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[摘要]以“親核取代反應在大豆蛋白復合水凝膠制備中的應用”為例，將有機化學中“親核取代反應”應用到實際材料的制備過程，同時聯系生物、食品、環境以及材料等學院學生的專業背景，采用天然生物高分子大豆分離蛋白為原料來進行實驗課程設計。實驗強化了“綠色化學”概念，一方面促進了理論與實踐間的聯系，另一方面實現了有機化學與生物科學領域理論與實踐上的雙向交叉融合。實驗旨在鼓勵學生打破單一學科理論學習的固式思維，在實驗過程中體會“學做相結合，學科兩交融”的重要意義，同時鍛煉學生的實驗操作技能和基本的科研思維，提高學生的實踐能力。
[關鍵詞]有機化學實驗；親核取代；交叉融合教學；大豆蛋白；課程設計
《有機化學》是一門理論性強，實踐度高的基礎學科，隨著科技的發展，目前已經滲透到生命、材料、環境、能源、信息等多學科領域[1]，因此在本科階段的學習中，不僅化學專業的學生需要熟練掌握、深入理解有機化學課本中的物質性質及反應原理，生物、食品、環境、材料等相關學科也應該熟練掌握這些內容。2019年8月8日，教育部、財政部、國家發改委三部委聯合印發《關于高等學校加快“雙一流”建設的指導意見》，意見更是強調促進學科交叉融合，加強急需學科專業人才培養。強調構建協調可持續發展的學科體系，打破傳統學科之間的壁壘，以“雙一流”建設學科為核心，以優勢特色學科為主體，以相關學科為支撐，整合相關傳統學科資源，促進基礎學科、應用學科交叉融合，在前沿學科和交叉學科領域培植新的學科生長點。有機化學是生命科學的基礎，有機化合物是構成生物體的主要物質，生物體中各種有機化合物的結構、性質以及它們在生物體內的的合成、分解、轉化、代謝無不以有機化學為基礎。但在有機化學與生物等相關學科領域融合教學過程中，主要存在以下問題：首先是教學模式單一，在傳統的教學模式中，教師一般以課堂講授為主，但是，有機化學知識點多、前后聯系緊密，課堂節奏較快，大部分學生在課堂上顯得力不從心，逐漸弱化自主參與學習的程度；其次是授課內容傾向于有機化合物的結構、命名、物化性質等，與實踐層面的結合相對較少[2-4]。最后是與專業結合度不夠，一方面，除了化學本專業的學生，生物、食品、環境以及材料的學生潛意識地認為有機化學是邊緣專業，從而對這門學科的學習產生懈怠。另外一方面，教師在教學過程中沒有針對性地聯系學生專業背景講解知識點，難以體會有機化學在本專業的應用，所以這就引起學生對本門課程的不重視，沒興趣，導致教師的教學質量難以提升因此，針對這些這些問題，本文提出了有機化學與生物相關專業交叉融合的實驗課程設計，探索“理論+實驗+學科”三位一體的教學模式。作為天然生物分子與有機合成的交叉領域—生物材料，因其具有生物安全、高效、廉價、易降解等優點，已成為近年來的研究熱點。其中，天然蛋白質就是其中的一員，大豆分離蛋白(SPI)是大豆的重要組分，含有多種活性側鏈基團如氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、羥基(-OH)和巰基(-SH)，不僅來源豐富、價格低廉、營養價值高，而且具有可降解、生物相容、熱穩定、無污染、綠色環保等優良性能，因而具有很好的應用與發展前景。因此，選擇大豆分離蛋白作為實驗的主要原料，通過實驗課程設計，充分發揮了有機與生物相關專業的學科特點，將有機化學實驗“親核取代”融入到蛋白質材料的制備中去，并將研究重點放在兩者交叉領域，既有針對性地提升生物、食品、環境以及材料等專業學生對有機化學的學習興趣，又可以通過實踐大大提升每位同學的參與度，進一步加深學生對該反應機理的理解。
1實驗設計
