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(一)基本假設
意象對話技術的基本假設是意象具有象征性,人的心理狀況是可以通過人的意象反映,而改變意象可以改變人的心理狀況;溝通的兩者通過使用意象,通過意象的象征意義進行交流。心理咨詢師可以通過意向對話技術進入來訪者的潛意識區域或者心理的深層,在使用意象交流的過程中,改變來訪者的心理意象,從而達到改變來訪者心理狀況的過程。
(二)意象與象征性
意象(imagery)是腦對不在眼前的事物的形象的反映,可以分為兩種[1]:一種是客觀世界在頭腦中的圖象表征,也就是類似于“表象”,例如,說到蛇的時候,在頭腦中出現的蛇的形象;第二種,意象代表一種象征意義。例如,在夢里見到一條蛇,也許它代表的是人生活中的一個陰險小人;也許它代表的是一個男人的欲望等。在意象對話技術中,意象的第二種意義更為重要。意象對話技術中提出元意象的概念。元意象是當一類事物被綜合了它的特點后,找到了一個有代表性的形象,也就是一個概括的意象。
(三)心理能量學
意象對話技術中,認為人的心理能量是里比多,但是里比多是人的生命力,而不是性能量。心理能量的產生有兩種形式[1]:一是自發產生,在適當的心理狀態下,心理能量自發產生;二是被激發產生,是本能的力量被激發而產生。人從本能中獲得自發心理能量,通過激發后,可以產生多種形式的激發能量。心理能量在一定的情況下能夠相互轉化,并遵循能量守恒原則。被激發的能量在一定的時候會釋放。釋放有正常的釋放與不正常的釋放兩大形式。正常的釋放形式是自然地釋放,例如當人覺得很悲傷,大哭一場是自然的、正常的釋放。當人的心理能量得到正常的釋放時,人會保持一個健康的心理狀態水平。心理能量的不正常釋放具有兩種形式———壓抑與沉溺。壓抑引發的沖突及沉溺引發的情緒都可以轉換為各種各樣的意象。意象對話技術,使人在醒著的時候,人仍可以看到各種化身為意象的心理沖突。
(四)心理障礙
心理障礙是人情緒和心理能量的郁結。過去的經歷讓人壓抑和沉溺,而壓抑和沉溺是人心理的情結。內容相似的情結會相互結合,形成更大的情結,是心理能量的郁結。情結具有強大的心理能量。如果人不設法調走情結的能量,那么它會永遠留在人的心靈深處,久而久之,便產生了心理障礙。
二、意象對話技術的應用
意象技術是咨詢者與來訪者用象征性語言在交流,是心和心的交流,意象技術的基本程序如下:
(一)引入過程
意象對話技術中,咨詢者是處于一個引導的角色,引導來訪者進行想象。在引導的過程中,咨詢師可以對成年人解釋一下意象對話技術;對有心理問題的來訪者,可以告知本方法對治療這種心理問題是有效的。
(二)想象過程
心理咨詢者和治療者可以先設定一個內容,讓來訪者想象。要求來訪者針對某些特殊問題進行想象,相當于投射性的測驗。咨詢者可以給來訪者設定起始意象。設定的起始意象可以有很多,例如,可以是房子、花、蛇、坑等,也可以是來訪者的夢。
(三)咨詢者分析意象
來訪者想象的意象都有象征意義,心理咨詢者和治療者可以分析其象征意義。分析來訪者的意象時,可采用分析原始意象的方式進行,并分辨出來訪者意象的變種。
(四)心理咨詢師作誘導
心理咨詢師用象征性意象誘導來訪者改變。心理咨詢師或者引導者有兩種基本方法,一種主要是讓來訪者想象,心理咨詢師只是聽他的想象,并用語言誘導;另一種是心理咨詢師介入,心理咨詢師讓來訪者想象的時候,把咨詢師也作為想象的一個對象。
(五)反復想象和強化
利用反復的想象和強化,讓一個新的意象替代舊的意象。咨詢者可以通過布置意象作業,讓來訪者練習,以鞏固來訪者心中的意象。這是對意象的反復想象和強化。
(六)學會區分想象和現實
意象對話可以把消極的意象原型轉化為積極的,但是,來訪者本身的想象與現實的區分能力可能會比較的弱,如果僅僅是停留在意象中,可能會造成來訪者在想象中可以調節出很好的心理狀態,但是不能在現實生活中調節自己的心態,于是讓來訪者在意象對話的過程中區分想象與現實是很必要的。心理咨詢與治療師可以用兩種方法使來訪者辨別想象和現實:一種是忽然喚醒法,也就是在來訪者做意象的時候,忽然讓來訪者睜開眼睛,并說出現在看到的是什么。第二種是借鑒格式塔療法中的一個小技術,就是用8分鐘的時間讓來訪者不停地說“我現在……”。
三、大學生是意象對話的適合人群
(一)意象對話技術有利于大學生探索自我。大學生處于心理意識加速發展的時期,在這一階段,生活環境的改變,生理的發展,生活經驗的增加等給大學生帶來極大的沖擊,也促進大學生從生理自我、社會自我、心理自我等方面全面地重新認識自我。然而,在認識自我的過程中,“我是誰”這個問題大大地困擾著大學生。意象對話技術可以讓大學生在無意識中理順自己對自己、人生、對世界的認識,形成良好的自我觀、人生觀和價值觀。
(二)大學生的思維、領悟力的發展,能更好發揮意象對話技術的效果。隨著大學生的思維能力的發展,抽象思維的發展、思維的靈活性、創造性、領悟力處于發展的高峰期,讓意象對話技術中的意象想象中較容易呈現出需要的意象。思維的發展加上大學生自我探索的迫切需要,讓大學生在進行意象誘導環節時,更容易領悟及進行自我探索,使意象對話技術產生較大的效果。
(三)大學生區分現實與想象的能力增強,更能避免意象對話的消極效應。意象對話的一個較大的弱點是擔心來訪者沉溺于想象中,也無法區分現實與想象。皮亞杰認為現實監控能力是在12歲左右發展成熟,大學生處在18-25歲之間,具有較強的現實區分能力,更容易從想象意象中抽離。
四、意象對話技術在大學生心理教育中的應用
(一)利用房子意象對大學生進行心理測試。根據意向對話技術的原理,教育者可以利用意象對話技術中的意象了解大學生的真實心理狀態,尤其是其中的房子意象。當大學生坦誠地回答紙筆測試中的問題時,測試能夠較好地反映他們的心理狀況,然而大學生具有一定的封閉性心理,有時自己的心理狀態不愿意真實地呈露,容易在一般的心理測試中進行虛假回答,掩飾自己的真實心理狀況;意象是利用人的無意識心理呈現,減少測試者的掩飾性,能夠更好地反映大學生的真實心理狀態。研究者也發現,房子意象與艾森克人格問卷、癥狀自評量表等不同維度有顯著性相關。因此教育者可以利用意象對話技術中的意象作為心理測試的補充,了解學生的真實心理,更有針對性地開展工作。
(二)利用意象對話技術開展團體訓練。研究者利用意象對話技術進行團體訓練,發現參與人員的強迫癥狀、人際關系敏感、抑郁、精神病性等因子分顯著下降,認為意象對話技術對改善心理健康有著積極的影響。在大學生的心理調整過程中,針對大學生的情緒調整、人際關系等嘗試使用意象對話技術開展團體訓練,會對大學生的心理調整產生意象不到的效果。
