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摘要：探究芒果苷對高糖(HG)缺氧誘導的大鼠視網膜毛細血管內皮細胞(RRCEC)損傷的保護作用及其潛在機制。方法:將RRCEC細胞暴露在30mmol/L葡萄糖和缺氧環境中，建立體外糖尿病視網膜病(DR)模型。分為對照組、HG缺氧組、芒果苷低濃度(0.05mmol/L)組、芒果苷中濃度(0.1mmol/L)組、芒果苷高濃度(0.2mmol/L)組、芒果苷中濃度+LY294002組、芒果苷中濃度+IGF-1組、HG缺氧+LY294002組和HG缺氧+IGF-1組；通過CCK-8、劃痕實驗和成管實驗來評估RRCEC的增殖、遷移和血管新生；Westernblotting檢測HIF-1α、VEGF、p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR的蛋白表達。此外，利用PI3K/AKT/mTOR信號通路特異性抑制劑LY294002和激動劑IGF-1驗證芒果苷的潛在機制。結果：與對照組相比，HG缺氧組RRCEC細胞的增殖、遷移和血管新生明顯增加,HIF-1α和VEGF蛋白表達顯著上調，p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR比值顯著增加(P＜0.05)；與HG缺氧組相比，芒果苷低、中、高濃度組RRCEC細胞遷移和血管新生明顯降低，HIF-1α和VEGF蛋白表達明顯下調（P＜0.05),芒果苷中濃度組可顯著降低p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR比值（P＜0.05)。IGF-1對PI3K/AKT信號通路的進一步激活抑制了芒果苷對RRCEC的保護作用，而抑制劑LY294002則顯示出相反的結果。結論:芒果苷可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，顯著降低HG/缺氧誘導的RRCEC細胞遷移和血管生成能力。
關鍵詞：芒果苷;PI3K/AKT/mTOR信號通路;糖尿病視網膜病；血管新生
糖尿病視網膜病(diabeticretinopathy,DR)是糖尿病的常見并發癥[1]。據估計，到2030年全球DR患者的數量將達到1.91億[2]。高血糖介導的毛細血管損傷引起視網膜缺血缺氧以及玻璃體岀血，進而發生增殖性視網膜病變，最終導致失明[1]。目前的主要治療干預措施仍無法完全避免并發癥[3]。DR的主要病理特征是視網膜血管閉塞性循環障礙，以及內皮細胞增殖、遷移和血管形成[4],因此抑制視網膜血管新生是治療DR的重要手段。芒果苷是一種雙苯毗酮類黃酮類免疫調節化合物，具有抗腫瘤、抗感染、降血糖、抗氧化和免疫調節等多種藥理作用[5]。研究發現芒果苷對鏈脲菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠血液生化參數能夠發揮保護作用[6]。然而，芒果苷對糖尿病高糖(HG)和缺氧環境誘導的視網膜毛細血管內皮細胞(RRCEC)損傷是否具有保護作用尚未完全清楚。因此，本研究旨在研究芒果苷對RRCEC細胞暴露于HG/缺氧環境后增殖、遷移和血管新生能力的影響及可能的機制。
1材料與方法
1.1主要試劑大鼠視網膜
毛細血管內皮細胞系RRCEC（ProcellLifeScience，美國)；DMEM細胞培養基和FBS(ClarkBioscience，美國)；芒果苷、青霉素/鏈霉素雙抗、D-(+)-葡葡萄和二甲基亞砜(DMSO)試劑(SigmaAldrich，美國)；細胞計數試劑盒(CCK-8)(Abcam公司，英國)；磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白質絲蘇氨酸激酶(AKT)信號通路抑制劑LY294002和激活劑胰島素樣生長因子(IGF-1)(Sig-maAldrich，美國)；抗血管內皮生長因子（VEGF)抗體、抗缺氧誘導因子-lα(HIF-lα)抗體、抗PI3K抗體、抗AKT抗體、抗雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體、抗PI3K磷酸化抗體、抗AKT磷酸化抗體和抗mTOR磷酸化抗體(Abcam，英國)。
1.2細胞培養RRCEC細胞培養
