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nk細胞范文1
作者：張紅梅，張利旺，劉文超，盛蓉，范黎，任軍，潘伯榮
【關鍵詞】 右脛
1病例報告
男，34歲，發現右下肢皮膚包塊1 mo入院. 200403無誘因右下肢膝下約10 cm前外側出現包塊，進行性增大，局部皮膚略紅，皮溫正常，無疼痛，體溫正常. 入院查血、尿、糞常規正常，肝、腎功能、血清電解質、乳酸脫氫酶均正常；X線：右側脛、腓骨未見異常；B超： 右小腿實性包塊，2.9 cm×3 cm×1.8 cm，血流豐富，淺表淋巴結未探及腫大，肝、脾無異常；MRI： 包塊局限于皮膚、淺筋膜層；行包塊局部活檢，病理：細胞形態為惡性淋巴瘤，免疫組化顯示部分瘤細胞CD3胞漿（+），CD45RO（-），CD20（-），CD292（-），CD68（-），CD56（+/-），TIA（-），LMP-1（-）；基因重排結果： T細胞受體基因及免疫球蛋白基因均未見克隆性重排；診斷為“母細胞性NK細胞淋巴瘤”. 根據病理診斷進一步行骨髓穿刺、頭顱CT、纖維喉鏡等輔助檢查，均未發現異常. 遂給予CHOP方案化療，兩周期后下肢包塊完全消失，療效完全緩解（complete remission，CR）；進一步給予自體外周血干細胞支持下大劑量化療及椎管內化療，現維持CR已達6 mo.
2討論
近年來，國內外關于原發結外的淋巴瘤報道增多，好發部位主要是消化道［1-2］，其次為頭頸部、皮膚和骨；病理類型B細胞淋巴瘤比例高于T細胞淋巴瘤，霍奇金病少見. 而NK細胞淋巴瘤發病率則更低，多起源于結外部位，淋巴結內發生罕見［3］. 最常見的類型是鼻和鼻型NK細胞淋巴瘤，其表型及基因型特征為表達NK細胞相關抗原CD56及一些T細胞標志物，如CD2， CD7， CD43或CD45RO，活化的NK細胞可表達CD3ε分子，但不表達CD4， CD5， CD8和表面CD3分子；臨床上具有侵襲性和播散性，對治療反應性差，預后差. 根據2001年WHO淋巴瘤新分類［4］，本例母細胞性NK細胞淋巴瘤屬于T/NK細胞淋巴瘤的第2類，為前驅性T細胞淋巴瘤［3］. 該病多發生于成人，無明顯性別差異，且多為結外病變，尤其好發于皮膚（本例以右下肢皮膚包塊為首發癥狀），與EB病毒無相關性，臨床進程呈侵襲性，惡性程度高，目前尚無療效明確的治療方案.
參考文獻
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nk細胞范文2
目的:回顧性分析30例早期鼻腔NK/T細胞淋巴瘤的生物學行為特點，為臨床放療靶區的設計提供參考。方法:收集2005年3月至2013年9月間收治的30例經病理證實為早期原發于鼻腔的NK/T細胞淋巴瘤患者的資料，根據AnnArbor分期標準，所有患者均為IE/IIE期且都有影像檢查資料可查，并以影像學為標準分析鄰近受侵器官和結構的數目，同時分析頸部淋巴結的轉移情況。結果:鼻腔周圍結構受侵患者占所有患者的比例為76．7%(23/30)，其具體受侵如下:上頜竇為36．6%、篩竇與鼻咽同為30%、鼻翼為20%、翼突與蝶竇同為10%，翼腭窩及額竇、硬腭、眼眶、口咽同為3．3%;頭頸部淋巴結轉移的患者占所有患者的比例為46．7%(14/30)，其具體轉移如下:I區與II區同為26．7%，III區為10%，VIIa為6．7%，IV區與IX同為3．3%。結論:在早期鼻腔NK/T細胞淋巴瘤放射治療時，其靶區的勾畫應該考慮受侵和轉移幾率均較高的結構和區域。
【關鍵詞】
鼻腔;NK/T細胞淋巴瘤;生物學特性
原發于鼻腔、鼻竇的非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一種特殊類型的淋巴瘤，發病率占全部惡性淋巴瘤的2%～10%。亞洲地區發病人群中，以NK/T細胞來源多見，而B細胞來源則較少見［1－2］。放化療對只伴有局部侵犯的早期病例療效較好，而局部廣泛、區域淋巴結浸潤及遠處播散病例療效較差。本研究收集了30例病理證實為原發于鼻腔的早期NK/T細胞淋巴瘤患者的資料，并以影像學為標準分析其鄰近受侵器官和結構的數目，并同時對頸部淋巴結的轉移情況進行分析，以研究早期鼻腔NK/T細胞淋巴瘤的生物學特性，為臨床放療靶區的設計提供參考。
1資料和方法
1．1臨床資料收集2005年3月至2013年9月間在本院接受治療的30例經病理證實為早期原發于鼻腔的NK/T細胞淋巴瘤患者的資料，男性患者20例，女性患者10例，性別比例為2∶1?；颊叩闹形荒挲g為45歲，所有患者均根據AnnArbor標準分期為IE及IIE期，其中IE期患者為13例，IIE期患者為17例(見表1)，30例患者都有MRI影像檢查資料可查。
