免疫組化染色結果還要結合組織形態學判斷是真正的陽性染色而非其他著色。陽性反應分布總是有規律、局限、定位準確和一定形態特征的，如細胞膜著色呈圓形；典型的細胞核著色為均質狀，核仁和染色質呈顆粒狀著色。細胞漿呈顆粒狀（位于細胞器）或纖維狀（中間絲或微絲）或彌漫片狀（細胞內液、病毒顆粒及吸收蛋白）著色；細胞間質呈纖維條塊狀著色；若陽性結果定位異常象征著疾病過程。非特異性著色為無規律、無界線、定位不準確且不能重復；結締組織受染和內源性生物素干擾是最常見的非特異性著色，鏡下為均勻細顆粒狀的淺棕色，但不會出現在細胞膜或細胞核。
由于免疫組化染色結果是定性指標，不能定量，染色結果判斷受到診斷醫師的主觀因素影響而導致結果差異。為了減少這種差異的發生，我們科室內部采用統一的免疫組化染色結果判定標準，嚴格按照公認的分級標準進行判定，如乳腺癌ER、PR采用Bessley分級法[12]，C-erbB-2采用美國臨床腫瘤協會（ASCO）/美國病理學家學院（CAP）HER2檢測指南等[13]。
3.2 實驗結果的跟蹤、記錄
每批次的免疫組化結果，進行質量跟蹤記錄，對于特別異常的結果，應該分析原因。是新購試劑，還是新配試劑，或者是操作過程中有無異常；全自動免疫組化儀染色的可以把程序調出來復審，然后備注分析的原因，重新設立陽性對照再染色，觀察效果，直到問題解決為止。對于一些單位來說，配置的濃縮試劑，在經過一段時間后，也要進行陽性強度的評測，以防止配置時間過長后效價的降低，導致陽性強度的減弱。
3.3 試劑的庫存管理
實驗結束后，需要在“免疫組化試劑登記表”中，對于使用的試劑進行數據的更新，以便及時更換采購試劑。
3.4 實驗室的清潔、整理
清潔工作場所內的臟污，必要的東西分門別類以一定的順序放置，保持工作場所干凈、整潔。對于使用過的儀器，做好儀器的日常維護，記錄使用情況。另外，實驗室的衛生對于實驗人員也有一定的安全保護作用。
4 討論
免疫組化質量的好壞影響的因素方方面面。要確保免疫組化結果的可靠性和穩定性，加強免疫組化室內質量控制管理，制定相應質控標準尤其重要。筆者結合本科室的實際情況，對實驗前、實驗中和實驗后三個層面可能影響免疫組化染色結果的因素進行分析、總結，制定本科室免疫組化室內質控管理相關細則，在日常工作實踐中得到檢驗。我們發現，標本及時用10%中爾馬林固定，取材大小適當，組織良好的脫水，切片的厚度適宜并做防脫片處理，選擇高壓熱修復，抗體效價的評估，采用全自動免疫組化儀代替手工操作，并做陽性與陰性對照，依照公認的免疫組化判斷標準等因素，是一個相對穩定的免疫組化室內質量控制的條件。各個環節制定相應的質控標準，以達到標準化管理目標。另外每個實驗室應當建有本實驗室免疫組化檢測的SOP文件，所謂的SOP是指 Standard Operation Procedure三個單詞中首字母的大寫，即標準作業程序，就是將某一事件的標準操作步驟和要求以統一的格式描述出來，用來指導和規范日常的工作。定期做好實驗室室內質量控制，真正把SOP文件應用到實際工作中去。每一個實驗人員在進行免疫組化操作的時候，也應該有嚴肅的態度和高度的責任心，才能在制片過程中做到一絲不茍，才能做出優秀的切片。制度化、規范化操作是實現標準化操作的前提條件[14，15]，全自動免疫組化儀器的使用是必要手段，陽性和陰性對照的設立是結果可信的可靠保證，穩定良好的染色質量和可靠的結果判讀才是免疫組化質控標準化管理的最終目的。
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免疫組化技術范文4
【關鍵詞】 西雙版納地區； 熱帶雨林氣候； 免疫組化； 影響
doi：10.14033/ki.cfmr.2017.2.027 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2017）02-0053-02