在含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/鏈霉素的高糖DMEM培養基中，放入含有5%CO2的37°C全濕度恒溫細胞培育箱內培養。
1.3實驗分組和處理
將RRCRC細胞分為9組對照組、HG缺氧組、芒果苷低濃度(0.05mmol/L)組、芒果苷中濃度(0.1mmol/L)組、芒果苷高濃度(0.2mmol/L)組、芒果苷中濃度+LY294002組、芒果苷中濃度+IGF-1組、HG缺氧+LY294002組和HG缺氧+IGF-1組。各組處理如下:HG缺氧組RRCEC細胞接種于含有D-(+)-葡萄糖(30mmol/L)的DMEM培養基中，置于37℃缺氧(1%,94%N2和5%CO2)培養箱內培養；芒果苷低、中、高濃度組在HG缺氧環境中預處理后，在培養基中分別加入0.05mmol/L，0.1mmol/L和0.2mmol/L芒果苷。芒果苷中濃度+LY294002組在細胞培養基中加入0.1mmol/L芒果苷和PI3K/AKT信號通路抑制劑(LY294002，40μmol/L)；芒果苷中濃度+IGF-1組在培養基中加入0.1mmol/L芒果苷和通路激活劑(IGF-1，100ng/mL)；HG缺氧+LY294002組和HG缺氧+IGF-1組按上述劑量分別在培養基中加入LY294002和IGF-1，均37℃下干預24h。對照組細胞用相同濃度DMSO處理。
1.4Westernblotting檢測
HIF-1α、VEGF、p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR蛋白表達將RRCEC細胞平均鋪入6孔板中（1×106個/孔），如前所述處理。PBS清洗3次，每孔加入90μL裂解緩沖液+10μL蛋白酶抑制劑對樣本進行勻漿，冰上裂解30min。4℃，12000r/min離心20min。BCA法檢測樣本蛋白含量，煮沸變性。應用SDS-PAGE凝膠對40μg總蛋白進行電泳。濕轉將蛋白轉移至PVDF膜上,8%脫脂牛奶封閉非特異性蛋白1h,4℃下分別用抗抗VEGF（1∶1000）、抗HIF-lα（l∶500）,抗PI3K（1∶1000），抗AKT（1∶10000），抗mTOR（1∶1000），抗p-PI3K（1∶500），抗p-AKT（1∶5000），抗p-mTOR（1∶1000）和抗β-actin（1∶1000）抗體孵育過夜。隨后,將膜與山羊抗兔IgG二抗（1∶2000）或山羊抗鼠IgG二抗（1∶2000）在室溫下孵育1h,采用ECL化學發光法顯示蛋白條帶,Image-ProPlus6.0進行灰度分析。
1.5CCK-8實驗評估細胞增殖
為了選擇芒果苷的最佳濃度。按照之前報道方法[7]。RRCEC細胞在HG和缺氧預處理后，用芒果苷分別在37℃進行濃度梯度（0.01mmol/L、0.1mmol/L、lmmol/L和10mmol/L）和時間梯度（24h、48h、72h）干預。根據CCK-8試劑盒說明書，以每孔1500個細胞接種于96孔板內，每個濃度設置6個復孔。細胞按照上述方式處理后，每孔加入CCK-8試劑，混勻后在37℃細胞培育箱內繼續培養1.5h。采用酶標儀450nm檢測細胞吸光度值（OD值）。
1.6成管實驗評估
血管新生96孔板每孔中加入。60μL預先冷卻的Matrigel基質膠，37℃凝固1h。各組細胞胰酶消化后計數,每孔加入細胞（5×104個/mL）,缺氧條件下培養6h，然后轉移到常氧條件下培養12h。用芒果苷（0.05mmol/L，0.1mmol/L和0.2mmol/L）在缺氧條件下處理細胞24h,利用倒置相差顯微鏡，在5個隨機選擇的視野中觀察血管生成狀況。
1.7劃痕實驗評估
細胞遷移各組RRCEC細胞分散。平鋪在6孔板中（5x105個細胞/孔）。100%聚集后，用無菌微量移液槍頭在每個細胞單層上整齊劃岀劃痕，PBS清洗除去細胞碎片。用芒果苷（0.05mmol/L、0.1mmol/L和0.2mmol/L）在37℃和缺氧條件下處理細胞24h。使用倒置相差顯微鏡在24h內3個不同時間點觀察劃痕的恢復程度。
1.8統計學方法采用
SPSS26.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料采用均數±標準差（xˉ±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本，檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey'sposthoc檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。