1．2治療方法因所收集的病例時間跨度較大，30例患者接受的治療方式有所差別。其中單純化療者9例，單純放療者11者，化放療結合的10例。放療多采用高能光子線及電子線，照射范圍和放療劑量遵循以下原則:腫瘤局限于一側鼻腔，未侵犯臨近器官或組織的患者照射靶區包括雙側鼻腔、雙側前組篩竇和同側上頜竇;腫瘤超出鼻腔時，靶區擴大至受累的臨近器官或結構，如果前組篩竇受侵，應包括同側后組篩竇。如果腫瘤臨近后鼻孔或侵犯鼻咽，照射野應包括鼻咽。對于淋巴結的處理原則為IE期患者不必做頸部淋巴引流區預防照射，IIE期在原發病灶和受侵器官/結構照射時，需同時做雙頸照射。每天按1．8～2Gy常規分割照射，中位劑量為55Gy。早年的化療以CHOP、ECHOP方案為主，后期以GDP、DICE方案為主。Ⅰ期病例化療4療程，Ⅱ期化療6療程，如2療程化療后評價為無效者改用放療或更改方案。
1．3影像學受侵的標準30例患者均有原始的MRI影像資料可以查詢，且都行MRI的增強掃描。為了避免因不同人員閱讀MRI影像資料而造成的觀察者間變異，所有影像資料的閱讀均由一名經驗豐富的影像科主治醫師完成。并對影像上臨近器官或結構、頸部及咽后淋巴結受侵的判斷定義如下:影像上明顯的器官和結構受侵犯，T1WI腫瘤呈等信號，信號強度類似或稍低于肌肉;T2WI呈不均勻稍高信號，信號強度高于肌肉但低于鼻黏膜，增強后輕到中度不均勻強化。頭頸部淋巴結的判定與上述影像表現一致，或伴有淋巴結融合成團、壞死等征象，如沒有上述影像表現則要求淋巴結最大層面的最小直徑需大于等于10mm。頭頸部淋巴結受侵的分區根據GrégoireV等［3］的最新標準劃分。
1．4受侵區域的劃分將鼻腔的臨近器官或結構劃分為上頜竇、篩竇、鼻咽、鼻翼、翼突、蝶竇、翼腭窩、額竇、硬腭、眼眶、口咽。頸部淋巴結的劃分則根據受侵的區域分為I區、II區、III區、IV區和IX區(面動脈淋巴結區)。
2結果
鼻腔周圍結構受侵患者占所有患者的比例為76．7%(23/30)，不同結構受侵概率如下:上頜竇為36．6%、篩竇與鼻咽同為30%、鼻翼為20%、翼突與蝶竇同為10%，翼腭窩及額竇、硬腭、眼眶、口咽同為3．3%(見表2)。頸部淋巴結區域轉移的患者占所有患者的比例為46．7%(14/30)，其具體轉移如下:I區與II區同為26．7%，III區為10%，VIIa為6．7%，IV區與IX區同為3．3%(見表3)。
3討論
鼻型NK/T細胞淋巴瘤絕大部分原發于鼻腔及臨近器官，目前文獻把原發于鼻腔的結外NK/T細胞淋巴瘤定義為原型，而發生于鼻腔以外的具有相同病理學特征的命名為鼻型，統稱鼻型NK/T細胞淋巴瘤。本病早期臨床表現不典型，常見癥狀為單側鼻腔鼻塞、流涕，伴血涕或鼻出血，頭痛或B癥狀(發熱、消瘦、盜汗)。進行性發展可有鼻竇、眼眶、面頰部、顱骨侵犯，表現為鼻腔占位性病變、臨近軟組織廣泛侵犯、潰瘍及骨破壞。其中線部位的破壞較為突出，表現為鼻中隔穿孔、外鼻畸形，鼻梁洞穿性損傷或硬腭穿孔，甚至累及面部皮膚。頸部淋巴結播散，甚至向遠處肝脾、肺臟、骨髓、腎上腺、等轉移播散。晚期多因大出血、全身衰竭死亡。I、II期患者主要采用放療、單純放療或化放療綜合治療的5年OS(總生存)率僅30%～40%，單純化療則極易產生耐藥性，化療后部分患者雖可獲得暫時的緩解，但仍極易復發。目前這種淋巴瘤尚無統一標準的治療方案，因此近年來關于臨床治療的研究較多。和其他淋巴瘤一樣，AnnArbor的分期標準仍然在NK/T細胞淋巴瘤分期中應用得最為廣泛，但是對AnnArbor的分期標準是否適用于NK/T細胞淋巴瘤仍然存在著爭議，目前對于廣泛或彌漫性累及的III/IV期分期取得了較一致的認同，但對于較為早期的I/II期，局部侵犯是一個重要的決定因素。像其他結外淋巴瘤一樣，AnnArbor分期系統沒有考慮腫瘤的大小，I期既包括局限于鼻腔的小腫瘤，也包括廣泛累及臨近鼻竇和鼻咽結構的巨大腫瘤［4］。按照AnnArbor的分期系統，其中鼻腔NK/T細胞淋巴瘤I－II期發病率可占73%～84%，而NK/T細胞淋巴瘤患者者III－IV期可占68%［5］。因本研究的主要目的是分析早期患者鼻腔周圍臨近結構受侵犯的規律及頭頸部淋巴結的轉移規律，而III－IV期患者多為全身廣泛轉移，因此研究中排除了晚期的患者。
LeeJ等［6］報導本病以男性青壯年多見，本研究患者中男女比例為2∶1，中位年齡為45歲，與報道相似。研究共計30例患者，其中伴有鼻腔周圍結構受侵的患者占到76．7%(23/30)的比例，而在這23例出現鼻腔周圍結構受侵的患者中，進一步的分析所受侵結構在這23例患者中所占的比例得到以下的數據:上頜竇為47．8%(11/23)、篩竇與鼻咽同為39．1%(9/23)、鼻翼為26%(6/23)、翼突與蝶竇同為13%(3/23)，翼腭窩及額竇、硬腭、眼眶、口咽同為4．3%(1/23);同理，頭頸部淋巴結區域轉移的患者占所有患者的比例為46．7%(14/30)，進一步分析轉移淋巴結在這14例患者中所占的比例得到以下的數據:I區與II區同為57．1%(8/14)，III區為21．4%(3/14)，VIIa為14．2%(2/14)，IV區與IX區同為7．1%(1/14)。由以上的數據可以得出以下的結論:①在鼻腔周圍的結構中上頜竇、篩竇與鼻咽為受侵幾率較高的部位。②頸部淋巴結中I區與II區的轉移幾率較高，但也觀察到在其他區域也有較小的淋巴結出現，均未達到影像學的診斷標準，不過也不能排除其為陽性淋巴結的可能。