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流式細胞儀范文1
1 材料與方法
1.1 外周血造血干細胞 APBSC采集自經環磷酰胺（CTX）＋重組人粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF）動員后的實體瘤患者（淋巴瘤、乳腺癌），采集使用 CS3000- Plus血細胞分離機（Baxter公司，美國）。
1.2 CD34+細胞的標記 對10份 APBSC分別進行2種不同再處理與CD34標記。
1.2.1 溶血法 APBSC與CD34-PE熒光單克隆抗體（Immunotec，法國）室溫暗處反應15 min，然后用細胞裂解液溶解紅細胞，待測。
1.2.2 分離單個核細胞法 經Ficoll（相對密度1.007）梯度離心，收集界面層單個核細胞，與CD34-PE標記的單抗室溫孵育15 min，待測。
1.3 FACS檢測CD34+細胞 上述標記細胞懸液分為2管，其中一管 6 h內使用流式細胞儀（EPICS ELITE ESP， COULTER公司）測定CD34+細胞占單個核細胞（淋巴細胞和單核細胞）的百分率，另一管經 1％多聚甲醛固定， 4℃冰箱保存72 h后， FACS測定CD34+ 細胞數。
1.4 熒光標記的CD34單克隆抗體 33份 APBSC同時分別用表達第2類抗原表位QBEnd 10（ClassⅡ，Immunotec）和表達第3類抗原表位 8G12（ HPCA2，classⅢ，Becton Dickinson）的單抗進行標記，比較2組 CD34+細胞百分率之間的差異。
1.5 雙標記CD34/CD45 APBSC中同時加入抗CD45-FITC（J33）和抗CD34-PE（HPCA2），用溶血法處理細胞， FACS測定CD34+細胞。
1.6 統計學處理 用 t檢驗。
2 結果
2.1 溶血法與單個核細胞標記法測得CD34+ 細胞百分率無顯著性差異（P＞0.50）。
2.2 同一樣品經 1％多聚甲醛固定72 h后的測定值與 6 h內的測定值相比，CD34+細胞熒光強度降低，非特異吸附增加，變異系數范圍在 9.9％～49.5％之間，平均CV值為 32.2％。
2.3 APBSC標本分別用2種CD34單體標記，CD34+細胞百分率無顯著性差異（P＞0.05）。
2.4 CD34-PE／CD45-FITC雙標記測定 APBSC中CD34+細胞的百分率為 4.5％，而同一組樣品進行CD34+細胞單色標記為5.3％。
3 討論
FACS雖然對CD34+細胞的檢測具有決定性意義，但早期造血干細胞表面CD34抗原表達弱且少，標本保存（冷凍）、不同標記方法及固定劑的使用均會影響CD34+細胞結果［1］。本研究對樣品固定前、后測定，CV值明顯大于批內變異，應在 1％～ 6％，批間變異＜20％的國際質控標準［2］。樣品的2種不同處理方法間雖無顯著性差異，但溶血法較分離單個核細胞法簡單，避免了細胞損傷，使細胞回收率提高［2］，更適于臨床應用。CD34抗原表位可分為3類，其抗原表達亦有差異，應用針對不同表位的抗體測定CD 34+細胞，結果是否有差異，則報道不一［3，4］。本研究的結果表明無顯著性差異。
各實驗室對CD34+細胞標記與測定目前尚無統一的標準方法，必然會產生較大的室間差異，Lowdell 等對28份 APBSC在15個實驗室進行室間分析，結果差異很大，CD34+細胞為∶ 0.08％～19.31％，CV值為100.1％～136.6％［1］。1995年初，國際血液治療與移植工程協會（ISHAGE）成立了干細胞計數委員會，建立了一種簡單、快速、靈敏的計數CD34+細胞的方法［5］，建議雙標記CD34-PE／CD45-FITC計數CD45+細胞中CD34+細胞的百分率，因為白細胞共同抗原CD45在造血干／祖細胞上的表達明顯減弱，CD45和側向散射光（SSC）一起可以較好地把CD34+細胞和淋巴細胞、單核細胞、粒細胞、死細胞、細胞碎片、血小板團塊及有核細胞區分開［4］。此外還可以同時結合第3種熒光抗體，測定CD34+細胞亞群［5］。
應用 FACS測定CD34+細胞應遵循以下原則∶選用特異性及敏感性高的單體，CD34單抗結合PE效果要強于 FITC［6］；由于CD34+細胞表達很少，應計數盡可能多的細胞，以提高結果的準確性［7］；標本應新鮮測定；同時標記CD45，可提高檢測CD34+細胞的準確性。
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流式細胞儀范文2
關鍵詞：病毒性心肌炎，急性；T淋巴細胞亞群；NK細胞；流式細胞術
中圖分類號：R542.2 R256.2 文獻標識碼：B 文章編號：1672―1349(2007)04―0348―02
急性病毒性心肌炎(acute viral myocarditis，AVMC)的發病機制至今未完全清楚，最近，病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)與細胞免疫功能的關系頗受關注。有資料認為，病毒性心肌炎心肌病變的形成，除病毒直接作用外，還與自身免疫反應有關[1]。利用流式細胞儀對成人急性病毒性心肌炎病人淋巴細胞亞群的CD3、CD4、CD8、自然殺傷(NK)細胞等進行了檢測，現將結果報道如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料選擇2005年1月―2006年9月診斷為急性病毒性心肌炎病人23例(觀察組)，均符合診斷急性病毒性心肌炎的標準[2]。其中男9例，女14例，年齡(16～45)歲，平均27.5歲，監測前未接受激素及免疫調節劑治療。對照組選取健康志愿獻血者20名，其中女10名，男10名，年齡(24～39)歲，平均31.1歲