病理診斷的金標準發展至今，其輔助手段也隨之得到了良好的發展，如免疫組化就是最好的輔助手段，但免疫組化很嬌嫩，對地域的要求因海拔的不同而有所改變，所以要根據不同的地域控制時間的長短，不斷提高其質量，使它更好地為診斷服務[1]。免疫組織化學技術的原理是對組織切片或細胞標本中的某些化學成分進行原位的定性、定位或定量研究的技術[2]。已有研究表明：修復液的溫度和作用時間對修復效果有決定性的作用，溫度越高修復時間越短，在昆明地區（海拔為1800 m左右）修復時間為30 min，但在低海拔地區西雙版納州景洪市就只為21 min[3]。
1 材料與方法
1.1 實驗地氣候
本實驗在海拔550 m、大氣壓為94.29 kPa、水沸點97 ℃～98 ℃、西雙版納景洪市進行。西雙版納位于北緯21°10'～22°40'，東經99°55'～101°50'，最高海拔2429.7 m，最低海拔477 m，相對高差1952.7 m。是世界上北回歸線附近保存最為完好、面積最大的熱帶雨林。景洪市屬于低海拔（約500 m），年平均氣溫（18 ℃～21 ℃）高，濕潤（年降雨1100～1900 mm）的地區，筆者率先在西雙版納州成功開展了第1例免疫組化，并通過筆者所在科2013年至今開展的200多例免疫組化結果對照，并與其他地區進行比較。
1.2 材料
10%中性甲醛固定，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，組織分別為鼻咽鱗狀細胞癌、甲狀腺狀癌、胃神經內分泌癌、淋巴結反應性增生。各蠟塊分別切片5 μm，按照免疫組化步驟（Elivision法，試劑來源于Dakota公司）。
1.3 免疫組化操作過程
（1）石蠟涂片脫蠟和水化后，用PBS（PH714）沖洗3次，每次3 min。（2）根據每一種抗體的要求，對組織抗原進行相應的修復。（3）每張涂片加50 μl 3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min。（4）每張涂片根據需要加50 μl的第一抗體（如CD20、CD3、CD45RO、CD45RB、TdT，MPO、CD5、CD56、CD79a、CD43、CD5、CD10），室溫下孵育60 min。（5）除去PBS液，每張涂片加50 μl聚合物（polymer enhancer），室溫下孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min。（6）除去PBS液，每張涂片加50 μl酶標抗鼠/兔聚合物（polymerized HRP-AntiMs/RbIgG），室溫下孵育30 min PBS沖洗3次，每次3 min。（7）除去PBS液，每張涂片加50 μl新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3～10 min。（8）自來水沖洗，蘇木紫復染，鹽酸分化，自來水沖洗，PBS返藍。（9）涂片經過梯度酒精脫水干燥，用DAE顯色，中性樹膠封固。
2 結果
修復時間20 min時（此時間為Dakota公司在其他地區用的傳統時間），組織著色，陽性結果不顯著，背景清晰；修復時間19 min時（比傳統時間少1 min）組織已經著色，陽性結果不肯定，背景清晰；修復時間21 min時（比傳統時間多1 min），組織著色，陽性結果顯著，背景清晰，而且組織無脫落，修復時間22 min時（比傳統時間多2 min），組織著色，陽性結果顯著，背景清晰，但組織已部分脫落，具體見表1。鏡下表現如下，
圖1：胃神經內分泌癌SYN免疫組化染色，pH 9.0，1 mmol/L EDTA中煮沸30 min，胞漿強陽性染色，部分區域組織脫落（×200）。圖2：
淋巴結反應性增生CD20免疫組化染色，pH 6.0，0.01 mmol/L在檸檬酸修復液中高壓煮沸20 min，胞膜強陽性染色，背景清晰（×200），圖3：鼻咽低分化鱗癌HCK免疫組化染色，pH 6.0，0.11 mmol/L檸檬酸修復液中煮沸20 min，胞漿強陽性染色，部分區域組織脫落（×200），圖4：甲狀腺狀癌免疫組化染色，pH 6.0，0.01 mmol/L在檸檬酸修復液中高壓煮沸20 min，胞膜強陽性染色，背景清晰（×200）。