③同時發現在鼻翼及面部皮膚受侵的患者中，2013年頭頸部淋巴結最新分區中的IX區較易出現淋巴結轉移，有關其受侵的數據及轉移的幾率將做更進一步的統計和分析。④另外也發現一個現象即當鼻咽部受侵時，頸部出現II區淋巴結轉移的幾率較高，在本次的30例患者中，有9例患者出現鼻咽部受侵，而這9例患者中又有5例伴有II區的淋巴結轉移，達到55．5%(5/9)的比例，對于這樣的現象本研究也將做進一步分析。由此通過本研究建議在早期鼻腔NK/T細胞淋巴瘤放療靶區的勾畫中，結合個體化治療的需求，應該適當考慮以下的因素:①鼻咽部受侵犯的幾率較高，鼻咽部是否應當作為一個常規預防照射的區域;②在出現鼻翼部及面部皮膚廣泛受侵時，是否應當將IX區作為預防照射的區;③當腫瘤臨近后鼻孔或鼻咽部出現明顯侵犯時，是否應當將頸部II區作為常規預防照射的區域。
而對于鼻腔NK/T細胞淋巴瘤的預后則有以下的研究，ThieblemontC等［7］認為年齡超過60歲是淋巴瘤的一個不利預后因素。MaHH等［8］認為局部侵犯范圍對遠期生存有顯著影響。LiCC等［9］報道首程治療后的CR率是影響預后的重要因素。研究人員對262例結外NK/T細胞淋巴瘤進行預后相關因素分析，多因素分析顯示臨床分期、區域淋巴結受累、B癥狀為其預后因素［10］。KimGE等［11］報導在143例I/II期頭頸部血管中心性淋巴瘤中，單純放療組和綜合治療組的5年生存率分別為38%和35%，綜合治療組未提高生存率，主要的治療失敗是局部的治療失敗，而傳統的全身性化療未減少局部失控率和全身性轉移。JaccardA等［12］認為對于初治的鼻腔NK/T細胞淋巴瘤患者應該爭取及早獲得完全緩解，近年來探索的含門冬酰胺酶的化療方案，不論是作為一線方案還是二線方案均取得了較好的效果。
nk細胞范文3
[關鍵詞] 肺癌；T淋巴細胞；NK細胞；流式細胞術
[中圖分類號] R734 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2013）04（b）-0093-03
肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤。肺癌的5年生存率只有10%～20%[1]，預后極差。近50年來，我國肺癌發病率明顯增高，在大中城市肺癌已居男性腫瘤之首。T淋巴細胞在抗腫瘤中具有極其重要的作用；T細胞應答是控制腫瘤生長發育的最重要的宿主應答；參與抗腫瘤免疫的兩類T細胞亞群為CD4+輔助/誘導T細胞、CD8+抑制/細胞毒T細胞；T淋巴細胞及亞群可作為臨床判斷患者狀態的一個敏感指標，對臨床治療具有重要意義。NK細胞在抗腫瘤的天然免疫和特異性免疫中發揮效應作用，能夠直接殺傷各種腫瘤細胞和病毒感染細胞，是機體抗腫瘤的第一道防線。本文旨在探討肺癌患者淋巴亞群變化和不同年齡組細胞免疫狀況。
1 資料與方法
1.1 一般資料
570例肺癌患者均為2009年1月～2012年10月淮南東方醫院集團腫瘤醫院初次住院的臨床確診患者，其中，男性481例，女性89例，男女比例為5.4∶1；最大年齡92歲，最小27歲，中位年齡66歲。正常對照組20例，其中，男性13例，女性7例，年齡35～57歲，均為體檢未發現腫瘤及免疫性疾患的人員。
1.2 樣本采集
肝素真空采血管采集靜脈血2 mL，室溫放置，樣本24 h內做染色處理。
1.3 試劑儀器
使用BD MultitestTM IMK kit 四色熒光抗體試劑盒（Cat No：340503），CaliBRITETM 3 COLOR KIT（Cat No：340 486）和CaliBRITETM APC（Cat No：340487）定標熒光微球，FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司），調用四色免洗條件MultiSET軟件自動分析淋巴細胞亞群；報告NK細胞（CD16+56+）、T淋巴細胞（CD3+）、輔助/誘導T細胞（CD3+ CD4+ CD8-）和抑制/細胞毒T細胞（CD3+ CD4- CD8+）占淋巴細胞的百分比和CD4+/CD8+細胞比值。
1.4 統計學處理
實驗數據均以 x±s表示，組間比較用t檢驗，淋巴亞群結果的年齡趨勢分析用線性回歸分析，應用SPSS 17.0統計軟件，P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺癌不同年齡組構成比
本組結果在51～80歲年齡段內發病人數占肺癌總人數的78.3%，是肺癌高發年齡段。肺癌在71～80歲組發病率最高（28.8%），可能是人的衰老，免疫系統功能衰弱，特別是細胞免疫功能下降，導致腫瘤發病率增加。由于80歲以上人群數量明顯減少，其發病率明顯減低并不能說明其發生肺癌的概率會降低。各組比例如圖1。
2.2 肺癌患者不同年齡組與對照組淋巴細胞亞群結果
肺癌患者CD4+ T細胞相對減低、CD8+ T細胞相對增高、CD4+/CD8+比值明顯降低，與正常對照組比較差異有統計學意義（P < 0.05）；NK和CD3+ T細胞與對照組比較，差異無統計學意義。肺癌患者不同年齡組與對照組淋巴細胞亞群結果見表1。
2.3 肺癌患者淋巴亞群結果的年齡趨勢分析