1.2 試劑與儀器 流式細胞儀為BD公司生產的FACSCal-ibur，離心機為法國JUNAN生產的CR422，檢測淋巴細胞亞群的CD3、CD4、CD8、NK細胞的熒光標記抗體、紅細胞溶解素均為BD提供。
1.3 檢測方法利用流式細胞分析技術進行檢測。對照組和觀察組分別于早晨抽取空腹外周血2 mL，EDTA－K2抗凝，于采血2 h內檢測。取6個試管分別加入FITC－CD45/PE－CD14、FITC－IgGl/PE－IgGl、FITC－CD/PE－CD19、FITC－CD3/PE－CD4、FITC－CD3/PE－CDk、FITC－CD3/PE－CD16＋56各20 uL，加EDTA－K2抗凝全血100 uL，混勻置室溫暗處20 min，然后加入紅細胞溶解素2 mL溶解紅細胞8min，300 r/min離心5 min，用PBS洗滌2次后，加0.5 mL含1％多聚甲醛PBS固定，待測。儀器調整良好后測標本，以FITC－IgGl/PE～IgGl作為同型對照，計數1×104個細胞。
l.4 統計學處理采用SPSS 10.0統計學軟件，數據以均數±標準差
表示，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結 果
與對照組相比，觀察組CD3的變化不明顯(P＞0.05)。CD4、Th/Tc比值明顯低于對照組(P＜0.01)，CD8、NK細胞明顯高于對照組(P＜0.01)。詳見表1。
3 討 論
病毒性心肌炎是病毒侵犯心臟引起的心肌實質或間質、局限性或彌漫性病變，其病理變化主要是廣泛或散在的心肌細胞壞死及周圍間質細胞浸潤[3]。近年來此病發病率有增高趨勢，大多數病人可完全恢復正常心功能，少數病人臨床癥狀可改善，但會遺留心功能不全，極少數病人進行性心臟擴大，可能轉化為擴張性心肌病、慢性心力衰竭、死亡或需心臟移植[4]，而該疾病至今仍無特效療法，從病理生理學角度來看，早期以心肌細胞的直接損傷為主，后期以免疫介導心肌細胞損傷為主，對其免疫機制及感染因素研究，對治療病毒性心肌炎有很大幫助。
通過分子模擬的原理證實了T細胞在心肌炎中的重要作用[5]。T細胞通過識別宿主和微生物的抗原表位而促進自身免疫反應的發生和發展。心肌損傷時，作為隱蔽抗原的肌凝蛋白就會釋放出來與免疫系統接觸，激活對它有交叉反應的T細胞，從而引發自身免疫反應。
本組研究顯示病毒性心肌炎發病過程中，病人細胞免疫檢測指標下降。細胞免疫主要包括T淋巴細胞、NK細胞和巨噬細胞等，T淋巴細胞是重要的免疫細胞，在自身免疫性炎癥中起重要作用。在胸腺中發育成熟后進人外周血中。CD為細胞分化抗原，是細胞表面的一種標記。根據T細胞不同的表面標記和功能可分為CD3、CD8和CD8亞群。本研究中的CD4、Th/TcCD4/CD8比值明顯低于照組(P
在本研究中，觀察到NK細胞明顯增殖活躍。Deguchi等[7]發現，在急性病毒性心肌炎階段，炎性細胞浸潤可分為兩個時相：第一時相即病毒感染后(3～9)d，主要為NK細胞和巨噬細胞浸潤心肌并達到高峰；第二時相在病毒感染后(7～14)d，T細胞替代NK細胞和巨噬細胞成為主要浸潤細胞。NK細胞是VMC早期最主要的炎性浸潤細胞，因其不受主要組織相容復合物分子限制，可直接作用于病毒感染心肌細胞，主要通過釋放穿孔素途徑溶解細胞，達到清除病毒的作用，并通過分泌γ干擾素(INF－γ)等細胞因子，進一步擴大反應。NK細胞的殺傷作用雖然參與了VMC的病理損害，但因其主要殺滅病毒感染心肌細胞，是VMC早期主要的抗病毒屏障，所以對心肌的病理損害是有限的。
由于利用流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群對病毒性心肌炎研究時間較短，且本研究的樣本量比較小，是本研究的不足之處，這有待在后續進一步的研究中改進提高。
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流式細胞儀范文3
【關鍵詞】 樹突狀細胞 骨肉瘤 融合瘤苗 免疫治療
0 引 言
瘤苗作為腫瘤特異性主動免疫治療方式，目的是激發啟動、調節增強機體固有的免疫功能和抗癌能力以維護機體生理平衡。它具有使機體由被動抗癌向主動抗癌轉變的特點。目前瘤苗制備中抗原負載的方法種類繁多，其中通過細胞融合技術將腫瘤細胞與抗原呈遞細胞（Antigen presenting cells， APCs）穿孔融合制成的融合瘤苗，被認為是最具可行性及臨床應用價值的一類。在當前瘤苗的臨床應用中，自體瘤苗的成功制備通常會受到疾病本身的困繞。而異體的樹突狀細胞可以從儲備的健康志愿者外周血單核細胞獲得，又可避免使所有腫瘤患者在接受免疫治療前都必須提供相當量的自身外周血的缺陷，避免了“雪上加霜”[13]。本研究中，作者應用Wistar大鼠骨髓來源的DCs與SD大鼠來源的骨肉瘤細胞UMR106通過電融合的方法進行細胞融合，制備異體融合瘤苗（DC/osteosarcom fusion cells， DOF），誘導T淋巴細胞增殖及骨肉瘤特異性CTLs。
1 材料與方法
1.1 材料 4～6周齡雄性SD、Wistar大鼠由第四軍醫大學實驗動物中心提供（合格證號SCXK軍2002005），并在無特定病原體（Specific pathogenfree conditions， SPF）條件下飼養；SD大鼠來源的骨肉瘤細胞系UMR106購自美國ATCC（American Tissue Culture Collection）。