2結果
2.1芒果苷對HG/缺氧誘導的RRCEC活性和增殖
的影響與對照組相比,0.01~10mmol/L濃度芒果苷均可抑制RRCEC的活性（P＜0.001），具有濃度依賴性；隨著芒果苷干預時間的增加，細胞活性逐漸增加（P＜0.001）；但0.1mmol/L芒果苷處理48h時，與對照組相比，細胞活力未見明顯改變（P＞0.05），見圖1A。CCK8結果顯示，與對照組相比,HG缺氧組RRCEC細胞增殖能力明顯增加（P＜0.05）,而與HG缺氧組相比，芒果苷各濃度組對RRCEC細胞增殖能力均無統計學差異（P＞0.05）,見圖1B。
2.2芒果昔對HG缺氧誘導的RRCEC細胞遷移能力的影響
劃痕實驗結果顯示，與對照組相比,HG缺氧組細胞相對遷移距離顯著增加（P＜0.01）；與HG缺氧組相比，芒果苷低、中、高濃度組細胞遷移能力均明顯降低（P＜0.05）,各芒果昔濃度組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）,見圖2。
2.3芒果昔對HG缺氧誘導的RRCEC細胞血管新生的影響
成管實驗結果顯示，與對照組相比，HG缺氧組微管長度變長，分支數增多，血管新生能力顯著增強（P＜0.05）；與HG缺氧組相比，芒果苷中、高濃度組細胞中HIF-la和VEGF的蛋白表達均降低（P＜0.01）,見圖4。
2.4芒果昔可抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性與對照組相比
HG缺氧組細胞中p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR的比值升高（P＜0.05）；與HG缺氧組相比，芒果昔中濃度組p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR的比值下降（P＜0.05）芒果昔低濃度組僅p-PI3K/PI3K的比值下降（P＜0.05）,而芒果苷高濃度組與HG缺氧組相比無顯著統計學差異（P＞0.05），見圖5。
2.5PI3K/AKT/mTOR激動劑和抑制劑對HG缺氧
誘導的RRCEC細胞遷移和血管生成的影響劃痕實驗（圖5A）結果發現，與HG缺氧組相比，芒果昔中濃度組和HG缺氧+LY294002組均抑制RRCEC遷移能力（P＜0.05）；與芒果苷中濃度組相比,芒果昔中濃度+LY294002組細胞遷移能力受到抑制（P＜0.05）。而與HG缺氧組相比,HG缺氧+IGF-1組細胞的遷移能力增加（P＜0.05）；與芒果昔中濃度組相比，芒果昔中濃度+IGF-1組亦導致細胞遷移增加（P＜0.05）。成管實驗（圖5B）表現岀與遷移實驗相似的結果,與HG缺氧組相比，芒果昔中濃度組和HG缺氧+LY294002組分支點數量減少；與芒果昔中濃度組相比，芒果昔中濃度+LY294002組分支點數減少。而與HG缺氧組相比,HG缺氧+IGF-1組新生血管和分支點數增多；芒果昔中濃度+IGF-1組血管新生較芒果苷中濃度組增加。華炳紅，等.基于PI3K/Akt/mTOR途徑研究芒果苷對糖尿病誘導視網膜微血管損傷的保護作用及機制
3討論
長期暴露于高血糖和缺氧環境被認為是DR血液-視網膜屏障和微血管損傷的主要原因[8]。由于DR的發病機制復雜，目前的治療干預措施無法完全避免DR的發生。因此，探索DR的病理機制，尋找新型藥物來降低DR的發病率和致盲率己成為當前重要的研究方向。DR病理改變的主要原因是糖尿病導致的微血管內血流動力學異常對視網膜微血管的損害。由于糖尿病對血管和血液因素的影響導致視網膜微血管閉塞，發展為視網膜缺血缺氧，引起視網膜釋放大量血管生長因子，通過內皮細胞的缺氧信號促進血管內皮細胞的增殖和遷移,從而引起新生血管的形成[4]。鑒于此，本研究將RRCEC置于HG缺氧環境中，模擬DR體外細胞模型，研究在不同條件下RRCEC細胞增殖、遷移和血管新生的變化。結果發現，在HG缺氧條件下RRCEC細胞的增殖、遷移和血管新生能力均明顯高于對照組，這些結果與DR的主要病理特征相符。芒果苷是一種天然的多酚酸類化合物,廣泛存在于漆樹科芒果的果實、葉、皮中。研究發現芒果苷對高血糖和糖尿病表現岀明顯的藥理保護作用，可降低糖尿病大鼠血清中炎癥因子的釋放，抑制氧化應激，同時能夠顯著改善糖尿病患者的胰島素敏感度和血糖水平[9]。Deng等研究發現，芒果苷可通過阻斷PI3K/AKT通路抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[10]。