以年齡組（1）～（5）組為自變量，以淋巴亞群結果為因變量作線性回歸分析，SPSS 17.0軟件統計結果見表2。
隨著肺癌患者年齡降低NK細胞有明顯降低趨勢（P < 0.01），CD3+ T細胞有明顯增加趨勢（P < 0.01），如圖2。
3 討論
CD4+ T細胞可直接殺傷腫瘤細胞，可識別腫瘤細胞分泌的可溶性抗原，參與B細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞和細胞毒T細胞的激活，進而發揮抗瘤作用；CD4+ T細胞的減少可以解釋腫瘤的免疫逃避機制。腫瘤細胞具有分泌多種免疫抑制因子功能，可抑制T細胞和NK細胞[2]，使CD4+ T細胞和NK細胞數量減少，CD4+ T細胞和NK細胞減少可削弱機體的免疫監視作用。本組結果顯示CD4+ T細胞和NK細胞明顯降低，說明腫瘤患者存在免疫逃避；隨著年齡的增大CD4+ T細胞降低明顯，免疫功能隨年齡增加而不斷下降[3]，腫瘤的免疫逃避增加。
CD8+ T細胞按CD28有無可分為CD8+/CD28+和CD8+/CD28-兩類，前者有細胞毒細胞功能，而后者則有抑制功能，CD28分子在T細胞激活、增殖中具有重要作用；惡性腫瘤患者CD8+ T細胞CD28+分子表達率顯著下降，影響T細胞的活化增殖，而CD8+/CD28- T細胞逐漸增高，進而造成機體對腫瘤免疫力的下降[3-4]。在抗腫瘤的免疫應答中，細胞毒性T細胞（CTL）成為抗腫瘤免疫的主要效應細胞[5]。本組結果CD8+ T細胞明顯增加超過CD4+ T細胞減少的數量導致CD3+總T細胞增加，說明肺癌患者有抑制功能的T細胞增加，CD8+ T細胞不能被充分激活而無法產生有效抗腫瘤作用。在殺傷腫瘤中往往CD4+、CD8+兩類細胞相互配合，共同協作。腫瘤形成發展過程中，產生或分泌可溶性免疫因子，可誘導CD8的產生同時阻止CD4的形成和成熟而導致CD4+/CD8+比值下降，CD4+/CD8+比值可反映機體的免疫功能狀況。
NK細胞具有抗腫瘤，抗病毒感染，抗器官移植，參與T淋巴細胞、B淋巴細胞的調節及其免疫調節的功能。NK細胞通過受體作用維持平衡、發揮殺傷效應[6-7]。Cooper MA等[8]研究證明人外周血NK細胞可分為二群，80%～90%的NK細胞低表達CD56高水平表達CD16（CD56dim CD16brigh），此類細胞可有效地發揮細胞毒作用；10%～20%的NK細胞表型為CD56brighCD16dim或CD56brighCD16-，其功能主要是分泌細胞因子，參與機體的免疫調節。陳文寬等[9]研究78例喉咽鱗癌患者發現癌癥組較非腫瘤對照組NK細胞活性低；局部晚期患者及有區域淋巴結轉移患者的NK細胞活性同樣降低?？蹬嗔嫉萚10]報道胰腺癌根治手術治療后可明顯提高T細胞亞群和NK細胞的免疫功能。本研究肺癌患者NK 細胞降低與文獻一致[9-11]，患者越年輕NK細胞免疫活性越低。
在21～40歲組NK細胞明顯降低，CD3+細胞、CD8+ T細胞明顯增高，CD4+/CD8+比值顯著降低（P < 0.01），在71～80歲組NK細胞比前四組明顯增高（P < 0.01）、稍高于對照組，說明年輕患者細胞免疫功能活躍，老年患者機體代謝慢、腫瘤生長也相對緩慢，老年機體本身免疫低下，細胞免疫反應降低。不同年齡的肺癌患者細胞免疫功能不同，其治療策略、方法也應不同。肺癌患者越年輕細胞免疫功能紊亂越明顯，提示年輕患者的治療更要注重細胞免疫的調節和平衡。而老年患者機體本身免疫功能低下，細胞免疫對腫瘤的抑制能力有限，應注意機體的整體性治療，防止并發癥。
總之，肺癌患者的CD4+ T細胞降低、CD8+ T細胞升高、CD4+/CD8+比值顯著降低，NK細胞降低，說明患者免疫功能處于抑制狀態，T細胞亞群及NK 細胞活性檢測可作為肺癌免疫功能及預后的監測指標。肺癌年輕患者細胞免疫功能紊亂明顯，提示年輕患者的治療更要注重細胞免疫的調節和平衡。
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nk細胞范文4
摘要：目的：通過檢測清熱抗感沖劑對實驗性免疫低下大鼠及正常大鼠NK細胞殺傷活性的影響，探討該方對免疫功能的調節作用。方法：選取Wistar大鼠100只，雌雄各半，隨機抽取其中雌雄各25只，腹腔注射環磷酰胺4.5mg/(0.5mL?只)，每天給藥1次，連續7天，造成免疫低下大鼠，然后隨機分為模型組、中藥對照組(銀翹解毒片組)、西藥對照組(γ－干擾素組)、小劑量組及大劑量組，保證每組雌雄各半：其余50只隨機分為正?？瞻讓φ战M(即生理鹽水組)、中藥對照組、西藥對照組、小劑量組、大劑量組，同樣保證每組雌雄各半。上述各組連續用藥3夭后，麻醉無菌操作完整摘除脾臟，置含RPMI營養液的無茵瓶中，送檢。采用流式細胞儀檢測NK細胞的殺傷活性。結果：清熱抗感沖荊能顯著增加正常大鼠和注射環磷酰胺引起的免疫低下大鼠NK細胞殺傷活性(P＜0.05或P＜0.01)。結論：清熱抗感沖劑對大鼠的NK細胞殺傷活性有明顯的促進作用。
關鍵詞：中醫藥研究；清熱抗感沖劑；免疫調節；NK細胞
