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摘要：探討植物生長調節劑、基本培養基、蔗糖質量濃度以及相關添加物對鐵皮石斛莖段原球莖的誘導、增殖、分化以及根部生長等方面的影響。方法：通過正交試驗方式，要求沒有添加激素下，對鐵皮石斛莖段原球莖進行消毒處理、試驗培養基的配備、對原球莖進行誘導、對原球莖進行增殖和分化處理、生根的培養等，分析不同植物生長調節劑、基本培養基配比對于莖段原球莖的誘導影響，不同基本培養基、馬鈴薯泥以及蔗糖濃度增殖分化原球莖效果，以及香蕉泥、萘乙酸（ＮＡＡ）和馬鈴薯泥對鐵皮石斛莖段原球莖生根效果。結果：１）最適宜誘導鐵皮石斛莖段原球莖的培養基組合是ＮＡＡ０１ｍｇ／Ｌ＋１／２ＭＳ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ）培養基＋６芐氨基腺嘌呤（６ＢＡ）４ｍｇ／Ｌ。２）鐵皮石斛莖段原球莖增殖最佳的培養基是：ＭＳ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ；分化的最佳培養基是：馬鈴薯泥１０％＋蔗糖１０ｇ／Ｌ＋１／２ＭＳ。３）鐵皮石斛莖段原球莖的生根最佳培養基組合是馬鈴薯泥１０％＋１／２ＭＳ＋ＮＡＡ１ｍｇ／Ｌ＋香蕉泥１０％。結論：在沒有添加激素的前提下，基于正交試驗方式發現變化蔗糖含量和基本培養基能夠對鐵皮石斛莖段原球莖增殖和分化效果進行調節，并找出了最理想的組合模式。
關鍵詞：鐵皮石斛；原球莖；植株再生；誘導；增殖；分化；馬鈴薯泥；香蕉泥
鐵皮石斛是蘭科石斛多年生草本植物，據相關文獻記載，其味甘，歸胃、腎經，性微寒；具有滋陰清熱，益胃生津等功效。近代研究表明鐵皮石斛的多糖具有抗腫瘤、增強免疫力、抗氧化以及降血糖等方面的作用。通過人工培養技術可以有效的擴大其生長產量，組培工廠化的生育苗一般需要保證配方的穩定，增殖系數比較高，種苗的質量有保障。近幾年以來出現了很多鐵皮石斛組織培養的企業，通過莖段原球莖的途徑可以讓最終生產出的種苗都來自同一顆木本，這樣就可以讓其后期的種苗整齊一致，而且還可以有效的提高增殖系數。
１.材料與方法
１.１材料野生的鐵皮石斛是此次試驗最重要的素材
其對于生長環境以及氣候等方面的要求標準非常高，很多時候都是將其種植在溫室大棚中［１］。這樣可以有效控制其生長所需的濕度、溫度以及透光度等條件，在此選擇生長健康的，沒有病蟲災害的當年嫩莖將其除葉作為試驗材料［２］，如圖１所示。
１.２方法
１.２.１消毒處理主要操作流程就是自來水沖洗流水沖洗濾紙吸干水分［３］。將其在超凈的工作臺上進行修剪，剪成每個段都包含１～２個莖節，長度約為３ｃｍ。接下來將其放在濃度為７５％的乙醇中浸泡，時間為３０ｓ，到時間后再將其放入濃度為０１％的升汞溶液中浸泡，時間為６ｍｉｎ［４］。最后就需要再沖洗１次，一般是采用無菌水，再通過無菌濾紙完成干燥處理，然后將終端的傷口進行切除處理形成帶一個節的段，然后再將其接種到試驗培養基。１.２.２試驗培養基的配備以ＶＷ（ＶａｃｉｎａｎｄＷｅｎｔ）培養基、１／２ＭＳ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ）培養基和ＭＳ作為試驗基礎培養基來進行試驗，在添加相關生長調節劑的時候需要根據不同的培養時期來配置不同比例和濃度，另外還需要考慮將香蕉和馬鈴薯等作為附加物添加到培養基內部。在添加的過程中要注意對馬鈴薯進行相關處理，先去掉外皮然后再進行稱重，再將其切成小塊，在使用之前還需要將其煮爛打碎成漿［５］；同樣對于香蕉的使用前也要進行稱重剝皮，然后研磨成香蕉泥才可以使用。所有的培養基都需要調節其ｐＨ值為５６，還需要添加瓊脂７ｇ／Ｌ，這樣保持在１２１℃的狀況下保持２０ｍｉｎ目的就是進行有效的滅菌，然后等其冷卻凝固后再使用［６］。１.２.