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傳統的功能微生物鑒定方法是在含有特定碳源培養基上對目標微生物進行富集、分離與純化，由于實驗室可培養的微生物只占微生物總數的0.1~1%[1]，因此以純培養技術為代表的鑒定方法存在很大局限性。20世紀后半葉，以分子生物學為特色的現代土壤微生物研究方法取得突破性進展，包括以磷脂脂肪酸（PLFA）技術為代表的生物化學方法，以BIOLOG技術為代表的生理學方法和基于DNA多態性的微生物群落結構和功能多樣性的分子生態學技術，如變性梯度凝膠電泳（DGGE）、限制性片段長度多態性（RFLP）、末端限制性酶切片段長度多態性分析（T-RFLP）和實時熒光定量PCR技術（RT-PCR）等。上述技術提高了人們對土壤微生物群落結構組成的認識，但仍難提供有關微生物間相互作用及代謝功能微生物的直接信息[1-2]。例如，DGGE和T-RFLP等分子指紋圖譜方法只能檢測環境樣品中的優勢微生物群落，但具有特定生態和環境功能的微生物通常在數量上并不占優勢[3]。因此，功能微生物很難被這些分子指紋圖譜方法所鑒別[2]。據估算，每克土壤含有約100億個微生物個體，包括100萬種不同的微生物種群。利用上述技術，從這些難以計數的土壤微生物中原位鑒別特定生態過程的微生物驅動者是難以想象的[4]。近年來得到廣泛關注的穩定性同位素探針技術與現代分子生物學相結合，可以在相對未受干擾的環境樣品中培養功能微生物，利用穩定性同位素示蹤復雜環境中的功能微生物核酸（DNA/RNA）或PLFA[5]，在分子水平鑒定生態系統重要過程的微生物驅動者。其基本原理是在土壤中添加含有穩定性同位素標記的代謝底物，土壤中利用該標記底物的微生物細胞在其生長繁殖過程中同化合成含標記元素的生物標志物。通過對生物標志物進行提取、分離、鑒定和比對分析，鑒別土壤中驅動特定生態過程的功能微生物。該方法可以準確獲得功能微生物的目的基因，避免了從浩瀚基因庫里一個個篩選目的基因的煩勞工作，已成為原位鑒定功能微生物的重要手段。 1土壤功能微生物sip鑒定技術流程 SIP技術是耦合微生物遺傳多樣性與代謝多樣性最有力的工具之一，該技術以復雜的原位或微宇宙土壤樣品為研究對象，采用穩定性同位素原位標記土壤樣品中特定微生物的DNA、RNA或PLFA。目前絕大多數研究采用13C標記底物培養土壤，利用13C-底物的微生物細胞不斷分裂、生長、繁殖，合成含13C標記的DNA或RNA等生物標志物。提取土壤樣品中13C-核酸和12C-核酸總混合物，用超高速離心技術將13C-核酸與12C-核酸分離，利用分子生物學手段對生物標志物進行分析，以鑒別土壤功能微生物。近年來，以15N和18O為基礎的SIP技術也被成功應用于微生物驅動的土壤生態過程研究[6]。 1.1土壤SIP技術前處理方法選擇 SIP技術前處理包括標記底物的培養和特定微生物核酸或磷脂脂肪酸提取兩個步驟。培養方式主要包括添加營養液富集培養和僅添加標記底物培養等方式。添加營養液富集培養法可以為微生物生長提供相對穩定的環境，并促進微生物的生長，以獲得足夠的核酸或磷脂脂肪酸提取量[7]。土壤DNA/RNA的提取方法主要包括試劑盒提取法和液氮研磨法等。試劑盒法操作簡單，提取純度高，但提取量較低，費用高。液氮研磨法可以較好保證DNA/RNA的完整性，提取量相對較高，且操作費用低，時間短，但需純化后才能滿足RT-PCR等后續分子生物學要求[8]。土壤PLFAs提取方法主要為兩種：一種是PLFAs法，即先通過氯仿-甲醇單相萃取浸提土壤微生物脂肪酸，再經硅膠柱純化以及酯化作用得到活體細胞膜結合態FAME，提取的脂肪酸種類僅有El-脂肪酸，多為細菌所特有。另一種是TSFAMEs法，即通過堿甲醇分解法提取總土壤FAMEs。提取的脂肪酸種類包括酯連接和非酯連接PLFAs，多為真菌所特有[9]。 1.2土壤SIP技術中生物標志物的選擇 土壤SIP技術中特定微生物的生物標志物為PLFA、DNA和RNA3種。