中圖分類號：R285 文獻標識碼：A 文章編號：1673-7717(2007)05-0929-03
清熱抗感沖劑主要含有僵蠶、薄荷、金銀花、連翹、板藍根、桔梗、大黃等藥物，具有辛涼解表、清熱解毒、宣降蘊熱的作用。臨床用以治療上呼吸道感染，有效率達94.16％，療效顯著。課題組以往的實驗已經證實清熱抗感沖劑具有抗病毒及提高血清lL-2、CD4+T細胞亞群的功能。為了深入研究該沖劑對免疫的調節作用，本實驗主要從清熱抗感沖劑對大鼠NK細胞殺傷活性的影響方面觀察該沖劑的免疫調節作用。
1材料與方法
1.1實驗材料
1.1.1實驗動物 Wistar大鼠100只，體重為(200±20)g，雌雄各半，由山西省中醫藥研究院實驗動物中心提供，合格證號：晉動(證)字A00-002號。飼養環境通風良好，飼養溫度18～22℃，濕度為45％65％。
1.1.2實驗藥物 清熱抗感沖劑(將本方藥物水煎、濃縮、真空干燥，制成沖劑，每袋6g。由山西中醫學院附屬醫院制劑室提供)；銀翹解毒片(云南省騰沖制藥廠提供，批號為050169，經粉碎研磨100目過篩制成散劑)；γ-干擾素(上?？寺∩锔呒夹g有限公司提供，批號為20050101)；環磷酰胺(江蘇恒瑞醫藥有限公司提供，批號為05012021)。
1.13實驗試劑 體外K562細胞株(北京藥物所引進)；RPMI-1640培養基(山西省腫瘤醫院配制)；rh Annexin V-PE(Cat.No.BM306pe,BMS公司)；PI核酸染料(Cat.No.66211E,BD公司提供)
1.1.4實驗儀器 流式細胞儀(BD FACSCalibur，美國BD公司生產)，HengpingJA2003電子精密天平(上海恒平科學儀器有限公司)，離心機等。
1.2實驗方法
1.2.1試劑配制 清熱抗感沖劑灌胃液的制備：取清熱抗感沖劑加蒸餾水溶解，分別配制成實驗所需的低濃度1.134g/2mL和高濃度2.268g/2mL銀翹解毒片灌胃液的制備：取銀翹解毒片粉碎后，經100目過篩，制成散劑，加蒸餾水溶解，配制成濃度為227mg/mL溶液。
γ-干擾素注射液的制備：將γ干擾素加注射用水溶解成10.8萬UI/mL。環磷酰胺注射液的制備：將環磷酰胺加生理鹽水配制成濃度為9mg/mL的溶液。
1.2.2分組及給藥 取100只大鼠，雌雄各半，隨機分成兩大組：①正常組：取50只大鼠雌雄各半，再隨機分成5組，并保證每組雌雄各半，分別給藥如下：(1)生理鹽水組：生理鹽水2mL/只，灌胃。(2)中藥對照組：銀翹解毒片水溶液灌胃227me/(1mL?只)。(3)西藥對照組：腹腔注射γ-干擾素5．4萬UL/(0.5mL?只)。(4)小劑量組：清熱抗感沖劑水溶液灌胃1.134g/(2mL?只)。(5)大劑量組：清熱抗感沖劑水溶液灌胃2.268g/(2mL?只)。免疫功能低下組：取50只大鼠腹腔注射環磷4.5mg/(0.5mL?只)，每天給藥1次，連續7天。然后再隨機分成5組，每組雌雄各半，其中一組作為對照，其余4組分別給藥如上述正常組(2)～(5)組。上述各組每天給藥1次，連續3天。
1.2.3標本的采集 最后1次給藥24h后，20％烏拉坦注射0.8mL/只麻醉后，無菌操作完整摘除脾臟，置RPMI-1640營養液內送檢(與山西省腫瘤研究所合作完成)。
1.2.4靶細胞的制備 體外K562細胞株，取在RPMI一1640培養基生長旺盛的細胞計數，用完全RPMI－1640培養基調整細胞濃度為1×106備用。
1.2.5效應細胞 無菌操作解剖實驗大鼠，取脾臟放入含RPMI－1640培養基的無菌瓶中，用機械法將脾細胞分離，加入適量PBS液，1000r/min離心10min后，棄上清，沉淀物加入適量溶血素混勻，室溫放置10min后，1000r/min離心10min后，棄上清，沉淀物加入適量PBS液混勻，細胞計數后，1000r/min離心10min后，棄上清，用完全RPMI-1640培養基調整細胞濃度為5×107/mL備用。
1.2.6培養與染色 取無菌96孔培養板，加靶細胞懸液到96孔培養板，每孔100μL，再加入效應細胞到靶細胞中(效：靶=50:1)，每個脾標本加2孔，另加人單純效應細胞和靶細胞液作為對照。振蕩混勻，放入37℃，5％CO2培養箱中孵育12h。將培養板中細胞收集到流式樣品管中，加入適量PBS離心洗1次(1000r/min)，棄上清。樣本細胞中加入5μL rh Annexin V-PE和10μL PI染料，混勻在室溫(20～25℃)避光放置15min。加入PBS液500μL，混勻，1h內上流式細胞儀測定。
1.3實驗資料處理
所有實驗數據均以均數±標準差(x±s)表示，組間顯著性檢驗采用t檢驗。
2結果
2.1清熱抗感沖劑對正常大鼠NK細胞的殺傷活性
NK細胞總的殺傷活性可以區分為凋亡和壞死兩種形式，中藥對照組、西藥對照組及實驗藥物的大、小劑量組與生理鹽水組比較，凋亡和壞死均有顯著性差異，可見均能提高正常大鼠NK細胞的殺傷活性，實驗藥物的大、小劑量組與中藥對照組、西藥對照組作用相似，實驗藥物的大劑量組與小劑量組相比，凋亡和壞死均有增高趨勢，但其差異性無統計學意義。NK細胞總殺傷活性組間比較。