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【關鍵詞】大學藝術設計教育；數字化技術；應用
計算機的普及以及互聯網的推廣，使人類進入了信息化的時代，由于互聯網具有開放性、全球化等特點，數字化技術對藝術設計領域造成了很大的沖擊。計算機技術、網絡技術等數字化技術逐漸的應用與高校藝術設計教育中。通過我國教學改革的進行，許多的教學方式得到了大力的推廣和應用，實踐證明，這些新教學方法的應用，在教學過程中發揮著不同程度的作用。數字化技術教學是這些新教學方法中的一種，其在高校藝術設計教學中可以發揮更大的優勢，對提高藝術設計水平有重大的意義。
一、數字化技術教學概述
隨著信息時代的到來，信息產業得到了長足的發展，越來越多的數字化設備應用到人們的生活與工作當中，人們正式的進入數字化時代。教育行業在數字化環境下也得到了很大的沖擊與發展，高校的硬件、軟件設施都以具有一定的規模。隨著社會對人才需求量的增多，對高校教育水平也提出了更高的要求，要求大學生不僅能夠學好專業知識，還應該德智體美全面發展。在大學藝術設計教學中，利用數字化技術，將傳統的藝術設計與豐富的數字化有機的結合起來，能夠使學生更加的直觀的感受到藝術設計的本質，并促使學生積極主動的參與到教學活動中，幫助學生整合相關的知識點，設計出更多更富有藝術的作品。這樣能夠提升大學生的藝術創造力，充分的發揮出大學生自身的潛力。
在藝術設計領域，隨著信息數字化技術的快速發展，藝術設計教育應該面向媒體，逐漸的培養學生的認知能力，促使學生在設計理念、藝術審美等各個方面得到全面的提升。在藝術設計過程中，越來越多的軟件被應用，雖然其能夠達到手工無法達到的效果，但在時間、工作量等方面有一定的局限性，所以在實際的創作過程中，需要根據實際的情況進行選擇，手工與先進技術的有效結合，才是藝術設計的方向。
二、數字化技術教學在大學藝術設計教育中的有效應用
（一）在大學藝術設計教學中加快軟件的融入
隨著科技的發展，越來越多的數字化設備與軟件應用到大學藝術設計教學過程中，但由于大學藝術設計的特殊性，需要表現不同的藝術形式與空間，這就要求教學使用的軟件能具備多樣性。在高校藝術設計教學中，教師應該將這些軟件功能以及使用方式交給學生，使學生能夠有效的掌握并熟練的應用。目前藝術設計專業的課程中，有一種或幾種藝術設計軟件，不能滿足藝術設計的各項要求，缺乏多樣性，這就需要大學藝術教學不能將重點放于一款軟件上，要根據專業的具體安排，多層系、多角度的引入各類應用軟件，加強對大學生的教育，充分調動學生學習的積極性，提高學生掌握并應用先關軟件的能力。
（二）采用啟發式教學模式，增強學生的應用能力
利用數字化技術進行藝術設計，計算機效果圖是藝術設計中具有較強應用性的課程，效果圖的每一個參數以及命令都是效果圖的集中表現，衡量效果圖制圖者的水平，一般以參數的搭配以及調整參數的靈活性作為標準。這就需要的大學藝術設計教學中，根據教學的實際情況與內容，加強對學生自主操作能力的培養，使其能夠有效的運用數字化技術，提高學生解決實際問題的能力。我國大學藝術設計教育教學過程中，往往是教師對軟件的操作進行逐一講解，學生根據老師的步驟完成相關的操作，缺乏自主操作。在這種教學模式下，學生沒有主動學習的意識，進行藝術設計也受到老師思想的束縛，只是不斷的模仿。所以必須利用啟發式教學模式，讓學生參與到實際的藝術設計項目中，提倡學生獨立完成設計工作。
（三）在數字化技術的基礎上，加大藝術設計創新教育
在數字化技術的大環境下，傳統的藝術設計教育受到了很大的沖擊，這就需要轉變傳統的教育理念，開拓創新。首先要從大學藝術設計課堂做起，堅持學生為課堂主體的中心思想，教師復雜指導與引導，注重教學內容、方式上的變化，積極開展課堂討論、辯論，培養學生自主思考的能力；其次需要從校園文化做起，積極的開展校園文藝表演、美術展覽、學術講座等活動，為學生藝術創造營造良好的校園環境；最后，鼓勵學生積極開展各項社會調查活動，鼓勵學生參加各項社會實踐活動，使其充分的認識社會，豐富自身的藝術才干，避免藝術設計推理了實際，產生違和感。
三、總結
數字化時代的到來，是我們的文化形象得到了改變，藝術設計教育也發生了巨大的變化。數字化設備為藝術設計提供了技術工具，并且計算機技術、網絡技術等創造了新的藝術表達方式，實現了藝術信息的交流及共享。在數字化時代，藝術教育只有加強創新，才能適應時代的發展，使藝術設計作品更加貼近生活，使學生充分的掌握現代藝術的潮流，為社會培養更多更優秀的藝術設計人才。
參考文獻：
[1]關潔.數字化：藝術教育創新的助推器[J].河南社會科學.2010，15（5）：256-257
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[關鍵詞]MMP_2；MMP_9；TIMP_1；血管平滑肌細胞；增殖；遷移；阿齊沙坦
中圖分類號：R544.1文獻標識碼：A文章編號：1009_816X（2014）04_0274_04
[Abstract] Objective To investigate the effects of azilsartan on TGF_β_induced spontaneously hypertensive vascular smooth muscle cells （VSMCs） proliferation and migration. Methods Rat VSMCs were cultivated by the method of tissue explants adherence. Cells of generation 3 to 5 were used as the experimental system. The MTT test was used to measure cell proliferation and Boyden chamber assay was used to measure cell migration. Primary cultured VSMCs were treated by 10 ng/ml TGF_β and azilsartan for 24 hours. The expression of MMP_2， MMP_9， TIMP_1 were measured by Western blot and RT_PCR. Results The expression of MMP_2， MMP_9 and TIMP_1 in rat VSMCs stimulated by TGF_β increased significantly. VSMCs migration and proliferation also increased significantly. Azilsartan significantly inhibited TGF_β induced MMP_2， MMP_9 and TIMP_1 production in rat VSMCs， as well as VSMCs proliferation and migration. Conclusions Azilsartan inhibited TGF_β_induced VSMCs proliferation and migration by down_regulation the expression of MMP_2， MMP_9， TIMP_1.
