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土壤線蟲是植物根際土壤生物區重要的后生動物，在自然界中數量龐大，種類繁多，且直接參與土壤生態系統的物質循環和能量流動，對有機物的分解、養分轉化和能量傳遞起到關鍵的作用，是土壤生態系統的重要組成部分。土壤線蟲生存能力、繁殖能力和環境適應能力強，且對環境變化敏感，其群落組成能夠反映出土壤的理化和生物性狀，因此土壤線蟲成為評價土壤健康的重要指示生物。目前，人們對自然和半自然生態系統及不同環境條件和管理措施下農田生態系統的土壤線蟲群落進行了大量研究[1-3]，揭示了不同土壤條件下土壤線蟲的群落特征，并反映出土壤的質量狀況。目前，土壤線蟲研究多采用線蟲形態鑒定法，這使得土壤線蟲群落研究只能在線蟲科、屬和功能群水平上進行[4]，而且形態鑒定法工作量大、費時費力、難以快速分析多個土壤樣品的線蟲群落特征，這使得土壤線蟲研究在物種深度和樣品廣度方面存在缺陷[5]，限制了土壤線蟲研究的發展。隨著分子生物學的快速發展，分子生態技術被應用到土壤線蟲研究中，為線蟲分類鑒定和系統關系的分析提供了一個有效的工具。通過線蟲基因序列的比對分析，不僅可對線蟲進行準確的分子鑒定和系統發育的研究，而且為線蟲姊妹種的鑒定和幼蟲的分類提供了可靠的依據，極大地提高了土壤線蟲研究的精度和效率。本文對分子生態技術在土壤線蟲研究中的應用現狀進行綜述，以期為土壤線蟲的分子生物學研究提供參考。 1分子生態技術在土壤線蟲研究中的優勢 分子生態學是生態學和分子生物學相互滲透、結合而發展起來的新學科，它依靠分子生物學的理論和技術來分析、解決生態學問題。分子生態技術是分子生態學的研究方法，能夠在核酸和蛋白質水平上闡明生命系統與環境系統的相互作用規律，克服了傳統生態學技術的局限，具有巨大的優勢。在土壤線蟲研究中，分子生態的優勢主要體現在如下4個方面： 1.1適用于高通量分析 線蟲的多個基因可用于分子鑒定，如18SrDNA、ITS和線粒體DNA等。高通量測序技術的應用極大地提高了分子鑒定的效率，這使得宏基因組技術能夠用于土壤線蟲研究，提高了土壤線蟲指示土壤環境質量狀況的精度。 1.2能夠進行遺傳分析 利用同源基因分析物種的同源性比利用形態分析更簡單、可靠。多種線蟲的基因序列能夠用于遺傳分析，并構建進化樹，確定線蟲的進化地位。 1.3便于交流分析 線蟲分子分類DNA序列登陸到數據庫后，全世界的線蟲研究專家可共享、下載數據，進行分析，這將促進土壤線蟲研究交流和發展。 1.4在種水平上鑒定線蟲種類 DNA序列是內在的遺傳特性，是線蟲種類的本質特征，因此分子鑒定能夠在本質上區分線蟲種類，克服了線蟲形態鑒定的缺陷。線蟲形態鑒定只能在種屬水平上進行，且需要在顯微鏡下觀察線蟲形態特征，效率低下。而分子鑒定能在種水平鑒定線蟲種類，能夠快速鑒定土壤樣品中的線蟲種類，提高了線蟲鑒定的精度和豐度。 2分子生態技術在土壤線蟲研究中的應用 2.1分子標記技術 分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接反映，廣泛應用于物種分類、遺傳圖譜構建和目標基因定位等。Vanderknapp等[6]利用隨機引物PCR區分了2種親緣關系較近的食細菌線蟲，表明分子標記技術可應用于線蟲生態學研究。Yeates等[5]認為分子技術需要反映出某些特定線蟲種或功能群的相對數量，而且至少需要3對引物對單條線蟲進行標記。隨后，多種分子標記技術應用到線蟲研究中，如限制性片段長度多態性（RFLP）[7]、隨機擴增多態性（RAPD）[8]和擴增片段長度多態性（AFLP）[9]。