PLFA-SIP法是將PLFA從重穩定性同位素（如13C）標記過的環境樣品中提取出來，通過PLFA圖譜分析微生物群落的結構和多樣性，再通過氣相色譜-燃燒-同位素比率質譜聯用法測定各種PLFA中13C的豐度[7]。PLFA-SIP的標記底物濃度要求較低，靈敏度較高，但存在一些缺點：（1）對于未知PLFA分子圖式的不可培養微生物，或者土壤中的某種特殊脂肪酸無法與特定種類的微生物相對應，該方法就無法鑒定功能微生物。（2）該方法在很大程度上依賴于標記脂肪酸來確定土壤微生物群落結構，標記上的變動將導致群落估算上的偏差。（3）細菌和真菌生長條件的改變或環境脅迫都能導致脂肪酸類型的改變[9]。同PLFA-SIP法相比，DNA-或RNA-SIP可獲得更直接的功能微生物遺傳信息。DNA-SIP的優點是：標記的13C-DNA一定來自新產生的子代微生物細胞，是證明微生物原位生長并驅動生態過程的最直接證據。另外，DNA完美的雙鏈結構保證了遺傳物質的穩定[10]。DNA-SIP的缺點是：自然環境中能被微生物利用的底物濃度通常很低，微生物大量分裂繁殖的可能性低，常需使用較高濃度的標記底物來刺激目標微生物的分裂繁殖，可能導致研究結果與原位自然環境的實際情況不相吻合[6,11]。RNA-SIP在一定程度上能克服上述缺點。自然環境中特定功能微生物發揮作用的同時，即使沒有大量增殖生長，但具功能基因得到表達并在核糖體內合成蛋白質，獲得標記的13C-RNA則表明微生物可能具有較強的活性。因此，RNA-SIP能夠采用更低的標記底物濃度培養環境樣品，研究結果更接近原位狀況[12]。但因mRNA半衰期短、降解速度快，mRNA-SIP的實際應用仍存在較大的技術難度[13]。DNA-SIP和RNA-SIP的結合將會大大提升SIP技術的潛力。 1.3土壤SIP分離后的分析方法 13C-核酸與12C-核酸分離后，可以利用分子生物學手段對功能微生物的DNA/RNA進行分析，以鑒別土壤中重要生態過程的微生物驅動者。目前的主要分析方法包括分子指紋圖譜法、實時定量PCR法和454高通量測序法等。（1）分子指紋圖譜法是目前進行功能微生物的DNA/RNA分析的廣泛使用的快捷方法，但分子指紋圖譜分析方法的靈敏度較低。環境樣品中微生物通常數以百萬計，采用古菌或細菌通用引物的DGGE和T-RFLP只能檢測環境樣品中數量上占優勢的微生物[14]。具有較為重要的生態和環境功能目標微生物通常在數量上不占優勢。因此，目標微生物同化利用13C-底物后發生的微小變化很難被分子指紋圖譜法所鑒別。（2）實時定量PCR法直接針對目標微生物的功能基因，采用高度靈敏的實時定量PCR測定不同密度層級中目標微生物的數量，顯著提高了SIP技術的可靠性。然而，采用特異引物定量研究目標微生物存在一定難度。土壤中數量眾多的微生物基因組DNA可能被13C標記，很難采用單一的功能基因或16SrRNA基因特異引物，同時研究眾多目標微生物在不同密度層級中的分布規律。我們無從得知哪一種微生物可能利用穩定性同位素標記底物，無法設計特異的功能引物，只能通過選擇性定量目標微生物，明確目標微生物在不同密度層級中的分布規律，同時判定SIP技術的可靠性[13，15]。（3）454高通量測序法是通過檢測各浮力密度層中微生物16SrRNA基因組成，分析目標標記微生物占該層總微生物的比例，從而鑒別前所未知的重要功能微生物。該技術可規避PCR擴增，直接對標記13C-RNA測序，每次分析可獲得大約100萬16SrRNA基因序列，顯著增強了重浮力密度層中13C-標記微生物DNA序列的檢測靈敏度。高通量測序可全面分析微生物群體的物種、基因功能組成，最大程度地認識未培養微生物的遺傳組成和生命活動，是目前最準確的方法[16]。但該方法目前測試費用較高，后續數據處理復雜，但隨著技術發展必將成為功能基因組學研究的主流技術。#p#分頁標題#e# 1.4構建克隆文庫 超高速密度梯度離心分離并鑒別13C-DNA/RNA后，通常采用建立基因克隆文庫，構建遺傳系統發育樹的方法分析13C-RNA和12C-RNA的微生物群落組成，并比較二者的差別，鑒定被13C底物所標記的微生物群落。 