1.2 主要儀器和試劑 MiniMACS磁性分離儀為德國Miltenyi Biotec GmbH公司產品；流式細胞儀為美國BD Phar Mingen公司產品；細胞融合儀為美國BTX公司的2001型產品；酶聯免疫分析儀為芬蘭Labsystem公司產品；rGMCSF、rIL4、rTNFα購自R＆D公司；FITC標記抗大鼠MHCⅠ、MHCⅡ、FITC標記抗大鼠CD4、CD8、FITC標記抗大鼠CD44、PE標記抗大鼠OX62、PE標記抗大鼠CD80、CD86購自英國Serotec公司；小牛血清和RPMI1640培養基為美國HyClone公司產品；淋巴細胞分離液購自上海華精生物高科技有限公司。
1.3 細胞培養與融合
1.3.1 Wistar大鼠骨髓細胞的制備 取健康雄性4～6周齡Wistar大鼠，斷頸處死，浸入750mol/L的乙醇中10min，無菌手術取出雙側股骨和脛骨，剝凈肌肉組織，用PBS洗滌2遍，剪去骨兩端，再洗滌2遍；用無菌注射器抽取5ml無血清RPMI1640，將其針頭分別從兩端插入骨髓腔，反復沖洗出骨髓直至骨變白，收入50ml離心管中，1 500r/min離心收集骨髓細胞，棄上清，沉淀細胞用5ml 無血清RPMI1640重懸，再經淋巴細胞分離液密度梯度離心，初步純化單個核細胞(Bone marrow mononuclear cells，BMMCs)，離心洗滌2次，收集沉淀的骨髓細胞。
1.3.2 DCs的培養擴增及鑒定方法 見文獻[4]。
1.3.3 骨肉瘤細胞的培養和融合 SD大鼠骨肉瘤細胞系UMR106培養在含100mol/L的小牛血清的RPMI1640培養液中，呈單層生長。分別收集培養的DCs和骨肉瘤細胞，用細胞融合儀融合，操作按說明書進行。
1.3.4 DOF的篩選 經過融合的細胞在培養瓶中生長24h后，棄去懸浮的細胞，收集貼壁生長的細胞。應用標記抗大鼠OX62單抗免疫磁珠MiniMACS分離柱篩選，標記細胞在通過置于磁場中的分離柱時，去除膜表面不表達OX62的細胞，將分離柱移出磁場，加壓洗脫，收集OX62＋細胞，去除其中未融合的腫瘤細胞，具體操作按說明書進行。
1.3.5 DOF的表型檢測 DOF培養擴增后，采用雙色熒光標記流式細胞術測定DOF表面antirat CD44（FITC）和antirat OX62（PE）的表達水平。1×106個DOF懸液用PBS洗滌2遍，采用FITC標記抗大鼠CD44染色30min，再用PBS洗滌1次，然后用PE標記抗大鼠OX62染色30min。用PBS洗滌1遍后，制成1×109個/ml濃度的細胞懸液，采用流式細胞儀進行檢測。
1.4 DOF誘導的T淋巴細胞增殖效應及其亞群分析
1.4.1 T淋巴細胞的制備 按照培養DCs的方法制備SD或Wistar大鼠的BMMCs，采用尼龍毛柱法分離T淋巴細胞。將尼龍毛柱高壓滅菌，以溫PBS洗柱，將柱內氣泡排出，置37℃、5%CO2孵箱1h。然后將BMMCs細胞懸液加至柱的上端，待柱內PBS被完全排出時，關閉下端口，再放入孵箱中60min。用溫PBS洗柱，收集洗脫液，得到富含T細胞的細胞懸液。用完全RPMI1640液、含rhIL2（100u/ml）的完全RPMI1640培養基將T細胞調整為2×106/ml， 于37℃、5%CO2、100%濕度條件孵箱培養3天，期間半量換液1次，培養液成分同前。
1.4.2 以DOF作為刺激細胞（分別將未經融合處理的DCs和UMR106作為對照），經60Co（30Gy）照射滅活，分別以空白/孔、1×103/孔、5×103/孔、2×104/孔接種于96孔培養板，每組設3個復孔，每孔再加入1×105個SD或Wistar大鼠的T細胞，終體積為200μl。在37℃、5% CO2、100%濕度條件下進行T淋巴細胞增殖；68h后，每孔加入新制MTT溶液，使其終濃度為2g/L，繼續孵育4h，終止培養；離心（1 000r/min，5min）后棄去上清，加入DMSO 150μl/孔，震蕩10min；酶聯免疫分析儀于波長490nm處檢測OD值，結果以3孔均值表示。刺激指數（Stimulating index， SI）=加刺激細胞孔OD值/不加刺激細胞孔OD值。
1.4.3 T細胞亞群分析 采用流式細胞術分別對SD和Wistar大鼠來源的T細胞，在DOF刺激增殖前后CD8+和CD4+細胞比例進行檢測。
1.5 DOF誘導的特異性抗骨肉瘤CTLs效應
1.5.1 瘤苗特異性CTLs的體外培養 調整T細胞密度為1×106/ml，接種于24孔細胞培養板，每孔1ml。DOF經30Gy的60Co射線照射后作為刺激細胞，調整DOF和未經融合處理的DCs密度為5×104/ml，分別加入上述24孔板，每孔1ml，置37℃、5% CO2、100%濕度條件下孵育7天，隔日半量換液；以DOF刺激的SD和Wistar大鼠的T細胞（DOFT）作為效應細胞，未經融合處理的DC刺激的T細胞（DCT）和單純T細胞（T）為對照組。
1.5.2 CTLs殺傷活性的MTT法檢測 收集效應細胞（DOFT、DCT和T），調整細胞密度為2×106/ml，接種于96孔培養板，每孔100μl（2×105/孔）；按不同效靶比例（E∶T分別為5∶1、10∶1、20∶1、40∶1），加入靶細胞UMR106；另設單獨效應細胞組、單獨靶細胞組和培養液空白對照組；每組設3個復孔，置37℃、5% CO2、100%濕度條件下培養48h后，每孔加入新制MTT溶液，使其終濃度為2g/L，繼續孵育4h，終止培養；離心（1 000r/min，5min）后棄，去上清，加入DMSO 150μl/孔，震蕩10min；酶聯免疫分析儀于波長490nm處檢測OD值，結果以3孔均值表示。殺傷率計算如下：