[Key words] MMP_2； MMP_9； TIMP_1； Vascular smooth muscle cells ；Proliferation； Migration； Azilsartan
自發性高血壓是最常見的心血管疾病，以體循環動脈壓升高為主要特點。高血壓伴發的血管重構包括血管壁腔比增加、小動脈稀少及血管功能異常?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是參與降解全身各種組織細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的蛋白酶家族，參與正常和病理條件下的組織重構，金屬蛋白酶組織抑制物（TIMP）是MMPs的特異性抑制物[1]。MMPs/TIMP的動態改變，造成選擇性的降解ECM，從而調整血管內皮細胞形態、生長和成活[2]。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑可能是通過抑制局部腎素血管緊張素醛固酮系統（RAS）活性和緩激肽的降解來抑制或逆轉血管重構[3]。阿齊沙坦是一種血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，多用于治療高血壓病[4]。但沙坦類藥物是否可抑制血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）中MMPs/TIMP的表達則鮮有報道。通過藥物抑制MMPs/TIMP活性，減少細胞外基質的降解，阻止血管平滑肌細胞的增殖和遷移是防治高血壓發生、發展的一個可能的切入點。本研究觀察血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑阿齊沙坦對血管平滑肌細胞中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達的影響，探討轉化生長因子_β（TGF_β）在自發性高血壓大鼠發生、發展進程中誘導細胞外MMPs/TIMP分泌及促平滑肌細胞遷移、增殖能力，為臨床應用阿齊沙坦治療高血壓提供指導信息。
1資料和方法
1.1材料：自發性高血壓大鼠（SHR）和同一株系的正常血壓大鼠（WKY）大鼠（購自上海第二醫科大學附屬瑞金醫院高血壓研究所），雄性，7～10周齡。血壓：SHR>170mmHg（1mmHg=0.113kPa），WKY
1.2實驗分組：將大鼠斷頭處死，無菌情況下分離胸主動脈，剪碎后加入含有20%胎牛血清的DMEM培養液，用貼壁細胞培養法行原代細胞培養至細胞長成致密單層后傳代，取3～5代細胞用于實驗。在傳代過程中，細胞以5×105個/ml接種于6孔板培養板上。實驗前48h換成不含血清的DMEM，使細胞處于靜止狀態。將培養的VSMC分成6組：WKY組、SHR組；TGF_β刺激WKY組、TGF_β刺激SHR組：10ng/ml TGF_β誘導增殖；TGF_β刺激WKY組阿齊沙坦給藥組、TGF_β刺激SHR組阿齊沙坦給藥組：50μmol/ml阿齊沙坦預處理30min后，用10ng/ml TGF_β誘導增殖。各組均應用0.2%胎血清培養液培養，培養24h后收集細胞。
1.3MTT法檢測阿齊沙坦對TGF_β誘導的VSMCs細胞增殖的作用：取對數生長期細胞，以每孔3×104/孔均勻接種于96孔培養板內，按照上述分組方法將各組細胞懸液接種于96孔板上，培養24h后，結束實驗，將每孔的培養液吸出，重新加入180μl培養液，然后每孔加入濃度為5mg/ml的MTT液20μl。在37℃培養箱內繼續培養4h后，吸取培養液，每孔加入DMSO 200μl振蕩10min，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長測定各孔A值，取每組3孔的均值。
1.4Boyden趨化小室檢測阿齊沙坦對TGF_β誘導的VSMCs細胞遷移的影響：取對數生長期的VSMCs，將培養的VSMCs分成6組觀察VSMCs遷移：WKY組、SHR組：上室中加入未經處理的VSMCs懸液，下室中加人DMEM；TGF_β刺激WKY組、TGF_β刺激SHR組：上室中加入未經處理的VSMCs懸液，下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml；TGF_β刺激WKY組阿齊沙坦給藥組、TGF_β刺激SHR組阿齊沙坦給藥組：上室中加入50μmol/ml阿齊沙坦孵育2h的VSMCs懸液，下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml。上、下室之間隔以8μm孔徑聚碳酸酯濾膜。將建立好的Boyden小室放入一容器培養24h后取出濾膜，固定、染色，在高倍鏡下（×400）隨機觀察6個視野，計數移行細胞數，取平均值。
1.5Western blot檢測蛋白表達：取對數生長期細胞，0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗滌兩次后離心棄上清，加入含全酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解液冰浴裂解提取總蛋白。BCA法測定樣品蛋白濃度，完成十二磺基硫酸鈉/聚丙烯酸胺凝膠電泳和蛋白轉膜操作，膜片分別與一抗（抗MMP_2多克隆抗體、抗MMP_9多克隆抗體、抗TIMP_1多克隆抗體）進行抗原抗體結合反應，再與辣根酶標記二抗反應，經適當洗滌，膜片與ECL溫浴1min，保鮮膜包裹后，經X光片曝光，顯影和定影，最后對結果進行光密度掃描分析。