模型組NK細胞殺傷活性明顯低于空白對照組，說明環磷酰胺可以抑制大鼠NK細胞殺傷活性，實驗藥物的大、小劑量組均能提高免疫抑制大鼠的NK細胞殺傷活性，作用與中藥對照組、西藥對照組相似，實驗藥物的大劑量組與小劑量組相比，凋亡和壞死均有增高趨勢，但其差異性不顯著。各組NK細胞總殺傷活性的比較。
3討論
據文獻報道，上呼吸道感染的人群，普遍存在免疫功能低下的現象。有資料表明，上呼吸道感染患者，多存在細胞因子活性降低等現象。而且現代醫學研究認為，機體免疫系統在抗病毒感染過程中發揮著重要作用，其中包括有免疫球蛋白參與的體液免疫、SIgA為主的黏膜免疫等特異性免疫和NK細胞、IFN等非特異性免疫。
NK細胞是機體內存在的具有自然殺傷能力的細胞，是自發的細胞介導的細胞毒，作用發生快，在病毒感染早期，NK細胞即可通過趨化作用聚集到感染灶，在干擾素(IFN-α/β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素-12(IL-12)等細胞因子作用下，誘導NK細胞活化，使病毒感染細胞溶解破壞，同時NK細胞分泌IFN-γ和IFN-α等，通過干擾病毒復制和進一步活化吞噬細胞，擴大和增強機體抗感染的免疫功能。NK細胞還具有免疫調節作用，可以抑制美洲商陸(PWM)誘導的B細胞增殖分化，釋放IFN－γ、IFN－β和巨噬細胞／粒細胞集落刺激因子(GM－CSF)等細胞因子，對機體的免疫功能進行調節，增強機體早期抗感染的免疫能力和免疫監視作用?？傊?，NK細胞是機體重要的非特異性防御機能之一。本次實驗研究結果顯示，清熱抗感沖劑可以顯著提高正常大鼠以及被環磷酰胺免疫抑制大鼠的NK細胞殺傷活性。這可能是其治療上呼吸道感染的機理之一。
4小結
nk細胞范文5
[關鍵詞]原因不明反復流產；T淋巴細胞亞群；自然殺傷細胞；流式細胞術
[中圖分類號] R714.21 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）04（a）-0087-03
Molecular Genetics Laboratory，Liaoning Province Research Institute of Family Planning，Shenyang 110031，China
[Abstract]Objective To explore the changes of T lymphocytes sub-types and NK cells in patients with unexplained recurrent abortion.Methods The patients were collected in the Liaoning Province Research Institute of Family Planning from March 2014 to March 2016. The 50 patients with URSA were selected as the observation group and 30 patients with voluntary abortion were selected as the control group.Flow cytometry was used to measure the number of T lymphocytes sub-types and NK cells in the two groups.Results The percentages of CD4+ and ratio of CD4+/CD8+ was significantly increased in peripheral blood of unexplained recurrent abortion patients （P0.05）.The level of NK cell was also significantly increased in peripheral blood of unexplained recurrent patients（P
[Key words]Unexplained recurrent abortion；T lymphocytes sub-types；NK cells；Flow cytometry
反復自然流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指連續發生了2次或2次以上的自然流產，是一種常見的妊娠并發癥[1]。其主要原因有染色體異常、感染、內分泌失調和凝血異常，而排除這些因素后，其中有40%～80%的患者原因不明，稱為不明原因反復自然流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[2]。正常妊娠需要母體建立起一個對胎兒局部免疫耐受的環境，如果免疫微環境失調則會導致流產的發生[3]。URSA是育齡婦女常見的妊娠并發癥，已經成為困擾育齡婦女和臨床工作者的一大難題，其發病機制目前尚不清楚。免疫因素在維持正常妊娠起著關鍵作用，T淋巴細胞亞群及自然殺傷細胞（natural killer，NK）在妊娠免疫中越來越受到重視，本研究通過比較URSA患者與健康早孕婦女外周血中T淋巴胞亞群和NK細胞比率，探討URSA患者外周血中免疫細胞的變化，同時為URSA患者治療提供理論依據，避免流產的發生。