殺傷率（%）=（1-試驗組OD值-效應細胞組OD值靶細胞組OD值-空白對照組OD值）×100%
1.6 統計學處理 全部數據用計算機SPSS 11.0統計軟件處理，T細胞增殖效應、T細胞亞群分析和CTLs殺傷活性比較均采用成組t檢驗，P
2 結果
2.1 DCs的體外培養擴增及鑒定 倒置顯微鏡下可見，前3天大部分細胞呈貼壁生長，體積小、形圓，細胞邊界光滑；4～8天懸浮細胞數量增多，體積增大，細胞邊界漸趨粗糙；9～12天大部分細胞呈懸浮生長，細胞數量進一步增多，體積進一步增大，邊界可見明顯的毛刺樣突起。透射電鏡下可見細胞表面存在大量褶皺和典型的不規則突起，呈典型的DCs狀態。體外誘導后的DCs各種表型分子的表達水平：OX62為62.19％，MHC ClassⅠ為70.40％，MHC ClassⅡ為78.28％，CD80為55.58％， CD86為68.38％。
2.2 異體融合細胞DOF的表型檢測 Wistar大鼠DCs與UMR106骨肉瘤細胞以5∶1的比例混合后，加入細胞融合儀的電擊槽，細胞在融合電壓作用下發生了細胞膜之間的融合。MiniMACS分離柱篩選后的DOF，經雙色熒光標記流式細胞術檢測，CD44（FITC）和OX62（PE）雙陽性細胞比例為49.43％，見圖1。
UMR106（左），DCs （中），和DOF （右）表面antirat CD44（FITC）和antirat OX62（PE）檢測結果
圖1 雙色熒光標記流式細胞術對
UMR106，DCs和DOF進行表型檢測
2.3 DOF刺激T淋巴細胞增殖效應 以未加刺激細胞組作為空白對照。結果顯示，DOF具有較強的刺激T淋巴細胞增殖的功能。在SD大鼠骨髓來源的T細胞組，DOF在各濃度的刺激指數（SI=加刺激細胞孔OD值/不加刺激細胞孔OD值）均高于未融合的DCs和UMR106，具有顯著性差異（P0.05），各濃度DOF和UMR106的SI均顯著高于DCs的SI（P
UMR106：大鼠骨肉瘤細胞系；DCs：未加抗原致敏的樹突狀細胞；DOF：骨肉瘤細胞UMR106與 DCs經電融合獲得的異體融合細胞
圖2 DOF刺激SD大鼠T淋巴細胞增殖能力
UMR106：大鼠骨肉瘤細胞系；DCs：未加抗原致敏的樹突狀細胞；DOF：骨肉瘤細胞UMR106與 DCs經電融合獲得的異體融合細胞
圖3 DOF刺激Wistar大鼠T淋巴細胞增殖能力
2.4 T細胞亞群分析 見圖4。
2.5 DOF誘導的特異性抗骨肉瘤CTLs效應 MTT法檢測不同效靶比效應細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，結果顯示：在SD大鼠骨髓來源的T細胞
SD大鼠的T細胞組，CD8+細胞比例由誘導前的34.16%升高到74.85%；CD4+細胞比例由誘導前的59.19%降低到19.05%（左）；Wistar大鼠的T細胞組，CD8+細胞比例由誘導前的32.35%降低到25.09%；CD4+細胞比例由誘導前的63.35%升高到71.75%（右）。
組，不同效靶比條件下，DOFT組均顯示對UMR106高效特異的殺傷活性，其殺傷能力與效應細胞數量成正比，顯著高于DCT組和單純T細胞組（P0.05），見圖5。而在Wistar大鼠的T細胞組，DOFT對UMR106的殺傷活性同樣高于DCT組和單純T細胞組（P
3 討論
目前異體瘤苗的制備存在以下兩種主要策略：第一、腫瘤細胞取自患者自體，DCs來源于健康志愿者；第二、采用患者外周血來源的樹突狀細胞與已經建系的腫瘤細胞（異體）相融合。這兩種策略的優點都是顯而易見的，卻也都存在自身缺陷。本研究制備的異體融合瘤苗DOF，其腫瘤細胞UMR106來自SD大鼠，而其抗原呈遞細胞源于Wistar大鼠的骨髓組織，那么針對后面制備的兩種來源的T淋巴細胞而言，SD大鼠的T細胞與腫瘤細胞具有相同的遺傳背景，而Wistar大鼠的T細胞將視DCs為“自身”成分。為了保證DOF的融合效率，作者對先前的實驗技術[4]進行了改進，采用雙色熒光標記流式細胞術測定DOF表面antirat CD44（FITC）和antirat OX62（PE）的表達水平。盡管antirat CD44并非大鼠骨肉瘤細胞特異性單抗，但其在骨肉瘤細胞和樹突狀細胞表面的顯著表達差異[5，6]，足以在本研究中發揮有效的鑒別和標志作用。
研究結果顯示，DOF在刺激兩類T淋巴細胞增殖效應過程中均發揮了顯著作用，但亦不難看出，在以Wistar大鼠T細胞為反應細胞的實驗組，UMR106和DOF的SI之間沒有統計學差異。通過對T細胞亞群變化進行分析發現，在該增殖過程中，本該發揮主要抗腫瘤免疫效應的細胞毒性T細胞，即CD8+細胞，并未占據預期的增殖比重；而在排斥反應中處于中心地位的CD4+的效應T細胞發生了相當大幅度的增殖，而且該增殖效應必定是在克服了腫瘤抗原和同種異體抗原對CD8+細胞的刺激作用下產生的。因此，盡管CTLs效應的研究結果顯示在以Wistar大鼠T細胞為效應細胞的實驗組，DOFT對UMR106的殺傷活性仍然高于對照組，作者還是有理由推測，該組DOF誘導的CTLs效應在很大程度上缺乏抗骨肉瘤的“特異性”，取而代之的是針對同種異體抗原的排斥反應，該反應在機體內部將獲得更多效應細胞的參與，如B細胞、NK細胞和巨噬細胞等，排斥效應顯然無法與針對性地殺骨肉瘤作用緊密關聯。