1.6RNA的提取及RT_PCR檢測m_RNA表達：以Trizol提取細胞總RNA，按照試劑盒要求操作。MMP_2上游引物序列：5’_GCGACAAGAAGTATGGCTTC_3’，下游引物序列：5’_TGCCAAGGTCAATGTCAGGA_3’；MMP_9上游引物序列：5’_CGCAGACATCGTCATCCAGT_3’，下游引物序列：5’_GGATTGGCCTTGGAAGATGA_3’；TIMP_1上游引物序列：5’_CAATTCCGACCTCGTCATCA_3’，下游引物序列：5’_TCAGAGCCTTGGAGGAGCT_3’，按實驗室常規方法進行PCR擴增。用反轉錄反應液2μl作為模板，加入2μl上游及下游引物和2μl Taq酶后用PCR儀擴增。循環步驟如下：變性94℃ 1min，58℃ 1min和72℃ 1min共35個循環；末次長7min，終止反應。以β_actin為內參，依據2_ΔΔCT法計算各組細胞mRNA的相對表達量。
1.7統計學處理：以SPSS16.0統計分析軟件進行統計，計量資料用（x-±s）表達，組間比較采用t檢驗分析，P
2結果
2.1MTT法檢測TGF_β對VSMCs細胞的增殖作用：見圖1。MTT法檢測結果如圖所示：SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組細胞增殖水平均顯著高于對照組和TGF_β+阿齊沙坦給藥組（P0.05）。另外，SHR組VSMCs細胞增殖水平均顯著高于相同干預的WKY（#P
圖1各組大鼠VSMCs細胞增殖水平的比較
2.2阿齊沙坦對TGF_β誘導的VSMCs細胞遷移的影響：見圖2。與WKY組相比，SHR組細胞遷移數目明顯增多（#P
圖2阿齊沙坦對TGF_β誘導的VSMCs細胞遷移的影響2.3各組VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1蛋白水平比較：Western blot檢測結果如圖3所示：SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達水平均高于對照組和TGF_β+阿齊沙坦給藥組（P0.05）。各組SHR大鼠VSMCs中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達水平均顯著高于相同干預的WKY大鼠（P
圖3MMP_2、MMP_9和TIMP_1在各組細胞中的蛋白的表達
2.4各組VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1 mRNA水平比較：RT_PCR檢測結果見圖4。SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組MMP_2、MMP_9和TIMP_1 mRNA表達水平均高于TGF_β+阿齊沙坦給藥組（*P
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【摘要】 ［目的］探討懷牛膝總皂苷（ABS）大鼠血管平滑肌細胞增殖、遷移的影響，闡明其抗動脈粥樣硬化的機制。［方法］采用oxLDL誘導大鼠主動脈平滑肌細胞增殖的方法，采用MTT法測定VSMC增殖，采用傷口愈合法測定VSMC遷移能力，觀察ABS對oxLDL誘導的大鼠血管平滑肌細胞增殖、遷移的影響。［結果］oxLDL濃度為30mg/L促進VSMC增殖最強；ABS（50、100、150mg/L）顯著抑制oxLDL誘導的VSMC增殖，作用呈濃度依賴性；ABS（20mg/L）顯著抑制oxLDL誘導的VSMC遷移。［結論］ABS能抑制oxLDL誘導的VSMC增殖與遷移，說明其具有抑制血管內膜增厚和斑塊形成的作用。
【關鍵詞】 懷牛膝總皂苷；oxLDL；血管平滑肌細胞；增殖；遷移
Abstract：［Objective］To investigate the influence of Achyranthes bidentata saponins（ABS）on the proliferation and migration of rats aorta vascular smooth muscle cells，and to elucidate its mechanism of antiatherosclerosis.［Methods］The oxidized low density lipoprotein （oxLDL） was used to induce the proliferation of rats aorta vascular smooth muscle cells（VSMC） and Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） assay was used to determine the growth of them，wound healing assay was used to determine the influence of ABS on the ability to migrate of VSMC.All methods were used to observe the effect of ABS on the proliferation and migration of VSMC induced by oxLDL.［Result］The proliferation of VSMC was at the highest level when the concentration of oxLDL was 30mg/L，and this effect of oxLDL could be significantly inhibited by ABS（50，100，150mg/L） in a concentrationdependent manner;ABS could also inhibit the migration of VSMC induced by oxLDL at 30mg/L.［Conclusion］ABS could inhibit the proliferation and migration of VSMC induced by oxLDL.From these results，it appears that ABS can reduce the thickness of vascular intima and inhibit the development of vascular plaque.