３原球莖誘導采用正交的試驗方式對Ｎ乙酰天冬氨酸（Ｎａｃｅｔｙｌａｓｐａｒｔａｔｅ，ＮＡＡ）（０１、０５、１０ｍｇ／Ｌ）、６芐氨基腺嘌呤（６Ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ，６ＢＡ）（１、２、４ｍｇ／Ｌ）以及基本培養基（ＭＳ，１／２ＭＳ，ＶＷ）對原球莖誘導率產生的影響進行研究分析，具體展開過程中，首先對所有培養基依次添加３０ｇ／Ｌ蔗糖［７］。其次把莖段接種每個培養基上進行培養，單次接種處理數量為３０瓶，１瓶對應１個莖段［８］。１.２.４原球莖增殖和分化處理依然通過正交設計試驗方式對馬鈴薯泥質量（質量分數５％、１０％、２０％）、蔗糖（不同含量１０、２０、３０ｇ／Ｌ）以及基本培養基（ＭＳ，１／２ＭＳ，ＶＷ）對原球莖增殖和分化產生的具體影響進行研究分析。首先對適合原球莖增殖分化的培養基進行篩選。其次采取頂部具備葉原基、顏色為淡綠色、沒有出現真葉分化的原球莖，并對其進行切割形成直徑在１０～１５ｃｍ的小塊，切割完成后接種到不同的培養基當中，單次處理接種數量為２０瓶，一瓶對應１０塊原球莖［９］。見圖２。１.２.５生根培養為了能夠篩選出最佳適宜生根的培養基，采用正交設計的試驗方式來研究馬鈴薯泥（質量分數５％、１０％、２０％）、萘乙酸（ＮＡＡ）（０１、０５、１０ｍｇ／Ｌ）以及香蕉泥（質量分數５％、１０％、２０％）的用量，每個培養基同樣需要添加蔗糖含量為２０ｇ／Ｌ。取高度范圍在１０～１５ｃｍ的小苗，將其依次接種到每個生根培養基當中，單次處理接種數量為２０瓶，１瓶對應１２叢小苗，每叢小苗上要保證具備３～４個芽［１０］。１.２.６培養試驗所需條件對于試驗所需條件也應該給予嚴格的規定，各個培養階段的光照時間應該滿足１２ｈ／ｄ，培養室內部的溫度也應該保持在（２７±２）℃，內部光照強度也要維持在４０００～５０００ｌｘ。
2.結果
2.１不同植物生長調節劑、基本培養基配比對于莖段原球莖的誘導影響效果
在原球莖誘導培養的試驗上接種消毒后的莖段，大約培養２０ｄ后腋芽就開始出現逐漸膨大的跡象，３０ｄ后就會萌發出不定芽。然后在經過２個月的培養后對生長出的不定芽進行切割，使其脫離莖段，然后將其轉接到相同的培養基當中進行３個月的后續培養，并對原球莖的誘導率進行統計，其結果如表１所示。通過簡單重復序列（ＳｉｍｐｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）檢驗，最終發現６ＢＡ和基本培養基為鐵皮石斛莖段原球莖誘導率帶來的影響更加突出，ＮＡＡ各個水平間并無明顯差異。而１／２ＭＳ和ＭＳ基本培養基誘導率的平均值分別可以達到１７２０和２８４０，二者結果相差不大，但是和ＶＭ誘導率平均值４８０比較，相差顯著；另外，濃度為４ｍｇ／Ｌ的６ＢＡ其誘導率均值結果為２５３０，和１ｍｇ／Ｌ的誘導率存在較大差異。結合以上數據結果，可以得出：最適宜誘導鐵皮石斛莖段原球莖的培養基組合是ＮＡＡ０１ｍｇ／Ｌ＋１／２ＭＳ＋６ＢＡ４０ｍｇ／Ｌ。
2.２不同基本培養基、馬鈴薯泥以及蔗糖濃度增殖分化原球莖效果
基本培養基對于鐵皮石斛莖段原球莖的增殖率和分化率影響都有著明顯的效果，其中ＭＳ的增殖率達到了１１８０，效果是最好的，相比ＶＷ和１／２ＭＳ的增殖率效果差異非常明顯。而分化率則是均值為５８６的１／２ＭＳ效果最佳，和ＭＳ的分化率呈現出較強的優勢。蔗糖對于鐵皮石斛莖段原球莖的增殖和分化效果也比較明顯，馬鈴薯泥的影響相對來說均沒有達到顯著的差異，但是增加了１０％的馬鈴薯泥后鐵皮石斛莖段原球莖的分化苗變得更加粗壯。因此，可以得出的結論就是鐵皮石斛莖段原球莖增殖最佳的培養基是：ＭＳ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ；分化的最佳培養基是：馬鈴薯泥１０％＋蔗糖１０ｇ／Ｌ＋１／２ＭＳ。該正交試驗結果見表２～３。
2.３香蕉泥、ＮＡＡ和馬鈴薯泥對鐵皮石斛莖段原球莖生根效果的分析