在機體免疫系統功能健全的情況下，腫瘤細胞仍然能夠躲避被識別和殺滅，其中最主要的機制包括以下兩個方面：一、主要組織相容性抗原復合體（MHC）分子異常；二、第二信號系統障礙。瘤苗的制備就是試圖通過對腫瘤細胞的人為改造，來糾正機體在自體腫瘤細胞面前的此種無奈。由于MHC限制性機制的存在，CD8+T細胞只能識別靶細胞表面與自身相同的MHCⅠ類分子和抗原肽段形成的復合物，而CD4+T細胞只能識別靶細胞表面與自身相同的MHCⅡ類分子和抗原肽段形成的復合物，盡管有研究強調兩類MHC分子之間的交叉呈遞作用[7]和腫瘤細胞之間所謂“共同抗原”（common antigens）的存在[8]，本研究仍然不主張在不同個體之間對提供靶抗原的腫瘤細胞作交叉使用；而以B7、ICAM為代表的共刺激分子和其他一些在活化T細胞中發揮作用的表型抗原，是人類免疫系統活化過程中一類通用的信號分子，即使其來源于異體組織，仍然不會泯滅其功效。
那么在選擇異體瘤苗制備方案時，本研究結果支持最佳候選細胞為患者自身腫瘤細胞，而抗原呈遞細胞（例如樹突狀細胞）可以來源于健康志愿者。盡管該方案仍將不可避免地面臨前面所提到的以原代腫瘤細胞培養為例的諸多困難，但從免疫治療功效本身來衡量，該方案顯然具有更好的應用前景和開拓價值。
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流式細胞儀范文4
目的: 建立流式微球載體技術（FMA）檢測腎綜合征出血熱（HFRS）患者血清抗HFRS 病毒特異性抗體IgM和IgG及細胞因子含量的新方法。方法: 選擇28例臨床確診的HFRS患者及20例健康人血清標本， FMA定量檢測抗HFRS 病毒IgM和IgG; 定量檢測細胞因子IL6和TNFα。檢測結果與ELISA法進行比較。結果: FMA檢測HFRS患者抗HFRS病毒IgM和IgG的陽性率分別為92.85%和71.43%， 健康對照組的抗體陽性率（假陽性率）為0; HFRS患者血清IL6和TNFα的含量分別為(532.62±397.19) ng/L和(392.68±177.68) ng/L， 明顯高于健康對照組（38.77±20.32）ng/L（P
【關鍵詞】 腎綜合征出血熱; IL6; TNFα; 流式細胞術; 免疫酶技術
［Abstract］AIM: To establish a flow microbeads assay (FMA) to examine the level of hemorrhagic fever with renal syndrome virus (HFRS V.) specific IgM， IgG and cytokines in HFRS patients. METHODS: Serum samples from 28 cases of HFRS and 20 healthy controls were studied. Serum levels of antiHFRS V. antibodies were qualified and inflammatory cytokines IL6 and TNFα were quantified by FMA. The results were compared with the results by ELISA. RESULTS: FMA showed that the positivity rates for antiHFRS V. IgM and IgG were 92.85% and 71.43%， respectively. None was detected positive in healthy control group. The serum level of IL6 and TNFα in HFRS group were (532.62±397.19) ng/L and (392.68±177.68)ng/L， respectively， which were significantly higher than that in healthy control group (38.77±20.32 ng/L and 15.91±6.91 ng/L， P
［Keywords］hemorrhagic fever with renal syndrome; IL6; TNFα; Flow cytometry; immunoenzyme technology
腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome， HFRS）是由HFRS病毒引起的自然疫源性急性病毒性傳染病。臨床上， 檢測特異性IgM、 IgG和細胞因子的方法仍以ELISA法為主， 該技術是以包被在酶板上的抗原(或抗體)與標本中的抗體（或抗原）反應， 形成抗原抗體復合物， 再用酶標二抗和酶底物顯色， 通過酶標儀檢測。該方法的靈敏度存在缺陷， 并且是一種非均相法檢測， 必需將未結合的抗體和酶標二抗分離出去后才能進行讀數， 因而增加了操作時間、 操作步驟和系統誤差。
流式微球載體技術 (flow microbeads assay， FMA) 是利用流式細胞術（FCM）和高聚分子微球載體技術檢測可溶性生物分子的新技術。原理是在聚苯乙烯微球上進行抗原抗體反應， 用熒光物質標記的二抗為示蹤劑， 通過流式細胞儀進行檢測。該方法靈敏度高， 可作均相法分析， 減少了操作步驟和時間。我們采用FMA檢測HFRS患者血清異性IgM、 IgG及細胞因子含量， 并與ELISA方法進行了比較。
1 材料和方法
1.1 材料