然而這些方法均具有明顯的缺點，如RFLP的PCR擴增片段長度和酶切片段長度太短，僅僅提供有限的信息，因此只能對少量的已知物種進行區分；RAPD和AFLP提供的信息數量較大，片段長度為100bp左右，但僅靠片段差異多態性不能夠區鑒定出物種種類。 2.2DGGE技術DGGE技術 能夠區分長度相同、但序列差異的DN段。該技術首先應用于微生物群落研究，分析樣品中微生物的物種信息和時空變化，并可通過對條帶的序列分析或與特異性探針雜交分析鑒定群落組成。Waite等[10]將該技術應用到線蟲群落研究中，揭示出歐洲草坪土壤線蟲種群的多樣性，但未將DGGE分析結果與線蟲形態鑒定結果相比較，也未揭示線蟲遺傳多樣性和物種豐度信息。Foucher等[11]采用PCR方法擴增線蟲18SrDNA區域630bp的片段，并利用DGGE分析擴增片段的多樣性，以此鑒定線蟲種類，該方法快速高效。雖然DGGE技術具有較多的優點，但僅依靠電泳條帶不能揭示每個物種的豐度和遺傳進化信息，因此不能完全揭示土壤線蟲群落特征。 2.3線蟲18SrDNA測序技術 18SrDNA是編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，序列中既有保守區又有可變區，保守區反映了物種間的親緣關系，可變區反映出物種間的差異，在系統發育研究中適用于種級以上的階元分類。內轉錄間隔區ITS位于核糖體rDNA18S、5.8S和28S之間，屬于中度保守區域。18SrDNA和ITS序列測序技術為分子分類中常用的方法。Floyd等[12]依據線蟲18SrDNA基因序列劃分“分子操作分類單元（MOTU）”，將序列相似度大于99.5%歸為同種線蟲。Eyualem等[13]利用18SrDNA測序方法將形態鑒定的5種Panagrolaimus線蟲重新劃分為2個種。Griffiths等[14]采用18SrDNA基因克隆文庫的方法分析了2個位點的土壤線蟲群落結構，通過BLAST比對和構建進化樹來劃分線蟲類群，揭示出不同類群線蟲的比例，研究發現土壤線蟲以Hoplolaimidae、Telotylenchidae、Cephalobidae和Prat-ylenchus為主，然而分子方法揭示的Rhabditida和Tylenc-hida比例低于形態學鑒定的結果。除了18SrDNA之外，應用于線蟲分子分類的基因還有ITS[15]和線粒體DNA等[16]。但是，該技術構建克隆文庫的效率低，難以滿足高通量分析。#p#分頁標題#e# 2.4宏基因組技術 宏基因組技術以所研究環境中全部微生物遺傳物質作為對象，可揭示微生物的物種多樣性和基因多樣性。隨著高通量核酸測序的發展，可直接對宏基因組樣品進行測序、分析，因此極大地提高了宏基因組技術的應用范圍。Dorotal等[17]將大規模測序技術應用到線蟲群落研究中，利用PCR擴增線蟲18SrDNA序列，并構建了4個人工宏基因組文庫，通過454測序和BLAST比對，成功地分析了宏基因組文庫的線蟲多樣性，但并未獲得各線蟲類群的比例。隨后，Dorotal等[18]利用454測序產生的序列數量分析了宏基因組文庫中的各類群線蟲的比例，從而解決了線蟲群落研究的物種豐度問題。其研究表明宏基因組技術結合454大規模測序能夠應用于線蟲群落研究，但該方法需要對每個樣本文庫分別測序，這既浪費了454技術的高通量測序效率（一個454測序反應可以得到超過100萬個序列讀長，而Dorotal研究中文庫包含序列最大數量僅為1.4萬個），又增加了研究成本。 2.5BarcodePCR技術 將多個文庫或PCR產物混合后大規模測序，能夠極大地發揮454測序技術的超高通量優勢，避免構建文庫的過程，節省了成本并提高了工作效率，在生態群落研究中可發揮重大作用。