2SIP技術在土壤功能微生物鑒定中的應用 目前SIP技術在土壤分子生態學研究領域主要應用在原位鑒定介導有機污染物生物降解和碳氮循環過程的功能微生物方面。有機污染物生物降解研究多集中于單環芳烴、PAHs和PCBs的研究，碳氮循環研究多集中于植物-微生物相互作用對陸地生態系統中碳氮轉化、土壤中碳氮周轉速率、稻田產甲烷機理及產甲烷菌的研究。 2.1SIP技術在土壤有機污染物生物降解研究中應用 在有機污染物生物降解的微生物生態學研究中，SIP技術可以幫助了解在復雜原位土壤環境中，參與各個降解過程和途徑中功能微生物種類。Hanson等首次使用PLFA-SIP技術研究甲苯的生物降解，總共提取發現的59種PLFAs中有16種出現13C標記[17]。Christopher等在對農田土壤中苯酚降解菌的研究中，對13C標記苯酚的DNA進行18S-28S內轉錄間隔區的PCR擴增，T-RFLP分析，成功分離出一種白色細狀的真菌，并證實該真菌能加速苯酚的降解[18]。Sueoka等[19]利用RNA-SIP技術對13C標記苯酚的RNA反轉錄PCR和T-RFLP分析，新發現了3種苯酚降解菌。羅春玲、Xie等[20-22]利用DNA-SIP技術研究了甲苯、苯和間二甲苯的降解菌，對分離出的13C-DNA進行T-RFLP分析、克隆文庫的構建，獲得了相應的降解菌，并首次報道了TM7門對甲苯具有降解作用。Woods等使用H218O-DNA-SIP技術鑒定甲苯退化細菌，鑒定出一株已知的甲苯降解菌RHA1[23]。Padmanabhan等在Collamer地區的田間試驗中，向受試的粉砂壤土供應13C標記的葡萄糖、咖啡因、萘和苯酚，通過GC/MS監控土壤中釋放的13CO2濃度，以此估測底物降解速率，并將分離得到13C-DNA用通用引物對16SrRNA基因進行PCR擴增，最終得到29個完整的DNA序列[24]。Maiysha等利用DNA-SIP技術，研究了土壤中具有降解萘、菲和芘等6種多環芳烴功能的微生物群落，將13C作為標記元素，構建13C-DNA的16SrRNA克隆文庫和RT-PCR分析，結果表明不可培養菌PG2不僅可以降解芘，還能降解熒蒽和苯并[A]蒽，從而說明PG2菌對四環PAHs有著良好的降解效果[6]。Tillmann等設計了一個PLFA-SIP微宇宙實驗，將PCBs高度污染土壤暴露于13C-2,-2′-二氯聯苯中，采用GC-C-IRMS測定不同PLFA13C的豐度，結果表明非優勢菌在PCBs好氧降解過程中的主導作用[25]。Shahid等在對五氯酚降解菌的研究中，比較了DNA/RNA-DGGE和DNA/RNA-SIP-DGGE技術的鑒定效果，結果表明RNA-SIP技術可以更好反映功能微生物群落的變化趨勢[11]。Sul等將DNA-SIP和宏基因組技術結合，對13C-聯苯-DNA中芳烴雙加氧酶基因片段PCR擴增，得到兩串與bphA相似的序列組，構建1568粘?？寺∥膸?，發現除含bphAE基因外，還含有屬于γ-變形菌綱的未知基因片段，該片段的G+C含量和bphAE相近，可能由于bphAE基因水平轉移而形成的[26]。 2.2SIP技術在土壤C循環中的應用 土壤C轉化是微生物主導的生物地球化學過程，SIP技術能夠很好地將微生物群落與其功能聯系起來，加深人們對陸地生態系統重要C循環過程的認識。Boschker等最先使用PLFA-SIP技術進行甲烷營養菌的研究[7]，隨后，DNA-SIP技術被用于研究土壤中甲烷氧化菌的活性功能種群。Hutchens等在微宇宙中用13CH4對取自羅馬尼亞MovileCave地下水系統的樣品進行短期培養，以DNA-SIP技術為前提確定了3類含有編碼甲烷單氧化酶基因的甲烷營養菌，并通過與非甲烷營養菌比對證明了交叉取食的存在[27]。Cebron等在研究養分添加對甲烷營養菌多樣性的影響時，人工添加養分在一定程度上可避免交叉取食，改進了DNA-SIP方法[28]。