Key words：Achyranthes bidentata saponins; oxLDL;vascular smooth muscle cells; proliferation; migration
動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發病機理有許多學說，但以氧化損傷學說研究最多［1］。氧化修飾LDL（oxLDL）能促進泡沫細胞形成及血管平滑肌細胞增殖和遷移，導致動脈粥樣硬化［2］。本研究采用中醫臨床治療心血管疾病的常用藥物懷牛膝，觀察其對oxLDL誘導的VSMC增殖和遷移的影響，報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
懷牛膝總皂苷（浙江中醫藥大學化學教研室提供），SD大鼠（浙江中醫藥大學動物實驗中心提供），人血漿（購自浙江省血液中心），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所），DMEM（美國GIBCOBRL公司），胰蛋白酶（杭州宏博生物工程有限公司Amresco分裝），MTT（華美生物工程公司），二甲基亞砜（浙江杭州雙林化工試劑廠），其余試劑為國產分析純試劑，超速離心機（日本Hitachi公司），熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），UV754紫外分光光度儀（上海分析儀器總廠），HEPA CLASS 100型細胞CO2培養箱（美國THERMO公司），SWCJ1F超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），UR4100型酶標儀（美國Dynatech公司）。
1.2 方法
1.2.1 低密度脂蛋白制備、氧化與鑒定
參考郭剛等方法［3］，取人血漿，用序列超速離心法，獲得LDL區帶（密度范圍為1.019～1.063）。取LDL于試管中加入CuSO4溶液氧化，使Cu2+終濃度為10μmo1/L，37℃分別孵育20h。氧化后的LDL加入終濃度為20μmol/L EDTA，4℃放置2h終止氧化，再以pH 7.4 PBS緩沖液透析24h除去EDTA，PEG 2，0000濃縮到一定體積。通過Lowery法檢測蛋白含量為4.8g/L。制備的oxLDL盡快0.22μm過濾除菌，保存4℃備用，兩周內用完。對氧化后的LDL蘇丹黑預染，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測oxLDL比LDL遷移速度大。
1.2.2 大鼠胸主動脈平滑肌細胞的培養
參考任立群等方法［4］，雄性SD大鼠處死后，無菌條件下取胸主動脈，去除血管內膜和外膜，將中膜以組織塊法培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2孵箱中靜置培養。待細胞鋪滿培養瓶底達80%時，用0.15%胰酶和0.02%EDTA消化，進行傳代培養，傳代比例為1∶2，傳代周期為4～5d。選生長良好的第5～10代傳代細胞用于以下實驗。
1.2.3 確定oxLDL誘導的VSMC生長的最佳濃度
取對數生長期的細胞以每孔6000個細胞接種于96孔板中，每孔200μl，分7組，每組6個孔。用含10%FBS的DMEM培養一天后，換用無血清DMFM培養，次日各組換用含5%FBS的DMEM并分別處理如下：第1組不加oxLDL；其余各組加oxLDL，終濃度分別為10，20，30，40，50，60 mg/L，24h后加入5mg/ml MTT，每孔20μL，置37℃，5%CO2培養箱中培養4h后取出，加入二甲基亞砜，每孔150μL，振蕩充分溶解結晶。用酶聯免疫儀檢測在570nm的吸光度值（OD）值（OD值與細胞數正相關），實驗重復3次，以每組各孔平均OD值繪制增殖曲線，確定以oxLDL的濃度為30mg/mL促細胞增殖最佳濃度。
1.2.4 MTT法測定VSMC增殖的反應
取對數生長期的細胞以每孔6000個細胞接種于96孔板中，分5組，每組六個孔。用含10%FBS的DMEM培養一天后換用含5%FBS的DMEM并分別處理如下： 1、空白組；2、oxLDL組：30mg/L oxLDL；3、低劑量組：30mg/L oxLDL+50mg/L ABS；4、中劑量組：30mg/L oxLDL+100mg/L ABS；5、高劑量組：30mg/L oxLDL+150mg/L ABS。24小時后通過MTT法（同上）檢測細胞增殖情況。測各孔OD值，實驗重復三次，比較每組平均OD值大小差異。
1.2.5 傷口愈合法測定VSMC遷移能力
參考相關文獻方法［5］，取對數生長期的細胞，以每孔5×104個細胞接種于24孔板中，每孔1ml，分3組。用含10%FBS的DMEM培養，待細胞長滿瓶底80%左右，用200μl槍頭在每個孔中劃出基本相同的寬度，5%DMEM培養并分別如下分組：1、空白組；2、oxLDL組：30mg/L oxLDL；3、給藥組：30mg/L oxLDL+ 20mg/L ABS，拍照記錄，設為0點，用ipp6.0圖像處理軟件測定劃帶寬度W0，在顯微鏡下分別記錄并測定24h劃帶的寬度，每孔取6處劃帶寬度值求平均值w，計算各個時間段細胞實際遷移距離即h= （W0w）/2，比較每組平均h值大小差異。
1.2.6 統計學處理
所有數據以表示，由SPSS 13.0軟件進行統計分析，數據采用t檢驗。
2 結果
2.1 ABS對oxLDL誘導的VSMC增殖的影響
見表1。表1 不同濃度ABS對oxLDL誘導的VSMC增殖的影響（略）
2.2 ABS對oxLDL誘導的VSMC遷移能力的影響
見表2。表2 ABS對oxLDL誘導的VSMC遷移的影響（略）
3 討論
文獻表明，oxLDL在AS形成過程中起著重要作用［2］。一方面oxLDL與清道夫受體結合，導致VSMC內吞oxLDL，繼而產生平滑肌源性泡沫細胞，而脂質在泡沫細胞中沉積所造成結果是動脈壁的纖維斑塊和粥樣斑塊。另一方面oxLDL通過促進平滑肌細胞釋放血小板源生長因子（PDGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等因子，而這些細胞因子可促進VSMC增殖和遷移。［3］結果造成血管內膜增厚、斑塊形成及管腔狹窄等效應，從而促進 AS 的發生和發展。本實驗結果證明ABS能顯著抑制血管平滑肌細胞增殖與遷移，表明ABS抑制血管內膜增厚和斑塊形成的作用，這為臨床上防治動脈粥樣硬化提供可靠的理論依據。
參考文獻
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大一學習計劃書范文5
作者：王瑩 杜克莘 施京紅 謝雯
【摘要】 目的：觀察海洛因暴露對小鼠成癮和學習記憶相關腦區的磷酸化p38 MAPK（pp38）表達的影響，探討p38 MAPK細胞信號轉導通路是否參與了發育早期海洛因暴露引起子代腦發育損傷的分子機制. 方法： 于胚胎鼠齡9～18 d時給孕鼠皮下注射海洛因10 mg/(kg·d)，建立子宮內海洛因暴露的小鼠模型. 按出生前處理將小鼠分為海洛因和鹽水組. 蛋白免疫印跡檢測兩組小鼠前額葉皮層、海馬、伏核、杏仁核腦區pp38的表達改變. 結果： 與鹽水組相比，海洛因組小鼠的pp38蛋白表達在前額葉皮層、海馬、伏核、杏仁核4個腦區均有明顯增加( P< 0.05). 結論： 海洛因暴露可引起小鼠前額葉皮層、海馬、伏核、杏仁核腦區的pp38 MAPK蛋白表達上調，提示p38 MAPK信號通路可能參與了海洛因損傷小鼠神經發育的分子機制.