Thomas等[19]利用454測序技術對11個擴增于基因組不同區域的PCR混合產物進行高通量測序，并依據原始模版的序列特異性對序列進行歸類。這種方法開創了混合PCR產物高通量測序的先河，但隨著混合PCR產物數量的增加，僅依據模版序列特異性對序列歸類變得更加困難，且難以對序列同源且來源不同的PCR產物進行歸類。隨后，Jonas等[20]采用BarcodePCR方法，即在PCR引物的5’末端添加一段區分不同樣本的短核苷酸序列作為測序后判定序列樣品來源的標記，對12個物種的線粒體DNA18S區域進行擴增，454測序PCR混合產物，然后利用特異性Barcode對PCR序列歸類，從而開啟了多樣本的生物群落研究。理論上，利用454測序技術一次反應可完成600個PCR混合產物的測序，能夠實現高通量分析。目前，BarcodePCR結合454測序技術在微生物群落研究中廣泛應用，揭示了人體和動物腸道菌群、海洋微生物菌群[21-22]和植物病毒群體多樣性[23]，極大地促進了微生物生態學的發展。但是，該技術還未應用在土壤線蟲群落研究中，因此，建立土壤線蟲群落研究的BarcodePCR技術體系，有助于解決土壤線蟲研究中難以高通量分析的問題。土壤線蟲BarcodePCR技術需要解決2個關鍵問題：（1）篩選適合454測序單反應長度的線蟲分子分類標記基因。目前，454測序技術單反應長度平均為450bp，因此，標記基因的長度應小于450bp。以線蟲18SrDNA基因全長序列為目標，從中選擇具有一定保守性和變異性的區域，并截取長度略小于450bp的序列作為線蟲分子分類標記基因，確保讀長序列雙末端包含完整的分子標簽，便于后續對序列歸類。（2）引物兩端添加的分子標簽對擴增效率無明顯的影響。分子標簽添加于引物5’末端，可能會對PCR的擴增效率有一定影響，造成結果誤差。因此，需要評價分子標簽對PCR擴增效率的影響，淘汰對擴增效率起明顯抑制或促進作用的分子標簽引物，保留對擴增效率無明顯影響的分子標簽引物，提高結果的準確性。 2.6線蟲序列數據庫 DNA測序和序列數據庫為分析物種的遺傳進化關系、開發物種分類的特異性引物或基因探針提供了極大的便利。DNA序列數據庫包含海量的序列數據，如GenBank、EMBL-Bank（EuropeanMolecularBiologyLabor-atory）、DDBJ（DNADatabaseofJapan）、NEMBASE和WORMBASE等，這些序列涉及160000個物種，包括細菌、真菌、原生動物、線蟲和其他動物。目前DNA數據庫中的線蟲序列數據主要用于植物寄生線蟲和可培養的線蟲分類研究[24]。最近建立的線蟲數據庫還包括線蟲的形態和分類數據，這有助于對自由生活線蟲的研究。Nematol中包括大量的線蟲圖片、進化樹和序列，而Nemys中包含大量的線蟲分類資料。這些序列和資料為線蟲分子分類奠定基礎，可為從種水平上分析線蟲多樣性提供依據。 3前景與展望 分子生態技術的引入，極大地拓展了土壤線蟲研究的廣度和深度。高通量測序技術的發展，使得同時對多個土樣樣品的土壤線蟲多樣性進行大規模分析成為現實，從而對不同類型、不同生態區域的土壤線蟲多樣性進行比較分析，同時可大規模分析土壤微生物與土壤線蟲的互作關系，從而在土壤生態系統的角度分析土壤線蟲的種群動態變化，更好地發揮土壤線蟲的生物指示作用。生態基因組技術以高通量測序為基礎，以生物信息學為手段，從基因組或宏基因組角度揭示生態群落的結構功能[25]，生態基因組學將是土壤線蟲生態學的發展方向之一，而土壤線蟲群落研究是土壤線蟲生態學的重點。因此，從生態基因組學角度，高通量分析土壤線蟲群落結構，解析土壤線蟲的動態變化，能夠從廣度、深度上揭示土壤線蟲的生態功能，使土壤線蟲研究更加深入。