1資料與方法
1.1一般資料
選擇2014年3月～2016年3月于遼寧省計劃生育科研院附屬醫院門診診斷為URSA患者50例，同期健康早期妊娠并且自愿要求人工流產的患者30例。觀察組50例URSA患者平均年齡（30.12±6.73）歲，平均孕齡（8.01±3.13）周，平均月經周期（28.32±3.22）d，平均體重指數（23.27±3.15）kg/m2。對照組30例早孕婦女中，平均年齡（29.42±5.58）歲，平均孕齡（8.32±3.45）周，平均月經周期（29.01±4.73）d，平均體重指數（23.24±3.14）kg/m2。兩組患者的年齡、孕齡、月經周期和體重指數等一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。所有患者在組織收集前均簽署知情同意書并經遼寧省計劃生育科研院醫學倫理委員會通過。觀察組納入標準：①符合URSA診斷標準：有2次或2次以上的自然流產病史，夫婦雙方染色體正常；②內分泌功能正常；③母兒血型不和，抗心磷抗體、抗核抗體均為陰性；④丈夫男科檢查均正常。排除標準：合并生殖道感染、畸形。對照組排除標準：①既往有流產史；②合并內分泌、染色體和自身免疫抗體異常；③合并生殖道感染、畸形。
1.2方法
淋巴細胞亞群檢測1.2號管均加入女方全血50 μl，然后于1號管中加入10 μl FITC-CD3/PE-CD8/PerCP-CD45/APC-CD4混合單克隆熒光抗體（BD公司；批號：340503），2號管加入10 μl FITC-CD3/PE-CD16+ CD56/PerCP-CD45/APC-CD19混合單克隆熒光抗體（BD公司；批號：340503），振蕩混勻，室溫避光20 min；加入紅細胞裂解液（BD公司；批號：5154719）1 ml，震蕩混勻，室溫避光10 min；磷酸鹽緩沖液洗1次，500 μl懸液上樣檢測。
1.3統計學處理
采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗和檢驗分析；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P
2結果
2.1 兩組T淋巴細胞亞群及CD4+/CD8+比率的比較
URSA患者外周血中CD4+細胞百分率和CD4+/CD8+比率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P0.05）。
2.2 兩組NK細胞百分率的比較
URSA患者外周血中NK細胞的百分率為（18.09±2.32）%，明顯高于對照組的（14.36±3.21）%，差異有統計學意義（P
3討論
妊娠是一個復雜的生理過程，是一個特殊的半同種異體移植過程，主要是母體免疫耐受來維持正常妊娠過程，一但母體與胎兒的免疫平衡被破壞，會造成病理性流產的發生[4-5]。各種免疫的失衡均可導致URSA：封閉抗體的缺乏、T淋巴細胞亞群的改變、CD4+/CD8+失衡、Th1/Th2失衡、CD56+CD16+/CD56+CD16-NK細胞亞群比例失調、細胞因子、趨化因子等表達異常[6-8]。
近年來研究發現，URSA的患者多是免疫狀態相對異常，其中T淋巴細胞、NK細胞越來越受到關注。胎兒對于母體而言，屬于同種異體移植物，其抗原不是存在于母體中樞免疫器官內，妊娠免疫耐受本質主要是外周免疫耐受。根據T淋巴細胞表面的特征性分子不同，可將成熟T細胞分為兩個亞群，即CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞。CD4+T淋巴細胞可輔助B淋巴細胞轉化為淋巴母細胞而產生抗體，CD8+T淋巴細胞抑制這一過程使CD4+T淋巴細胞的作用不至于過強，兩者比例的平衡是維持生理功能正常和免疫反應正常應答的基礎。URSA與母體的免疫狀態有很大的相關性，反復流產患者表現為免疫系統呈現免疫過度表達的狀態。本研究發現，URSA患者外周中CD4+和CD4+/CD8+比率明顯高于正常早孕的婦女，這與以往的研究相符[9-10]。CD4+T淋巴細胞為輔T淋巴細胞，其比率升高，使機體免疫功能增強，對胚胎的免疫排斥加強，導致妊娠不能繼續[11]。正常早孕的婦女外周血中CD4+T淋巴細胞明顯低于非懷孕的健康婦女，說明CD4+T淋巴細胞在外周血中表達降低，是正常妊娠維持的一個必要條件。正常妊娠早期，CD4+/CD8+的比值降低，有利于胚胎免于遭受母體免疫系統的排斥。CD4+/CD8+的比值在正常情況下始終保持著動態平衡，當二者比例失調，則會引起免疫紊亂，造成流產的發生。在URSA患者外周中CD4+/CD8+的比值升高，提示早期流產患者淋巴細胞亞群失調，細胞免疫功能過度，導致妊娠不能繼續。當URSA經過主動免疫治療后，CD4+/CD8+的比值下降，利于妊娠的維持[12]。