但芒果苷與糖尿病高糖缺氧環境誘導的視網膜微血管內皮損傷之間的關系尚未可知。內皮細胞增殖和遷移是血管生成的標志之一，本研究結果顯示，芒果苷(0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L)對HG缺氧誘導的RRCEC增殖活性未表現出抑制作用，但可明顯降低RRCEC的遷移和新生血管形成。這與Daud等[11]的發現一致，體外實驗中芒果苷可增加主動脈內皮細胞的遷移，但對細胞增殖沒有顯示岀影響。HIF-lα是調控缺氧的重要因子，可作為轉錄因子與VEGF啟動子結合，促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和血管新生[12]。VEGF作為目前發現最強的促血管生成因子，參與視網膜和脈絡膜血管新生[13]。而且，HIF-1α和VEGF的表達在介導活躍的視網膜血管生成和緩解DR的進展中發揮主要作用。臨床試驗也證實，抗血管內皮生長因子藥物可用于治療眼部疾病的血管生成。本研究發現，芒果苷對HG缺氧誘導RRCEC細胞的管腔形成具有明顯的抑制作用；中濃度和高濃度芒果苷治療后,HIF-lα和VEGF蛋白表達較HG缺氧組明顯降低，然而低濃度芒果苷對此未產生明顯影響，因此合適濃度的芒果昔治療可顯著降低HG缺氧誘導RRCEC細胞遷移。PI3K/AKT/mTOR信號通路在多種血管疾病中發揮促進作用[14]。磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸在PI3K催化下生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3),激活下游AKT的磷酸化，進而激活mTOR[15]。PI3K/AKT/mTOR信號通路在調節DR中的HIF-1α/VEGF信號表達中起著至關重要的作用[16]。值得注意的是，Sa-sore等[14]報道，PI3K/AKT/mTOR信號通路通過誘導視網膜細胞的增殖、凋亡、遷移和血管生成來促進DR的發生發展；芒果苷可通過激活大腦中的PI3K/AKT/mTOR信號通路減少氧化應激，對腦血管內膜產生保護作用。鑒于此，本課題組推測芒果昔可能通過調節PI3K/AKT/mTOR信號通路來防止DR過程中視網膜毛細血管內膜增生。結果發現，相較HG缺氧組，中濃度芒果苷干預可顯著下調p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR的比值。表明芒果苷可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活緩解HG缺氧誘導的視網膜毛細血管損傷，中濃度(0.1mmol/L)可能是最適濃度。高濃度芒果苷并沒有降低HG缺氧誘導的RRCEC細胞中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平，這表明高濃度芒果苷不利于抑制蛋白質磷酸化的作用。筆者推測高濃度芒果苷可能激活或抑制其他上游信號通路，以降低PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平。因此，需要進一步實驗證實高濃度芒果苷對PI3K/AKT信號通路上游成分的影響。本研究還發現，給予RRCEC細胞PI3K/AKT信號通路特異性抑制劑LY294002處理可產生與芒果苷同樣的效果，進一步對細胞的遷移和血管新生能力產生抑制作用。IGF-1對PI3K/AKT信號通路的激活則可明顯降低芒果苷對RRCEC細胞遷移和血管新生的保護作用。以上結果表明，PI3K/AKT/mTOR信號通路在糖尿病誘導的視網膜微血管損傷中發揮重要的調節作用，而中濃度芒果苷可通過此途徑對HG缺氧誘導的RRCEC細胞損傷產生最佳的保護作用。綜上所述，芒果苷可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，顯著降低HG缺氧誘導的RRCEC細胞遷移和血管新生，顯示出對DR的保護作用，芒果苷可能是治療DR的有效藥物。
作者:華炳紅 李馥伶 陳琳 單位:中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院內分泌代謝科 中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院