試驗過程中將分化后的鐵皮石斛莖段原球莖接入馬鈴薯泥１０％＋蔗糖１０ｇ／Ｌ＋１／２ＭＳ中培養大約２個月的時間，苗高大約在１～１５ｃｍ上下然后將其接到生根的培養基４個月的時間，然后統計其生根的跟長、根數以及苗柱高度（圖３）。根據統計，ＮＡＡ對于根長以及根數的影響效果較好，對于苗柱的高度影響方面不是非常明顯；馬鈴薯泥對于苗柱高度的影響效果顯著，但是對于根長和根數的影響效果卻不是很明顯；香蕉泥對于根長的影響效果非常明顯，但是對于根數以及苗柱高度的影響卻不是很明顯。綜上所述，鐵皮石斛莖段原球莖的生根最佳培養基組合是馬鈴薯泥１０％＋１／２ＭＳ＋ＮＡＡ１ｍｇ／Ｌ＋香蕉泥１０％。見表４、表５。
3.討論
組織培養過程中，通過ＳＳＲ檢驗，最終發現６ＢＡ和基本培養基為鐵皮石斛莖段原球莖誘導率帶來的影響更加突出，ＮＡＡ各個水平間并沒有明顯的差異。１／２ＭＳ和ＭＳ基本培養基誘導率的平均值分別可以達到１７２０和２８４０，二者結果相差不大，但是和ＶＭ誘導率平均值４８０比較，相差顯著；另外，濃度為４ｍｇ／Ｌ的６ＢＡ其誘導率均值結果為２５３０，和１ｍｇ／Ｌ的誘導率存在較大差異。說明不同的濃度在誘導鐵皮石斛莖段原球莖的培養方面產生非常大的差異，需要嚴格取樣來誘導培養。在組織培養過程中，香蕉和馬鈴薯作為添加物放置到培養基中，暫時無法判斷產生的物質具體情況，但是可以實現對植物生長的促進效果，與其他研究結果相似［１１１３］，認為馬鈴薯對促進苗生長有積極作用［１４１５］，香蕉乳對鐵皮石斛的生根也帶來積極影響，二者共同作用下，可以提高鐵皮石斛的生長［１６］，有研究表明香蕉提取液可以作為培養基的緩沖劑，通過控制培養基的ｐＨ值，來進一步誘導生根［１７１８］。鐵皮石斛的產地、種類，培養過程中的溫度、光照強度、時間等都對誘導腋芽產生差異的效果［１９２１］。本研究中通過控制培養環境，提高研究的科學性，研究中對于試驗所需條件也應該給予嚴格的規定，各個培養階段的光照時間應該滿足１２ｈ／ｄ，培養室內部的溫度也應該保持在（２７±２）℃，內部光照強度也要維持在４０００～５０００ｌｘ。同時，沒有添加激素的情況下，有利于建立基本培養基及添加物對研究樣本的實驗條件。在原球莖誘導、增殖、分化過程中，植物激素的作用顯而易見，一般情況下高濃度的細胞分裂素有利于誘導芽的產生，而低濃度的生長素有利于根的形成，但是不同濃度的激素對芽、根產生異常影響，不利于后續鐵皮石斛的各種藥物機制和增殖研究。因此，本研究探討了不添加激素的情況下，鐵皮石斛的誘導、增殖和分化研究。在鐵皮石斛莖段原球莖的組織培養過程中，原球莖的分化屬于至關重要的一環，其分化效果對控制組培過程化的生產投入有著十分重要的意義。根據相關研究發現，通過配合使用生長素與特定濃度的細胞分裂素，可以有效改善鐵皮石斛原球莖分化效果，但是對于濃度有嚴格的要求，過高或者過低都不利于其分化。由于鐵皮石斛的組織培養周期較長，不同階段的培養基需要有不同的成份和條件，增殖與分化所用的培養基差異化也對鐵皮石斛莖段生芽到生根產生影響，本研究結果顯示，最適宜誘導鐵皮石斛莖段原球莖的培養基組合是ＮＡＡ０１０ｍｇ／Ｌ＋１／２ＭＳ＋６ＢＡ４ｍｇ／Ｌ，鐵皮石斛莖段原球莖增殖最佳的培養基是：ＭＳ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ；分化的最佳培養基是：馬鈴薯泥１０％＋蔗糖１０ｇ／Ｌ＋１／２ＭＳ。鐵皮石斛莖段原球莖的生根最佳培養基組合是馬鈴薯泥１０％＋１／２ＭＳ＋ＮＡＡ１ｍｇ／Ｌ＋香蕉泥１０％，３個不同階段的培養基要求不一樣。同時在培養的過程中對于激素的使用也會引起種苗產生變異。本研究所進行的試驗在沒有添加激素的前提下，基于正交試驗方式發現變化蔗糖含量和基本培養基能夠對鐵皮石斛莖段原球莖增殖和分化效果進行調節，并找出了最理想的組合模式。
作者:廣州中醫藥大學第一附屬醫院 單位:廣東省第二中醫院