【關鍵詞】 海洛因；p38絲裂原活化蛋白激酶；前額葉皮層；海馬；伏核；杏仁核
0引言
近年來，女性濫用者增多，且大多屬于育齡期婦女［1-2］. 研究表明，子宮內海洛因暴露不但可引起新生兒宮內窘迫和發育遲緩，還可導致子代成年后長期的認知行為缺陷和社會行為障礙［3-4］，但其細胞、分子機制未完全闡明. p38是MAPK(mitogenacti vated protein kinase) 超家族的重要成員之一，屬于應激活化激酶，p38 MAPK不但與其他信號傳遞途徑共同介導細胞應激誘發的基因表達和酶活性的改變，還在細胞凋亡、細胞因子的合成釋放、細胞骨架重排等機制中發揮重要作用［5-6］. 本研究旨在探討p38 MAPK 通路是否參與了海洛因導致后代神經、行為異常的機制.
1材料和方法
1.1材料標準品海洛因（heroin），學名二乙酰嗎啡，純度98.5%，由中國藥品生物制品檢定所（國家麻醉品實驗室）提供，批號171206-200614. 兔抗鼠磷酸化p38 MAPK mAb，山羊抗βactin pAb （美國Cell Signalling 公司）；辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔或山羊二抗（博奧森公司）；ECL化學發光試劑盒、PVDF 膜及Hyperfilm 膠片（德國Merck 公司）；蛋白質提取及濃度測定試劑盒（美國BioRad 公司）. FS600超聲波粉碎儀(上海生析超聲儀器有限公司)；離心機（德國Eppendorf公司）；電泳儀（德國Whatman Biometra公司）；紫外成像掃描儀及分析系統（美國BioRad公司）.
1.2方法
1.2.1動物分組及模型建立選健康活潑BALB/c 小鼠60只(第四軍醫大學實驗動物中心)，雌雄各半，2 mo齡，體質量(25±5)g. 自由飲食飲水，晝夜12 h交替光照，室溫25℃，濕度60% 左右. 每日21∶00 雌雄合籠，次日晨查精栓或陰道涂片，以精栓或陰道涂片查到做為受精標志，記為E0d. 將體質量相近的實驗動物隨機分為海洛因組和鹽水組. 從E0～E8 各組動物自由進食， E9～E18 d，鹽水組于21∶00在小鼠大腿外側皮下注射生理鹽水20 mL/（kg·d），1/d，海洛因組組給予海洛因10 mg/（kg·d） 注射，1/d，將藥物溶于生理鹽水中，0.5 g/L. 子代分組同親代孕鼠.
1.2.2蛋白印跡實驗仔鼠30 d齡時在各腦區取材，0.16 mol/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉，速斷頭、開顱、分離各腦區，即刻入液氮，凍存管分裝，-80℃貯存. 用時加入4℃胞質蛋白提取液裂解，20∶1 加入蛋白酶抑制劑PMSF，高速分散器組織勻漿，冰浴1 h，12000 g 4℃離心10 min，沉淀加入4℃預冷核蛋白提取液，震蕩混勻，冰浴1 h，再12000 g 4℃離心30 min，取上清為核蛋白，其蛋白濃度經考馬斯亮藍法定量，取上清加等體積2×SDS 樣品緩沖液，煮沸5 min 使蛋白變性. 取50 μg待測蛋白加入等體積2×上樣緩沖液煮沸5 min，行SDSPAGE 電泳，蛋白半干轉至PVDF膜. 100 V 恒壓轉移2 h后，將PVDF 膜在含5%脫脂奶粉的TBST中室溫下封閉1 h，與1∶1000一抗pp38 MAPK 兔多抗4℃孵育過夜，PBST 緩沖液洗膜3次，每次10 min；隨后加入羊抗兔 IgGHRP 37℃孵育1 h，洗膜3次，每次10 min. ECL化學發光試劑顯影，膠片曝光，UVP 凝膠成像系統掃描目的條帶，Labworks 軟件測量各陽性條帶的光密度，將pp38 MAPK陽性條帶與相應的βactin 條帶吸光度比值作為其蛋白的相對表達量.
統計學處理：所有數據均采用SPSS12.0進行處理，多樣本均數比較采用單因素方差分析.