Bengtson等研究了松樹林土壤中的甲烷營養菌群落結構組成與CH4氧化率的聯系，并簡短討論了DNA/RNA-SIP的局限性[29]。Borodina等用DNA-SIP法考查了英國不同陸地生態系統土壤中氯化甲烷營養菌的多樣性，通過與培養分離法的結果比較，揭示出土壤中仍存在大量不可培養的鹵化甲烷營養菌，并將鹵化甲烷的全球循環同一組目前已知的鹵化甲烷營養菌特征群聯系了起來[30]。Radajewski等最先使用DNA-SIP技術進行甲醇營養菌的研究，通過13CH3OH培養森林土壤，證明被13C標記的細菌16SrRNA基因序列與已知可培養的甲醇營養菌及嗜酸甲烷氧化菌相似，首次表明此類細菌還存在于森林土壤中[6]。Feng等利用DNA-SIP技術證明了稻田土壤中，甲酸鹽中的C首先被光營養的初級和次級生產者利用，隨后產生的有機物被其他微生物利用[31]。陸雅海等用13CO2對水稻進行脈沖標記培養，利用RNA-SIP技術與T-RFLP分析，獲得水稻根際的產甲烷菌，并通過厭氧和好氧條件的對比，表明根際環境和降解過程的多相性[32，13]。該團隊還利用PLFA-SIP描述了水稻根際微生物活性的空間變化，提出在根際革蘭氏陰性菌和真核微生物在同化根派生碳過程中最活躍，同時描述了圍繞根際的活性群落的空間系統變化[9]。 2.3SIP技術在土壤N循環中的應用 15N作為生物體內大分子合成的組成元素，可結合SIP技術研究土壤中氮循環過程的各類微生物功能群及其相互作用。Georg等利用標記和未標記的N進行純微生物培養，結果顯示15N-DNA-SIP技術是可行的，但存在一定局限性，如可視條帶需要大量的DNA，15N-DNA的理想豐度要求大于50%等[33]。Buckley等通過改變基因G+C含量來增加15N-DNA的浮密度，增加了15N-DNA的分離強度，為原位追蹤利用N的微生物群落提供了新的研究方法，并采用15N2-DNA-SIP原位鑒定了獨立生存的固氮微生物，通過分析15N標記DNA的16SrRNA，發現了3組新固氮微生物[34-35]。賈仲君等采用SIP技術示蹤農田土壤氨氧化微生物DNA，發現相對于古菌，細菌是土壤硝化過程的主要驅動者[36]。賀紀正等對農田土壤生態系統中氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細菌（AOB）進行一系列研究，得出二者在根際土壤中的豐度、組成對環境的響應占主導作用[37]，并發現土壤中硝化作用伴隨著古菌amoA的基因豐度和多樣性變化，進一步證明了氨氧化古菌可同化CO2，屬于自養型微生物[38]。Jennifer等結合RNA-SIP和DNA-SIP技術，再次證明AOA可通過兩種途徑固定CO2，并在泉古菌（Crenarchaeota）中得到驗證，進而強調了AOA在硝化和CO2固定過程中的重要性[39]。Karen等以北美黃松林為研究對象，應用H218O-SIP技術調查土壤中氨氧化微生物的生長與死亡情況，發現人工添加氨可刺激AOB的生長，與此同時AOA的死亡數量增加，而AOB則不受影響[40]。Ishii等在研究N2O在水稻土中的消減過程時，用13C標記的琥珀酸鹽作為電子供體，鑒定了同化琥珀酸鹽的微生物，指出大多數N2O消減微生物屬于草螺菌屬和固氮螺菌屬。并證明前者消減速度大于后者，在水稻土N2O的減少過程中發揮重要作用[41]。#p#分頁標題#e# 3研究展望 SIP技術能有效降低環境微生物群落分析的復雜度，獲得功能微生物的目的基因，已成為原位分離功能微生物的重要手段。隨著新一代454高通量測序技術的發展，SIP技術可最大程度地認識不可培養微生物的遺傳組成和生命活動，獲取其功能基因，優化并人工合成在原位環境中具有高效同化或降解作用的新基因。結合土壤化學等方面知識，共同探討土壤環境中功能微生物的代謝途徑和同化過程，挖掘微生物基因資源，鑒別土壤關鍵元素循環的微生物驅動機制等，將是未來研究發展的熱點和重點。