陜西省疾病預防控制中心病毒研究室提供的HFRS患者血清28例， 其中男18例， 女10例， 年齡17～52歲， 平均年齡30.6歲。FACSCalibur流式細胞儀、熒光校準微球（Flow check）購自美國BD公司。FMA 試劑盒由比利時魯汶大學醫學院饋贈。HFRS病毒抗體定性檢測試劑盒主要成分包括: 基因工程重組漢灘病毒抗原包被聚苯乙烯微球， 熒光素（FITC）標記羊抗人IgM和IgG， 陰性對照血清和陽性對照血清。人IL6和TNFα試劑盒主要成分包括: 鼠抗人IL6或TNFα抗體包被聚苯乙烯微球， 熒光素（FITC）標記鼠抗人IL6和TNFα抗體， 不同濃度梯度的IL6和TNFα標準品。腎綜合征出血熱病毒 IgM、 IgG檢測試劑盒購自北方生物技術研究所， IL6、TNFα生物素親和素酶聯免疫技術法檢測試劑盒購自晶美生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 FMA檢測血清特異性抗體
（1）血樣采集: 空腹抽取HFRS病人和健康人靜脈血2 mL， 分離血清，-20℃保存。（2）檢驗方法: ①管1空白對照: 只加微球載體。管2零標準管: 加微球載體和標記抗體。管3 陰性對照。管4 陽性對照。管5此管開始為待測樣本管。②加微球載體: 各管加樣本稀釋液100 μL。所有管加微球載體10μL/管 ， 輕柔震蕩混勻。③加待測樣本: 管3加陰性對照10μL、 管4加陽性對照10μL。待測樣本管加待側樣本10μL， 輕柔震蕩混勻， 置2～8℃孵育 20 min。④清洗離心: 加PBS 4 mL/管， 3 000 g離心6 min。棄上清， 存留管底微球沉淀約100 μL。⑤標記從管2開始， 各管加標記抗體10μL， 震蕩混勻， 置2～8℃ 、 避光20 min。⑥分析每管加PBS 0.4 mL， 輕柔震蕩混勻后上流式細胞儀分析: 上機檢測前， 用熒光校準微球校正流式細胞儀光路和流路， 使變異系數值（CV）在2.0之內。依次上樣， 計數>500， 得到每個測定樣本熒光強度。（3）結果判定: ① 臨界值（cutoff值）計算: 臨界值=陰性對照熒光強度值×2.1。②陽/陰性結果判定: 測定樣本熒光強度值≥臨界值為抗體陽性。測定樣本熒光強度值
1.2.2 FMA檢測血清IL6和TNFα的含量
設置空白對照: 只加微球載體。零標準管: 加微球載體和標記抗體和標準品管。標準品管最終濃度分別為800、 400、 200、 100、 50 ng/L， 用Weitongcount制作標準曲線。操作步驟詳見產品說明書。
1.2.3 ELISA法檢測血清特異性抗體及IL6和TNFα的含量
按照試劑盒說明操作。血清IgM和IgG檢測結果判斷采用目測法， 根據顯色深淺判陽性或陰性。IL6和TNFα檢測結果: 在酶標儀上檢測吸光度值， 用CurveExpert1.3統計軟件， 繪制標準曲線， 并計算標本中細胞因子含量， 其IL6和TNFα濃度以ng/L表示。
1.2.4 統計學分析
應用SPSS10.0統計軟件包進行統計分析。IgM、IgG、IL6和TNFα的表達水平， 符合正態分布以x±s表示。兩組樣本間均數的比較， 采用t檢驗; IgM和IgG陽性率比較采用χ2檢驗; 將IL6和TNFα做相關分析， 計算相關系數（r）和P值， P
2 結果
2.1 FMA與ELISA方法檢測血清特異性抗體
結果見表1、 2。經χ2檢驗， 兩種方法的陽性率比較差異無統計學意義（χ2=1.33， P>0.05）， 兩種方法符合率IgM和IgG均為11/14=78.6% ， 兩種方法高度相關。FMA檢測血清抗體結果見圖1， 其中IgM兩組比較P
2.2 FMA與ELISA方法檢測血清IL6和TNFα的含量
ELISA法結果見表3， FMA法結果見表4， 圖2?；颊吆徒】等吮容^P0.05）; IL6 的r值為0.215， P值為0.461（P>0.05）， 兩種方法比較均無相關關系， 提示二者無明顯統計學意義。表3 ELISA方法檢測血清 IL6和TNFα的含量（略）表4 流式微球載體法檢測血清 IL6和TNFα的含量（略）
3 討論
研究表明， 人群感染HFRS病毒后僅少數人發病， 大部分人呈隱性感染狀態， 患者感染后抗體出現早， 發熱1～2 d即可檢測出lgM抗體， 第7～10天達高峰; 第5～7天可檢測出lgG抗體， 第14～20天達高峰。
在不同的抗體成份中， 對機體起免疫保護作用的主要是由漢灘病毒G1和G2糖蛋白刺激產生的中和抗體和血凝抑制抗體。細胞免疫在對HFRS病毒感染的免疫保護中同樣起重要作用。一些細胞因子的水平在HFRS的不同病期也有明顯變化［1］。
ELISA法常被用于IgM、IgG及細胞因子等檢測， 但因所需樣品量大、精確度小、費時等， 并且一次只能檢測一種成分， 這些都限制了方法的檢測范圍與前景。傳統的FCM因只能檢測顆粒性物質， 因而限制了流式細胞術的使用。FMA法有機地整合了有色微球、激光技術、流體力學、高速數字信號處理器和計算機運算法則， 在各種應用中的檢測結果與傳統的ELISA基本一致， 但有著ELISA無法比擬的優越性: ①通量大; ②標本利用率高; ③特異性強; ④敏感度高， 動力學范圍寬; ⑤液相反應; ⑥節約人力資源; ⑦重復性好。此外， 吳煦等采用流式免疫微球芯片技術分析特異性血小板自身抗體及其他物質， 與微孔板改進抗原捕獲ELISA（MACE）進行比較， 兩種試驗結果高度相關［2］、穩定性和重復性較好［3］、精確度較ELISA 要好， 能同時進行多個成分的分析［4］。
我們將FMA應用到HFRS患者血清異性IgM、IgG及細胞因子含量的檢測， 采用間接免疫熒光FMA定量檢測人血清中HFRS病毒抗體IgM和IgG; 采用雙抗體夾心免疫熒光FMA定量檢測人IL6和TNFα， 檢測結果與ELISA法進行比較， FMA檢測HFRS患者抗HFRS病毒IgM和IgG的陽性率分別為92.85%和71.43%， 健康對照組的抗體陽性率（假陽性率）為0; HFRS患者血清IL6和TNFα的含量分別為（532.62±397.19）ng/L和（392.68±177.68）ng/L， 明顯高于健康對照組（38.77±20.32） ng/L（P