大豆分離蛋白富含胺基，實驗設計以大豆分離蛋白中的胺基為親核基團，硅烷偶聯劑中環氧基團為底物，通過胺基與環氧基團的親核取代反應實現蛋白與硅烷偶聯劑的交聯[5]，進而形成水凝膠—一種軟物質材料。通過實驗引導學生思考以下幾個問題：
(1)實驗開始之前，充分利用當前階段所掌握的定量分析方法如滴定法、紫外分光光度法、氣質連用法等來確定硅烷偶聯劑的加入范圍；
(2)實驗過程中，注意總結有可能導致實驗不成功的因素，待驗結束后進行分享；
(3)樣品制備完成之后，對其進行冷凍干燥后進行紅外測試，根據所得譜圖推斷生成的特殊官能團和特殊氫原子的存在；
(4)指導學生開展水凝膠的體外降解實驗，間隔一定時間后詳細記錄水凝膠失重數據和具體時間，根據降解結果，及時為學生在研究過程中樹立“綠色合成”觀念；根據測定結果，啟發學生結合有機化學知識與生物專業知識背景，反推向推導實驗過程中有可能影響材料形貌和性能的潛在因素如蛋白質分子的結構與官能團數目、反應溫度、反應時間、反應的pH環境、整個實驗的工藝流程等。實驗結束后鼓勵學生根據以上分析過程提出各自的改進方案。學生在探索條件的同時，體會實驗方案中各個變量對結果的影響，培養學生嚴謹細致、求真務實的科研素質和逆向推導的科研思維。促進學生對親核取代反應的進一步理解，引導學生體會有機反應機理對于開發新產品的重要意義，進一步地，對于推動社會進步，改變人類生活有著巨大的影響，提升學生對該學科的求知欲和好奇心。
2實驗原理
大豆分離蛋白中含有多種氨基酸，其中谷氨酰胺、天冬酰胺、賴氨酸、精氨酸含有胺基，該實驗就是利用該官能團進行反應，由于胺基上的氮原子具有孤對電子，在弱堿性條件下，可以作為親核基團進攻硅烷偶聯劑KH560中環氧基團上位阻較小的碳原子，發生開環反應，形成新的化學鍵—碳氮鍵，從而實現蛋白與硅烷偶聯劑的交聯。
3實驗內容
3.1大豆蛋白復合水凝膠的制備
稱取1.20gSPI粉末于10mL2%(w/v)SDS(十二烷基磺酸鈉)溶液中，在50℃下攪拌至完全溶解，在85℃下保溫1h，在此過程中蛋白質結構充分舒展，氨基酸側鏈基團暴露，利于反應的進行。該溶液濃度為12%(w/v)，將其冷卻至室溫備用。接著，用10wt%NaOH溶液把SPI溶液的pH調節至10.0左右，加入0.24mLKH560攪拌至完全均勻。最后，把混合液放置在50℃水浴中孵育1h即可得到KH560交聯的SPI-KH560淡黃色透明水凝膠。將制得的SPI-KH560水凝膠放進截留分子量為3000Da的透析袋中，以去離子水為溶劑對其進行透析，除去未反應的偶聯劑和雜質。再將透析過后的的凝膠轉移至真空冷凍干燥箱進行凍干，12小時以后將得到的干凝膠放入4℃的冰箱中封存，以備后續使用。
3.2硅烷偶聯劑KH560加入比例的探索
根據反應原理，為學生提供KH560加入量的范圍(分別占到該體系體積的0%、10%、20%和30%)，按照給出的參考量范圍，學生分別向體系加入KH560進行梯度探索。根據制得的樣品的成膠情況，確定偶聯劑可加入的最佳比例。實驗過程中，將學生分為四組，每組進行其中一種配方實驗。實驗結束后，學生之間通過共享實驗數據和小組討論，最終得出合理的結論。
3.3傅利葉變換紅外分光光度計(FT-IR)表征
將SPI-KH560樣品干燥處理，用研缽磨成粉末狀后，壓入模具。通過FT-IR測定樣品在4000~400cm-1掃描波數范圍內的紅外吸收光譜。SPI-KH560凝膠、KH560和經過相同工藝變性處理的SPI的FT-IR光譜如圖1所示。在SPI-KH560凝膠、變性SPI的譜圖中，1655cm-1(酰胺Ⅰ帶)、1543cm-1(酰胺Ⅱ帶)、1240cm-1(酰胺Ⅲ帶)處出現的吸收峰分別與C=O的伸縮振動、N-H的彎曲振動、C-N伸縮振動對應，均為蛋白質的特征吸收峰。