3 討論
眾所周知，抗體與抗原之間的結合具有高度的特異性[4]。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細胞中的某些化學物質提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結合，將抗原放大，由于抗體與抗原結合后形成的免疫復合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學方法將抗原抗體反應部位顯示出來（常用顯色DAB顯示為棕黃色顆粒）[5]。通過抗原抗體反應及呈色反應，顯示細胞或組織中的化學成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學成分的分布、含量[6]。組織或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質，如蛋白質、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測[7]?？乖男迯屯ǔＳ形锢硇迯图盎瘜W修復，目前的國內根據不同的抗體主要的修復方法有：高溫高壓.胰酶修復、胃蛋白酶修復、EDTA修復，免疫組化技術都要求在高溫高壓下進行的[8]。隨著精準醫療的理念，免疫組化也走進了大大小小的醫院，成為診斷的好朋友。目前市場上的試劑很多，選擇適合自己的很重要，也要根據自己地區的實際情況探索最佳方法。
本驗結果顯示，高溫高壓修復法是一種比較實用的抗原修復方法，特別是對于標本數不是特別多的基層醫院。只是要根據本地區的海拔不同有所不同，要找到適合時間才能有好的效果。在低海拔地區西雙版納州景洪市就只為21 min，可以推廣運用。
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免疫組化技術范文5
免疫組織化學技術是常規病理診斷中不可缺少的重要手段，盡管試劑盒及自動免疫組化儀的使用使免疫組化結果陽性率大幅提高但由于免疫組化染色步驟繁多，不同的實驗室操作程序不同，結果都有所差異。影響免疫組化切片質量控制的幾個主要因素有：組織的固定、切片的制作、適宜的溫度，抗原的修復。
組織固定
組織的正確固定可以防止細胞在自身溶酶體的作用下溶解破壞。用于免疫組化染色固定的重要意義是保存組織細胞的抗原性，使抗原不發生彌散和抗原性喪失。若固定不良在以后的過程中將無法糾正。通常使用4%的中性緩沖福爾馬林作為固定劑，固定液量要充足，一般為組織塊總體積的4～5倍。盡快固定，時間8～48小時，穿刺活檢標本應盡量固定6小時以上，條件不允許的情況也不能少于1小時。
切片的制作
免疫組化切片必須用防脫片，切片厚度以3～4um為宜，薄而平整。切片攤片時組織裱在載玻片的位置非常重要，如果試劑覆蓋不到組織就會出現假陽性和陰陽“臉”的現象。組織盡量裱在載玻片中位。采用60℃恒溫烤片機烤片1小時以上。時間過短會造成脫片。用于脫蠟的二甲苯要經常更換，保證脫蠟徹底。滴抗體前用免疫組化筆在組織上方下方化橫線，劃線時不要緊靠組織，以免染色時產生邊緣效應?？贵w滴量設置一般80μl，組織過大或附陽性對照是抗體滴量設置比平時量多20μl即可。
保持適宜的溫度和實驗室溫
蠟塊制備時石蠟應不超過62℃，最好用熔點低的石蠟。實驗室溫度以25℃為基準，空氣溫度在40%以上。室溫過低會影響抗原、抗體的結合，導致假陰性；溫度太高，室內空氣干燥會導致抗體孵育過程中干片，實驗失敗。如果實驗室溫度過低，可以適當延長孵育時間，溫度過高，可適當縮短時間，同時增加空氣溫度。為防止以上現象的發生，將整個過程把切片放在濕盒中再置于37℃恒溫水浴箱中進行可以防止切片干燥而導致失敗，又能解決對實驗室溫度難以達到要求的問題。
抗原的修復