在我們檢測的患者中， 兩種方法檢測IgM的檢出時間均為發病第2天， 高峰均出現在發病第4～7天， IgG檢出時間均為發病第4天， 高峰均出現在發病第7～14天， 而這與以往的研究結果不完全相同。兩種方法不同的是FMA法檢測IgM、IgG可以定量， 而ELISA法不行。兩種方法檢測血清IL6和TNFα的含量比較， IL6顯著增高時間均為發病第4天， 高峰均出現在發病第4～7天， TNFα顯著增高時間均為發病第2天， 高峰均出現在發病第2～4天， 且IL6和TNFα的濃度呈正相關。這與江振友等［5］實驗結果趨勢相同。細胞因子在HFRS發病機制中所起的重要作用在國內外研究中多有論述。但采用FMA法于以上指標的檢測尚未見報道。本實驗結果HFRS患者血清中IL6和TNFα含量較健康對照組明顯升高， 推測HFRS患者發熱、 出血和腎臟損害等病理表現與細胞因子大量產生密切相關。
綜上所述， 利用FMA對HFRS病人血清異性IgM、IgG及細胞因子含量的檢測， 克服了以往ELISA法檢測技術的缺陷， 提高了HFRS檢測的準確度和重復性， 該方法可以更好的用于臨床， 推動HFRS檢測的研究與應用。并在HFRS發病機制的探討、 診斷及預后評價中有一定意義。
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流式細胞儀范文5
去年的七月剛剛畢業的我來到了自己工作的地方唐山中厚板材有限公司。帶著對學校的戀戀不舍，對自己未來的夢想和滿腔的熱血來到了公司。在勞資科人員的幫助下，我簽完了合同，并領了自己的行李，住進了我們的職工宿舍，工作人員非常熱心的幫助我們，使我感覺自己不是在異地他鄉，好像是在自己的家，同宿舍的人都是我們學校的，有的還認識，我們都心情非常的激動，馬上就能自己掙錢了，也可以讓父母放心了。
今天是我成為正式職工的第一天，早上起來自己轉了轉廠區，廠區還真大，各種設備都在運行著，我也不知道都是什么車間。我心想新廠子就是不一樣，看看干凈的廠房和廠區街道，感覺不像是在鋼鐵企業，在我的印象中鋼鐵廠都是粉塵多、噪音大、漫天的紅煙，在這你根本看不見那些情況。下午勞資的工作人員給我打電話說要給我們分派工作，就是實習崗位，我們還很納悶，昨天還說不知道什么時間才能給我們安排，怎么今天就安排了，而且聽語氣很著急，我們就去開會了。
首先，對我們實行了安全培訓，我們公司實行的是三級安全教育，就是公司先進行安全培訓，陪訓結束了進行安全考試，通過了才派到各個部門，進行二級安全教育。各部門在進行安全培訓，考試通過了派到車間，車間進行三級教育，通過了才可以上崗。我們就是走的這樣的程序，公司的安全教育機制很好，這樣使職工安全得到了保障，什么危險什么不危險自己心中都有了底，工作時也不會犯安全的錯誤。無論是公司的安全陪訓還是車間的陪訓，給我們講解的都非常的詳細。還用各種例子增加我們對安全的認識，安全陪訓結束了，為我們發了勞動保護用品、手套、衣服、鞋等。并給我們分配了實習崗位，我被分到了煉鋼部的精整工段，我開始還不知道精整是干什么的，以前也去過鋼鐵廠，可也沒聽說有這個工段呀。反正明天上班就知道是做什么的了，先好好的休息，為明天的工作養足精神，也給同事一個好的印象，也給自己一個好的開始。
早上由工作人員把我們領到工作的地方，安全陪訓結束之后，帶我們熟悉了一下場地和工作。上了兩天白班，我們就被分到了各個班組和他們一起工作，我先學習噴號，就是往鑄坯上噴上爐號、型號、定尺等；等熟練了之后，班長交我外售、上賬、發坯子等，在這我實習了三個月，學到了很多東西，這里屬于連鑄和軋鋼之間，是連接兩部非常重要的地方，這主要是對連鑄出來的坯子記上爐號、定尺、型號等，對需要修理的鑄坯進行修理，需要緩冷的進行緩冷，連鑄出的坯頭、坯尾進行切割。軋鋼需要什么坯子我們就給他找什么樣的，其實我們就是為軋鋼服務的。這段時間我們發現了很多問題，我們外售的坯子，有一段時間返回來了好幾塊，我看了看，這些坯子不是縱裂就是橫裂，有的甚至直接斷了，鑄坯怎么會這樣。想了很久也沒想明白，如果原因不找出來，生產的成本就會增加，就會影響經濟效益，如果發到各戶手里，對以后也會早成影響。還好公司很快解決了這個問題，具體怎么解決的我就不知道了，后來出的坯子很少出現那種情況了。其實在精整噴號的工人挺辛苦的，剛出來的坯子有六七百度，非常的熱，噴號的時候非常的烤，戴面照都熱，公司給我們發冰棍，冰箱里每天都有，公司為工人想的可真周到。我在這里了解了各個型號的船板鋼，lrah36、ab/a、ldh36、q235、q345等等，我知道我們公司主要生產船板鋼，由于軋鋼二期還沒有建成，賣一部分鑄坯，主要是賣到上海，有些賣到國外。我發現這里有一點小問題，接的坯子是一個數目，往軋鋼發的又是一個數目，有的坯子找不到，有的坯子還多。一些不夠尺寸的坯子軋鋼不要，很大一部分就切廢品了，這不是浪費嗎？可以賣給一些小企業，我想怎么也比作廢強。還有一些有裂紋的坯子，他們就化點鋼水添上，打平了就發給軋鋼，能壓出合格的板子嗎？我都不知道他們在糊弄誰。三個月的時期到了，我被調到鐵區了，離開了我工作三個月的地方，又來到了一個新的地方。
實習快結束的時候，公司為我們新來的100多名大學生開了個迎新晚會，公司的各位領導對我們非常的重視，特意抽出時間為我們舉辦晚會，我們感到很溫馨，領導為我們搭建了平臺，該是我們展示自己的時候了，用好我們學的專業知識，給中厚板注入新的活力，使公司上一個新的臺階，這是領導對我們的期待，也是我們的奮斗的目標。公司還為單身青年舉行了聯誼會，以解決職工的個人問題，這樣的公司誰不愿意付出，處處想的工人，是企業的未來。我能簽到這樣的公司感到很高興。