2結果
分析各組間相應蛋白帶的平均吸光度值，以βactin作內參蛋白，調整后進行半定量分析. 與鹽水組相比，海洛因組動物的前額葉皮層、海馬、伏核和杏仁核4個腦區組織的p38 MAPK磷酸化蛋白表達均明顯增加（P< 0.05，圖1，2）.
3討論
MAPK信號系統作為真核細胞內各種信息傳遞的最后通路和共同通路，能夠將細胞外的各種刺激信息轉移到細胞核內，是神經細胞發生一系列可塑性變化的分子基礎. p38 MAPK 多見于促炎和促凋亡的途徑中，它在細胞分化、凋亡、遷移和增殖等基本生理過程中也發揮著不可忽視的作用［5］，許多細胞外刺激如應激刺激、炎性細胞因子、細胞因子、脂多糖、生長因子等通過細胞內信號轉導通路激活p38 MAPK，進而磷酸化激活 MAPK APkinase2 等，并最終激活ATF2，Max 和MEF2 等轉錄因子而產生生物學效應［6］，但其具體調制及與其他信號通路之間的關系尚未明了.
海洛因暴露導致的行為異常與海洛因作用的時間、時程、劑量和給藥方式等有密切關系，作用方式不同可導致的行為學損傷不完全相同. 我們采用的模型已報道動物有成年后迷宮學習記憶行為缺陷［7］，海馬膽堿能系統及PKC 細胞學定位的改變［8］. 海洛因可迅速通過胎盤和血腦屏障，直接作用于發育中的神經細胞，導致子代成年后的神經行為損傷，但其細胞、分子機制未完全闡明. 我們的結果顯示，發育早期海洛因暴露，上調了小鼠前額葉皮層，海馬，伏核，杏仁核腦區中p38 MAPK 磷酸化蛋白的表達，提示在這些與成癮和學習記憶相關的腦區里，存在著p38 MAPK 信號通路可能參與的生理病理學過程的改變，提示海洛因對子代動物成年后神經行為異常的長期影響，至少是部分源于海洛因在動物的神經系統發育早期，作用于神經行為相關的靶區，使該靶區的神經活動異常或作用于相關基因，使海洛因的致畸作用持續到生后，如海馬損傷導致海馬依賴的空間學習記憶損傷.
p38 MAPK在疾病發展的不同階段，發揮的作用有所不同. 在細胞應激反應或炎癥反應的早期，p38 上調發揮腦保護作用，但隨著反應進程的加深，上調的p38 可以通過加強細胞的炎性反應，介導其他胞外信號引起的炎性細胞因子或炎性產物的表達和釋放，以介導凋亡性細胞死亡的方式損傷神經細胞［6， 9］. p38 蛋白在成癮和學習記憶相關腦區的持續表達上調，是損傷神經發育，或是激發了損傷后的神經代償機制，需要進一步研究.
我們結果的提示，p38 MAPK 通路可能參與了海洛因對胚胎腦發育的毒性作用，進而影響動物成年后的行為，為進一步探討子代神經行為的損傷機制及后期臨床干預中靶蛋白的確定提供了有意義的資料.
【參考文獻】
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大一學習計劃書范文6
[關鍵詞] Notch信號通路；γ-分泌酶抑制劑；血管平滑肌細胞；雙向電泳
[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（c）-0024-04
糖尿病足（DF）是糖尿?。―M）的慢性并發癥之一，是高血糖、周圍血管病變、周圍神經病變等多種因素共同所致，病因復雜，致殘、致死率高，治療費用高。目前針對DF及微血管病變的治療效果難以令人滿意。Notch信號通路具有促進非DM動物缺血區血管新生、動靜脈分化等作用。本課題通過γ-分泌酶抑制劑（DAPT）干預體外培養的DM大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs），研究對Notch信號通路中Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白表達的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
凍存的DM大鼠VSMCs（SPF級SD大鼠購自大連醫科大學動物實驗中心，質量合格證號：0003546，經DM大鼠模型建立、取材后凍存）[1]。
1.2 主要試劑和儀器
DAPT（美國Sellect公司）；全自動凝膠電泳圖像分析系統（日本Olympus公司）；Mini-Protean 3電泳系統、Mini Trans-Blot轉移系統（北航圖像中心）；蛋白濃度測定試劑、β-actin（美國Sigma公司）；兔抗Notch1單克隆抗體、兔抗Notch3單克隆抗體、兔抗Notch4單克隆抗體、倉鼠抗大鼠Jagged-1蛋白（JAG1）慰寺】固?、操|罌勾笫Jagged-2蛋白（JAG2）單克隆抗體、倉鼠抗大鼠DLL4蛋白單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；Bio-Lyte載體兩性電解質、IEF電泳槽、IPG預制膠條（美國BioRad公司）。
1.3 細胞培養
取凍存的DM大鼠VSMCs進行細胞復蘇，將其接種于96孔板，D-Hank′s液沖洗2遍，加入0.25%TRYPSIN+0.02% EDTA?4Na約3 mL進行消化，制成單細胞懸液。按1∶2傳代培養，傳至3代后，隨機分為兩組：正常培養基（con）組和加入DAPT的培養基（實驗）組（濃度梯度分別為0.15、1.25、7.50 μmol/L），繼續培養傳至6代。
1.4 方法
1.4.1 蛋白提取 取配置好的單細胞懸液，加入預冷的細胞裂解液400 mL，冰浴靜置40 min，提取蛋白。
1.4.2 雙向電泳檢測目標蛋白 在198 mm×256 mm×1 mm SDS凝膠上，標記縱橫坐標，將目的蛋白加入坐標原點，進行第一向等電聚焦電泳，聚焦結束后的膠條經平衡處理后立即進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后，取出凝膠，拍照，應用計算機軟件分析處理。取提取的蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，計算上樣量。煮沸，變性，標記，上樣檢測或于-80℃保存。
1.4.3 Western blot 檢測蛋白表達情況 取30 μg蛋白，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，加入抗Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4單克隆抗體（1∶200），4℃孵育過夜，加入二抗IgG（1∶5000稀釋），室溫孵育1 h，ECL試劑盒顯影，以β-actin為內參進行數據標準化，以對照組為參照樣本，計算Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。