組織經福爾馬林固定經常會引起蛋白質結構的改變而導致抗原決定簇被封閉，阻礙了抗原、抗體的結合。采用適合的抗原修復技術使抗原決定簇充分暴露，可以提高抗原的敏感性，染色結果要強于不修復。常用的抗原修復技術方法有微波加熱修復法、高溫高壓修復法、酶消化法。推薦方法：微波抗原修復法，抗原修復液以檸檬酸緩沖液(PH6.0)為佳。即微波高溫加熱3分鐘后(加熱至沸騰，92℃～95℃)，勿拿出切片待20分鐘后溫度降至室溫，用PBS液沖洗3次后進行下一步驟。
制片質量的好壞直接影響著診斷的準確性，正確的操作是病理技術質量控制的基礎。因此每位病理技術工作者都應認真對待制片的每個環節。
參考文獻
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免疫組化技術范文6
[關鍵詞] 脫鈣液；骨組織；免疫組化染色
[中圖分類號] R446.4+1 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673—9701（2012）24—0101—03
骨組織內含有大量無機鈣鹽，結締組織堅硬，難以直接制片[1]。如果強制切片，在藍色鈣鹽背景下，往往無法看清細胞結構，所以需要選擇一種能保持骨組織形態結構和染色后有利于保持細胞結構清晰度和對比度的脫鈣液。本文研究14%（體積分數）硝酸脫鈣液、EDTA脫鈣液、PLANK脫鈣液對骨組織免疫組化染色的影響，以期尋找一種效果比較理想的脫鈣液，對病理診斷工作提供幫助。
1 材料與方法
1.1 標本選擇
12例骨組織標本均來源于我院，切成1 cm×1 cm×0.3 cm的骨塊，在福爾馬林中性液內固定24 h，用于脫鈣及免疫組化染色實驗。
1.2 三種脫鈣液
①脫鈣液Ⅰ：14%（體積分數）硝酸脫鈣液，配制方法為14 mL濃硝酸加入86 mL蒸餾水；②脫鈣液Ⅱ：EDTA脫鈣液，配制方法為EDTA10 g，蒸餾水100 mL，加NaOH充分攪拌溶解，在用10 mol/L的HCl調pH為8.0，最后加入4%甲醛15 mL。③脫鈣液Ⅲ：PLANK脫鈣液，配制方法為氯化鋁10 g，甲酸50 mL，10%福爾馬林10 mL，冰乙酸1.5 mL，加蒸餾水至總體積100 mL。
1.3試劑和儀器
硝酸、鹽酸、EDTA等化學試劑均購自廣州化學試劑一廠，CD3、CD68、Ki—67和TTF—1等抗體購自福建邁新公司，EnVision二步法試劑盒購自DAKO公司。切片機、染色機和切片刀購自英國shandan公司。
1.4 方法
1.4.1 脫鈣處理 三組骨組織分別按以下方法進行脫鈣處理：將12例骨組織標本平均分為A、B、C三組，并確定所選每份骨組織性質一樣，分別將A、B、C組標本放入相對應的脫鈣液中，間隔一定時間后更換脫鈣液，以標本肉眼觀察至半透明狀，手感有彈性，大頭針可順利刺進骨組織，無砂粒感為脫鈣完成，結合X射線確定脫鈣終點。接著進行石蠟切片、免疫組化染色。
1.4.2 免疫組化染色步驟 骨組織固定、脫鈣后，常規脫水、透明、浸蠟、包埋及制成4 μm厚的連續切片，裱片后進行70℃烤片1 h，脫蠟至乙醇溶液，3%（體積分數）甲醇—H2O2封閉內源性過氧化酶10 min，高壓鍋枸櫞酸緩沖液法修復2 min，加入Ⅰ抗，37℃孵育1 h，加入EnVisionⅡ抗，再于37℃孵育30 min，DAB顯色1 min，蘇木精復染（圖像分析所用的切片未染色），脫水，透片，封片，光鏡觀察。
1.4.3 免疫組化染色結果判定 CD3陽性信號位于細胞膜、CD68陽性信號位于細胞漿、Ki—67和TTF—1陽性信號位于細胞核。于光鏡下觀察三種脫鈣液脫鈣骨組織免疫組化標記的結果，未復染的切片做圖像定量分析，其方法為：將每種抗體免疫組化染色后的切片放在顯微鏡下，在同一組的每張切片相同的部位觀察10個視野（4種抗體×10=40個視野），被測物質的各種信息通過攝像機將所測目標轉換成數字圖像，傳遞到計算機系統，標定組織片空白處入射光的光密度值（OD值），在監視器上用不同的分割方法和編輯功能，計算免疫組化染色陽性細胞平均OD值，其值代表了切片中相應抗原性的相對強度。