在變性SPI的譜圖中，位于波長3292cm-1和3430cm-1的兩個弱強度峰歸因于O-H和伯胺上N-H的伸縮振動；而在SPI-KH560凝膠譜圖中，位于3285cm-1處的單峰是由于O-H和仲胺上N-H的伸縮振動引起的，從而可以推斷出SPI上的伯氨基團與環氧基團發生反應轉化成了仲胺。在KH560的譜圖中，1085cm-1處較強的吸收峰是由于Si-O的伸縮振動引起的，該峰在凝膠譜圖中轉變成了1109cm-1處較寬的吸收峰，這歸因于Si-O-Si鍵的生成，說明水解的KH560發生了自聚反應；在910cm-1、821cm-1、781cm-1處的吸收峰是KH560環氧基團的三個特征峰，但SPI-KH560凝膠譜圖中并沒有出現，表明SPI與KH560發生了交聯反應。
4體外降解實驗
將0.5mL含有不同濃度KH560的水凝膠(SPI-10%KH560、SPI-20%KH560、SPI-30%KH560)制備完成后，分別裝入25mL0.25%(m/v)無菌堿性蛋白酶溶液的樣品瓶中，樣品瓶在使用前進行高壓蒸汽(121℃，30min)滅菌。然后，將含有降解體系的樣品瓶置于搖床(25℃，100rpm)中進行震蕩，使得凝膠與酶降解液充分接觸，之后定期取出水凝膠，測定其重量和體積變化。實驗結果表明，純大豆分離蛋白在蛋白酶的催化下快速降解，2小時后大豆分離蛋白粒徑減小約三分之一[6]；蛋白質經過交聯劑形成水凝膠后，降解速率明顯降低，交聯密度較大的凝膠甚至兩周后才能觀察到較為明顯的變化[7]。這也說明，大豆蛋白確實與KH560發生了交聯反應，使得降解時間延長，且交聯密度越大，經歷的降解時間越長。
5實驗結論
(1)從紅外譜圖中，學生通過環氧基團特征吸收峰(910cm-1、821cm-1、781cm-1處)的消失、伯胺(3292cm-1和3430cm-1的兩個弱強度峰)轉化為仲胺(3285cm-1處的單峰)引起的吸收峰的位置變化以及Si-O-Si鍵的特征吸收峰(1109cm-1處較寬的吸收峰)的出現來確定了親核取代反應的發生；(2)當KH560含量從0%逐漸增加到30%時，大豆蛋白水凝膠的機械強度也隨之增強，這是因為KH560中含有的羥基與環氧基團也能發生親核取代反應，進一步加大了凝膠內部的交聯密度；(3)降解實驗結果表明，隨著KH560含量的增加，相同時間內水凝膠失重逐漸減小，也就是說KH560含量的增加減慢了水凝膠的快速降解，這同樣是因為KH560含量的的提升使水凝膠的結構變得更緊密，因此在相同濃度的堿性蛋白酶溶液的作用下，偶聯劑含量高的水凝膠降解所需時間較長。
6總結
《有機化學》具有理論性、抽象性的特點，針對有機化學融合生物相關專業教學過程中出現的具體問題，選擇有機化學中最具代表性的反應機理—親核取代機理，創新性地設計了綜合實驗—親核取代反應在大豆蛋白復合水凝膠的制備中的應用。在整個實驗過程中，水凝膠材料的制備過程鍛煉了學生的實驗操作能力，同時深化了學生對親核取代反應的理解與記憶，更激發了他們對有機生物學科交叉的濃厚興趣；通過紅外譜圖，對制得的樣品進行表征則是對學生儀器操作和譜圖解析能力的提升；體外降解實驗中，學生通過觀察水凝膠降解的過程，體會可降解的綠色合成路線對當今時代可持續發展的重要意義?？偟膩碇v，該實驗將有機化學與生物學科緊密有效地結合起來，實現了理論實際相結合，有機生物共融合的課堂效果，同時在實驗方案擬定、科研思維、儀器操作、譜圖解析、“綠色化學”觀念等方面對學生的綜合能力有一個質的提升。讓學生切身體驗科研過程和科研產品對推動社會進步具有深遠的意義。因此，在“有機化學+其他學科領域”的授課模式中，師生各自將“教”與“學”的一部分重心從單一學科的理論學習轉移到基于多學科交叉的實踐中去，這樣的實施方式，有利于教師提高教學其質量，更拓寬了非本專業學生的知識面和理解力，從而使有機化學更高效地為專業課的學習提供有力支撐。
作者：徐守萍 王江江 黃鐘全 單位：華南理工大學 化學與化工學院