NK細胞存在于先天性免疫系統的一類淋巴細胞，主要分布于外周血中，不需要預先致敏就能殺傷靶細胞，能產生細胞毒效應。NK細胞在妊娠的維持過程中具有重要作用。在胚胎植入和妊娠早期，子宮蛻膜細胞中NK細胞的比例占70%以上，主要對胎兒滋養層細胞產生免疫耐受作用，提供主要的免疫防御作用。子宮蛻膜中的NK細胞與胚胎滋養細胞直接接觸，當其細胞活性過度表達會對胚胎的發育有害，從而引起胚胎損傷乃至流產的發生。目前國內外研究認為CD56+CD16+T細胞等NK細胞與URSA發病機制密切相關[13-14]，外周血高水平的NK細胞預示著染色體核型正常的妊娠可能發生生化妊娠或自然流產[15]。本研究發現URSA患者相比較正常早孕婦女的外周血中NK細胞比率明顯升高，提示NK細胞參與了URSA的形成。NK細胞可能發揮作用的機制是NK細胞的殺傷功能啟動，釋放穿孔素及絲氨酸酯酶，導致胚胎的損傷，引發流產。另外URSA患者外周中NK細胞的增多，改變了細胞因子表達，打破了母胎界面Th1/Th2的平衡，也可以引發流產[16]。
綜上所述，CD4+、CD4+/CD8+以及NK細胞比率在URSA患者外周血中升高與早期自然流產的發生相關，免疫因素是URSA流產的重要原因，筆者以T淋巴細胞亞群和NK細胞為研究URSA疾病的切入點，取得一定的結果，對臨床URSA的診療具有理論意義和指導價值。
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nk細胞范文6
【關鍵詞】 ，，NK/T細胞淋巴瘤
【關鍵詞】 NK/T細胞淋巴瘤;診斷;分類;免疫表型
1對象和方法
1.1對象
型NK/T細胞淋巴瘤石蠟組織20例選自延安大學醫學院和北京醫科大學病理學系的外檢檔案及會診材料，所有標本經40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，HE染色及免疫組織化學染色，結合臨床表現及組織病理形態特征，診斷為鼻型NK/T細胞淋巴瘤.
1.2方法
1.2.1免疫組織化學染色方法采用鏈霉素生物素過氧化物酶連接法（streptavidian biotin complex method， SABC法），在石蠟包埋組織4 μm切片上，檢測腫瘤細胞CD20， CD3ε， CD45RO和CD56，確定其免疫表型；檢測TIA1和GranzymeB，確定細胞毒顆粒相關蛋白的表達. 抗體的濃度及抗原修復方法略. 陽性對照為已經確定的陽性病例，陰性對照為以TBS緩沖液取代一抗.
1.2.2原位雜交方法用質粒RA386制作出EB病毒編碼的小核RNA（EBER）寡核苷酸探針，得出最適RNA探針濃度為1∶100，后在石蠟切片上做原位雜交，用橋接堿性磷酸酶（AP）標記的抗體（1∶500，Boeh公司），最后以五溴四氯三吲哚磷酸脂/硝基四氮唑藍（BCIP/NBT）為底物避光顯色，光鏡觀察結果. 陽性對照為以前的陽性病例，陰性對照不加探針.
1.2.3結果判定免疫組織化學陽性信號為腫瘤細胞的胞質/胞膜內有棕黃色的顆粒；原位雜交的陽性信號為細胞核內呈現藍色的細顆粒.
2結果
2.1免疫表型檢測結果20例鼻型NK/TCL病例中，T細胞標記物CD45RO染色為位于細胞膜上的棕黃色顆粒，陽性率為90%；B細胞標記物CD20均為陰性；大部分病例為胞質CD3（CD3ε）陽性，棕黃色顆粒位于細胞質內，陽性率為17/20（85%）；部分病例為NK細胞標記物CD56陽性，棕黃色顆粒位于細胞膜上，陽性率為13/20（65%）； 細胞毒性標記物TIA和GranzymeB陽性均為棕黃色顆粒，位于細胞質內，陽性率分別為17/20（85%）、14/20（70%），TIA的陽性率高于GranzymeB.
轉貼于
2.2原位雜交（ISH）結果用質粒RA386制作出EB病毒編碼的小核RNA（EBER）寡核苷酸探針，得出最適RNA探針的濃度為1∶100，后用ISH方法檢測20例病例，結果陽性顯色為位于腫瘤細胞核上的深藍色顆粒，14例EBER陽性，陽性率為70%. 提示EBERISH有高的敏感性.
3討論
鼻型NK/T細胞淋巴瘤（NK/TCL）不典型的臨床癥狀及復雜的組織細胞形態給臨床病理診斷帶來了一定的困難，但現代分子生物學技術發展彌補了臨床病理診斷的不足［1，2］. 本研究用多種抗體檢測病理切片，CD3ε，CD45RO，CD56，TIA1和GranzymeB較高的陽性率給NK/TCL的確診提供了依據. EBER作為一個高度敏感的EBV標記物［3］，在遇到疑難病例時很有幫助. 但在診斷中需要注意CD56陽性的意義，簇狀CD56陽性表達提示NK/TCL［4］，正?；蚍从承圆∽冎胁粫霈F簇狀CD56陽性表達. 而且CD56抗體在實踐操作中的陽性率并不是很高，本次實驗病例的陽性率僅為65%. 同時發現其他抗體如CD3ε，CD45RO，TIA1和GranzymeB在實際操作中常與理論結果有一些誤差，因此在日常病理診斷中選擇上述一組抗體作為診斷參數是非常重要的.
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