拿到調令之后，我來到了鐵區，鐵區有兩座高爐，我安全陪訓完之后，分到了1#高爐。1#高爐是1500m3,是XX建成并投產的。我被分到了運轉，運轉是高爐生產的重要保障，所以我們要在這進行崗位實習，運轉主要有上料、熱風爐、礦槽。我在礦槽實習，帶我的師傅是一個年紀和我差不多的人，他對我非常的負責，給我講各個設備的用處，還有注意事項，出現問題怎么解決。有這樣的師傅帶我，我很高興。我也學到了很多知識，誰說他的學歷不如我，但在這里我是絕對的不如人家。他一直都是這里的骨干，我們領導也是為了我們能盡快的學會，特意安排他帶我，我也知道領導這樣都是為我們好。公司各個部門都有這樣的好領導，公司會越來越好的。有好師傅帶我，我很快就熟悉了設備，一些事情也能處理了，不懂的地方我就問他，礦槽主要是為高爐運料，這里有兩個礦石料倉，四個燒結料倉，還有六個雜礦料倉，五個焦炭料倉，還有對應的稱斗。一條主皮帶，一條運礦皮帶，一條運焦皮帶，兩條返礦皮帶，兩條返焦皮帶。這里我知道了高爐是如何稱料的，是如何上料的，在學校的時候只知道焦炭和礦石分批上，但并不知道具體是怎么上的，這回我知道了，把學的知識和實際聯系了起來，好多以前不懂的現在好像開竅了似的，都明白是怎么回事了。老師講的有些東西也想起來了，如果不是在這實習，估計我不會想起來。
流式細胞儀范文6
關鍵詞 貞芪酪蛋白肽 神經膠質瘤 C6細胞 凋亡
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.15.149
資料與方法
材料:C6細胞系大鼠膠質母細胞瘤。LACP,純度>99%,用二甲亞砜溶解,配成200mmol/L的儲備液,-4℃保存。試驗前用含10%小牛血清的1640培養液稀釋成不同濃度。四甲基偶氮唑藍(MTT),二甲亞砜(DMSO),流式細胞儀(XL)。
方法:①細胞培養:C6細胞接種于1640培養液培養,隔日用0.25%胰酶消化傳代。②MTT法檢測LACP對C6細胞作用的時效及量效關系取對數生長期C6細胞,按1×105/ml接種于96孔板內,分24、48、72小時三大組,各組細胞培養24小時。將培養液換成含不同濃度LACP的培養液,繼續培養24、48、72小時后各取出一塊培養板,觀察細胞生長狀態并拍照。隨后檢測490nm波長處的光密度(OD)值。③流式細胞儀檢測細胞周期分布收集對數生長期C6細胞,接種于6孔板中,設4組,每組設復孔培養24小時后,將培養液換成含不同濃度LACP繼續培養24小時。收集細胞,上流式細胞儀檢測細胞周期。④流式細胞儀檢測細胞凋亡收集對數生長期C6細胞,接種于6孔板中,設4組,每組設復孔,培養24小時將培養液換成含不同濃度LACP繼續培養24小時,流式細胞儀進行檢測,分析用藥后細胞凋亡的百分比。
統計學處理:實驗結果以均數±標準差表示,應用SPSS13.0統計軟件分析,根據資料性質應用方差分析或t檢驗,檢驗水準α=0.05。
結 果
LACP作用于C6細胞后的倒置顯微鏡觀察:不同濃度LACP作用于C6細胞24、48、72小時后,倒置顯微鏡下觀察可見C6細胞隨著時間的延長及濃度的增大,細胞失去了正常的貼壁生長狀態,脫壁現象越加明顯。細胞形態發生了明顯變化,細胞變圓,細胞核固縮,核染色質致密,形狀不一、大小不等的團塊邊集于核膜,最終可見壞死細胞增多。
LACP作用于C6細胞后的生長抑制試驗在一定時間范圍內,隨著LACP濃度的增加,OD值相應減少。細胞的OD值與LACP濃度呈明顯的負相關關系,24、48、72小時時OD值與LACP濃度負相關系數分別為-0.91、-0.92、-0.96。經多因素方差分析,LACP在不同濃度(P
流式細胞儀檢測細胞周期分布隨LACP濃度的增加,C6細胞的G1期細胞明顯增加,而S期比例減低(P0.05),并且這種作用呈劑量依賴性,說明了LACP可引起C6細胞G1期阻滯。
流式細胞儀檢測細胞凋亡:經流式細胞儀分別檢測0、50、100及150mol/L濃度LACP作用于C6細胞24小時后凋亡細胞在總細胞數中所占比例分別為0.08%、0.30%、2.31%及18.26%。說明隨著LACP濃度的增大,凋亡細胞明顯增多,凋亡細胞在細胞總數中所占的比例增加。
討 論
研究表明LACP對多種腫瘤均具有抑制作用[1]。腫瘤細胞的基本生物學特征為增殖與分化的平衡失調,惡性腫瘤細胞由正常細胞分化障礙、惡變而來,表現為失控的增殖和去分化,許多惡性腫瘤細胞分化程度差,呈現胚胎細胞特征[2]。LACP在腫瘤啟動、促進及發展3個階段都顯示抗腫瘤功效。本實驗顯示隨著LACP濃度的增加,它對C6細胞的抑制程度增大,細胞存活率減少。鑒于過度增殖是腫瘤細胞的一大特性,因而細胞周期與腫瘤的關系一直是生命科學研究中的熱門課題[3]。我們的研究顯示LACP可引起C6細胞G1期阻滯。細胞凋亡對于保持多細胞機體的完整性及動態平衡起重要作用。如果細胞凋亡受抑,結果細胞死亡率下降,則細胞數目不斷增加,即表現出生長優勢,這是腫瘤形成的一個重要基礎。因而促進細胞凋亡對于腫瘤治療以及抗增生性疾病等具有重要的意義。
本研究表明:LACP能抑制體外培養的C6細胞生長,這種作用呈時間濃度依耐性;LACP能使C6細胞周期阻滯于G1期,阻斷細胞由G1期向S期的進程,而這種作用呈劑量依耐性;LACP可以誘導C6細胞發生凋亡的改變。LACP作為一種廣泛存在于自然界的植物補體,已被證實具有較為肯定和廣泛的抗腫瘤活性,是一種很有希望治療腦膠質瘤的天然化學防癌劑和化學治療藥物。
參考文獻
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