1.5 統計學分析
圖像分析結果以均數±標準差（x±s）表示，采用SPSS 13.0作方差分析。
2 結果
2.1 不同脫鈣液對骨組織脫鈣時間及效果比較
2.1.1脫鈣時間 14%硝酸脫鈣液脫鈣時間最短。14%硝酸脫鈣液
2.1.2脫鈣效果 14%硝酸脫鈣液脫鈣效果最好。14%硝酸脫鈣液﹥PLANK脫鈣液﹥EDTA脫鈣液（表1）。
2.1.3對組織損傷 EDTA脫鈣液對組織損傷最小。EDTA脫鈣液
2.2 不同脫鈣液脫鈣對骨組織免疫組化染色結果比較
見表2 。三種脫鈣液免疫組化染色圖像結果用方差分析進行兩兩比較，其結果為硝酸脫鈣液和PLANK、EDTA脫鈣液比較有顯著性差異，EDTA脫鈣液和PLANK脫鈣液比較無顯著差異。硝酸脫鈣液對組織損傷較大，切片顏色欠鮮艷，細胞核著色弱，組織結構欠清晰。PLANK和EDTA脫鈣液脫鈣效果較好，顯微鏡下觀察組織結構完整、清晰，色澤鮮艷，對比度較好。
2.3 脫鈣后免疫組化染色效果
見表2。見圖1～3。
3 討論
脫鈣是指用化學或物理方法將骨組織中的鈣鹽和膠原纖維分離，除去鈣鹽，獲得完整的膠質纖維成分[2]。骨組織含有大量的鈣鹽和無機鹽，需經過脫鈣處理，使組織軟化后才能進行切片處理。常用的脫鈣劑主要包括單純酸類、混合酸類、螯合劑等。免疫組織化學對臨床病理檢查非常重要，因而應選擇較好的脫鈣液對所選骨組織標本進行較好的脫鈣處理，且不破壞細胞和組織結構，形態清楚，進而確保免疫組化染色的效果較好并合適臨床需要。
14%硝酸脫鈣液是常用于臨床脫鈣液之一，具有脫鈣能力最強、脫鈣時間最短等優點。但是，對骨組織脫鈣程度較難把握，容易造成過度脫鈣現象；同時脫鈣后易出現組織腫脹及細胞結構不完整清晰的不良現象。硝酸在脫鈣過程產生CO2，氣泡從組織中溢出將導致結締組織分離。另一方面，硝酸對組織進行脫鈣時還酸化組織，造成細胞核著色能力下降而返藍困難進而變成淡紅色，對比度差，由于亞硝酸形成使組織變黃而影響其后的染色[3]，在室溫條件下更明顯。硝酸在溶解骨組織鈣鹽時也對抗原物質具有破壞性，因而抗原免疫活性降低，免疫組化染色效果不佳[4]。結合本實驗驗證硝酸脫鈣液脫鈣后較易影響其后的免疫組化染色效果。
EDTA是科研中常用的脫鈣劑，能夠與羥基磷灰石結晶的外層鈣結合，同時促進內層結合鈣向外轉移，進而溶解鈣鹽，是脫鈣和免疫組化染色理想的脫鈣劑[5]。本實驗觀察到EDTA脫鈣液對骨組織脫鈣效果較好，能保持完整的組織結構，且不破壞抗原物質，免疫組化染色陽性細胞數量多、著色深、背景淡。然而，在室溫條件下，其脫鈣時間過長，脫鈣后組織稍微變硬，不太適合臨床電鏡快速診斷的要求，且其價格較貴，綜合而言不利于臨床檢查工作。目前認為，應用微波技術可促進EDTA的螯合作用，縮短脫鈣時間[6]。使用微波技術時應注意固定實驗條件、調整微波功率和時間、溫度也不能超過60℃等。
本研究表明，與硝酸、EDTA脫鈣液比較，PLANK脫鈣液具有常溫脫鈣時間較短、脫鈣效果較好，免疫組化染色著色鮮艷、對比度佳、陽性細胞數多等優點。PLANK脫鈣液[7]是一種氯化鋁、甲酸、甲醛和冰乙酸組成的混合脫鈣液，其中甲酸和溶液中的鋁離子對組織影響較小，免疫組化染色效果優良。甲醛可加強對組織的固定并具有抗酸浸蝕的作用。冰乙酸能較好保持染色體結構，并能減少酸對細胞核的破壞。其配制成分中，通過增加甲酸的濃度并用冰乙酸輔助，可以加快脫鈣速度。常溫下PLANK脫鈣液快速軟化組織，對組織抗原損傷較少，細胞結構清晰完整，加之其脫鈣時間較短、配制簡單、經濟等有利條件，較適合用于臨床檢查工作[8]。
CD3、CD68、Ki—67和TTF—1等細胞因子多在腫瘤組織中表達，快速準確的病理診斷有利于患者的臨床診治。因而，選擇合適的脫鈣液成為重要工作環節之一。本實驗通過比較14%硝酸脫鈣液、EDTA脫鈣液和PLANK脫鈣液的脫鈣和免疫組化染色效果，綜合評價認為PLANK脫鈣液較適合用于臨床快速病理診斷。
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