1.5 統計學方法
采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 雙向電泳檢測結果
DM大鼠VSMCs蛋白雙向電泳檢測結果顯示，在凝膠上可以看到800多個蛋白點，其中大多數蛋白位于pH 5.0～8.5，分子量為134～300 kD。應用計算機軟件Image-Master 2D Platinum software分析，其中“十字”表示計算機探測到的凝膠分離出的蛋白質點，“標簽”表示經過計算機軟件自動編號后的目標蛋白點，說明提取的蛋白質中含有實驗所需目的蛋白。見圖1。
2.2 Western blot檢測結果
Western blot檢測結果顯示：隨DAPT濃度的增加，Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白表達水平遞減；7.50 μmol/L組與con組相比，差異有高度統計學意義（P < 0.01），0.15、1.25 μmol/L組與con組相比，差異有統計學意義（P < 0.05）；0.15、1.25 μmol/L組與7.50 μmol/L組相比，差異有統計學意義（P < 0.05）；0.15 μmol/L組和1.25 μmol/L組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖2～3。
3 討論
DM已成為世界性疾病[2]，根據國際糖尿病聯盟（IDF）的2015全球DM版圖[3]，目前世界成年DM患者約4.15億人，中國目前為1.096億人，且處于不斷增加中。據統計，15%～25%的DM患者一生中會發生DF[4]，而DM患者的截肢率與非DM患者相比要高40倍[5]，且截肢預后較差。據統計[6]截肢后5年死亡率達40%。
在DM血管病變過程中，VSMCs從中膜移行到內膜，增殖、分泌生長因子，參與纖維膜的形成，VSMCs還分泌合成許多基質分子參與血管病變的發生[7-8]。因此可見，VSMCs在DM血管病變的進展過程中發揮著重要作用。
目前針對DM血管病變的治療主要以內科藥物保守治療、腔內介入手術[9]、旁路移植手術[10]為主，但效果均欠佳，近年來開展的細胞因子治療[11]用于誘導和促進DM血管缺血區血管再生的探索取得一定效果，但也存在一定不足。因此，尋求新的方式以促進更多血管生成是非常有必要的。
有研究證實，Notch信號通路能促進非DM動脈缺血區的血管新生[12-14]，在血管發育的過程中發揮重要的作用。在Notch信號通路的受體和配體中，Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4在血管平滑肌細胞表達[15]。Notch1、Notch3、Notch4受體分別主要由Jagged-1、Jagged-2、DLL4配體啟動[16-17]。Qiao等[18]、Zela等[19]證實Notch信號通路對體外培養正常大鼠血管VSMCs的增殖、分化、凋亡等具有重要的調控作用，進而促進血管新生。但是Notch信號通路是否對DM動脈缺血區具有相同的作用尚未清楚。DAPT是Notch信號通路的抑制劑，可特異性抑制γ-分泌酶活性，進而抑制Notch受體在S3位點的酶切，有效抑制Notch信號通路的激活[20]。
本課題組既往實驗經流式細胞學檢測證實，體外培養的DM大鼠VSMCs經DAPT作用72 h，對其細胞的抑制率較其余各時間段明顯，且當DAPT濃度在0.25、1.25、7.50 μmol/L時，其半抑制率最為明顯[1]，所以本實驗選用以上3個濃度的DAPT作用72 h后行相關檢查。實驗結果顯示：各實驗組與con組提取Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白后行雙向電泳及Western blot檢測證實DAPT可以抑制Notch信號通路的活動，抑制Notch相關蛋白的表達。雙向電泳圖譜經計算機軟件分析表明提取蛋白中含有目的蛋白。Western blot檢查結果顯示：隨DAPT濃度的增加，各蛋白的表達均遞減，說明DAPT干預Notch信號通路能抑制DM大鼠Notch信號通路相關蛋白的表達；其中，當DAPT濃度在7.50 μmol/L時，對Notch信號通路各蛋白表達的抑制作用最明顯；當DAPT濃度在0.15～1.25 μmol/L之間時，干預Notch信號通路后對相關蛋白的抑制作用無明顯差異；當DAPT濃度在1.25～7.50 μmol/L之間時，隨著濃度的升高，DAPT對Notch信號通路的抑制作用逐漸增強，呈劑量依賴型。從結果中可看出，Nocth1、Nocth3、Nocth4蛋白分別與Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白降低的幅度相似，證實了Notch1、Notch3、Notch4受體分別主要由Jagged-1、 Jagged-2、DLL4配體啟動這一理論。本實驗結果提示：Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白在體外正常條件下培養的DM大鼠VSMCs中均有所表達；且DAPT能不同程度阻斷DM大鼠VSMCs Notch信號通路的活性，抑制Notch信號通路相關蛋白的表達，且該抑制作用在一定濃度范圍內（1.25～7.50 μmol/L）呈正相關。結合本課題前期實驗證實DAPT干預Notch信號通路后可抑制DM大鼠VSMCs的增殖、促進凋亡等，提示Notch信號通路與DM大鼠VSMCs的增殖、凋亡等有關。此項研究提示，促進Notch信號通路的表達或許可以促進DM患者缺血區VSMCs的增殖，促進更多新生血管的再生，但目前對Notch信號通路在DM患者中的具體機制還存在許多亟需解決的問題。
總之，DAPT干預DM大鼠VSMCs后能抑制Notch信號通路相關蛋白的表達，抑制Notch信號通路的活性，證明Notch信號通路在DM大鼠血管再生中起著重要作用，而進一步研究Notch信號通路在DM大鼠中的作用C制或許為治療DM患者缺血區血管新生提供一種新的可能。
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