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上皮細胞范文1
首先：鱗狀上皮細胞，是上皮細胞組織的一種，鱗狀上皮又分成單層上皮和復層上皮：單層上皮包括單層扁平(鱗狀)上皮、單層立方上皮、單層柱狀上皮(有的有纖毛)、假復層柱狀上皮(有的有纖毛);復層上皮包括復層扁平(鱗狀)上皮、移行上皮。
其次：鱗狀上皮細胞偏高通過服用消炎類藥物的方式來進行治療，比如羅紅霉素片還有潔爾陰洗液等來進行清晰。
最后：在發現鱗狀上皮細胞偏高后，還可以采用早發現、早手術治療的辦法，術后采用放化療，配合中草藥進行調理有利于提高生存質量。
（來源：文章屋網 ）
上皮細胞范文2
摘要
目的研究高糖誘導人腎近曲小管上皮細胞凋亡及其調控機制。方法以人腎近曲小管上皮細胞株HK2為研究對象，隨機分為對照組、高糖組、甘露醇組。MTT、流式細胞術觀察細胞的增殖和凋亡狀況；ELISA法檢測細胞內Caspase的活性；Westernblot法分析B淋巴細胞瘤2（Bcl2）及Caspase家族蛋白的表達變化。結果與對照組比較，高糖組能抑制HK2細胞的體外增殖，下調抑制凋亡作用的蛋白Bcl2表達，上調促凋亡作用的蛋白Bax、Bak表達（P＜005）；流式細胞術顯示HK2細胞周期有明顯的變化，且隨葡萄糖濃度的升高中期凋亡和末期凋亡所占的比例明顯上升（P＜001），并且Caspase酶原降解及活性表達也呈上升趨勢（P＜001）。結論高糖能抑制HK2細胞體外增殖并誘導其凋亡，其機制可能是通過Bcl2及Caspase家族調控HK2細胞的凋亡。
關鍵詞
高糖；HK2；凋亡；表達
細胞凋亡是生理性過程，不同于細胞壞死；凋亡細胞能產生吞噬和清除碎片的凋亡小體，避免周圍環境中細胞損害，維持內環境穩定［1］。糖尿病腎?。╠iabeticnephropathy，DN）發病機制復雜，DN早期，腎臟通過細胞凋亡等應急反應來清除過度增殖的內皮細胞，維持內環境穩定；DN晚期，隨著腎功能障礙，內環境穩態破壞，細胞凋亡過度，致使腎損害也加?。?－3］。了解和干預腎小管內皮細胞凋亡有助于延緩DN進展。該研究采用體外培養人腎近曲小管上皮細胞株HK2細胞，分析高糖壞境下HK2細胞的增殖和凋亡狀況、B淋巴細胞瘤2（Bcelllymphoma2，Bcl2）及Caspase家族蛋白表達的變化，并進一步探討這些作用可能的分子調控機制。
1材料與方法
1．1材料低糖（55mmol／L）DMEM（美國Gibico公司）；Dglucose、醫用甘露醇（北京國藥集團公司）；Gibco原裝小牛血清（北京索萊寶科技有限公司）；HK2由中國科學技術大學生命科學院贈送，液氮保存；AnnexinVFITC（安徽碧云天生物試劑公司）；一抗actin、Caspase3、Caspase9、Bcl2、Bax、Bak、Caspase7（美國SantaCruz公司）；MTT（美國Sigma公司）；二抗（美國Pierce公司）。
1．2方法
1．2．1細胞培養和分組液氮取出HK2細胞，37℃水浴解凍，迅速接種于含10％小牛血清低糖DMEM（葡萄糖濃度55mmol／L），37℃、5％CO2飽和濕度的細胞培養箱中。胰酶消化傳代，備用。分組：對照組（葡萄糖濃度為55mmol／L）、高糖組（葡萄糖濃度分別為25、40mmol／L）和甘露醇組（葡萄糖濃度55mmol／L＋甘露醇濃度分別為195、345mmol／L）。
1．2．2MTT法檢測細胞增殖取生長旺盛的HK2細胞，胰酶消化，按121分組，MTT實驗嚴格按照前期報道［4］操作，實驗重復3次。
1．2．3AnnexinVFITC分析細胞凋亡取對數期生長的HK2細胞，胰酶消化傳代，制成細胞懸液，取合適的量平均接種于6孔板，次日按121分組，37℃刺激48h，各組胰酶消化制成約1×106個／ml細胞懸液。400μlAnnexinV結合液重懸，加入5μlAnnexinVFITC染色液，2～8℃避光孵育15min。4℃冷凍離心5min（10000r／min），去除上清液，再用400μlAnnexinV結合液重懸，10μl／孔PI染色液，震動器輕輕混勻；錫箔紙包裹置冰上孵育5min，然后上機檢測。
1．2．4Caspase蛋白酶原活性檢測原理：依據ELISA抗原抗體結合的原理，細胞內活性的Caspase7、Caspase3、Caspase9能在體外與相應的酶結合，催化底物顯色反應，通過吸光度（opticaldensity，OD）值OD405來間接反應Caspase7、Caspase3、Caspase9的活性。取對數期生長的HK2細胞，按123步驟操作，分組后置于培養箱連續刺激2d，胰酶消化，冷凍離心5min（10000r／min），按照ELISA法操作，依次加入酶、底物、酶標儀檢測，實驗重復3次。
1．2．5Westernblot法檢測提取總蛋白：按121分組批量培養，刺激48h后，棄去原液并用PBS洗去殘留液體，置冰上，每瓶加裂解液150μl充分裂解，細胞刮子收集細胞，低溫冷凍離心5min（10000r／min），上清液置于－80℃備用，BCA測定蛋白濃度，每組加入濃縮蛋白上樣緩沖液，水浴煮沸，分裝備用，置于－20℃保存。配制125％SDSPAGE，微量加樣針上樣，先用40～50V電泳濃縮膠，100V電泳分離膠，100mA冰浴轉膜，伊利脫脂牛奶封閉，PBS洗膜，置于一抗為Bcl2（1∶400），Caspase7（1∶1000），Bak（1∶1000），Bax（1∶300），Caspase3（1∶2000），Caspase9（1∶800），actin（1∶1000），4℃過夜。相應二抗分別為山羊抗小鼠（1∶1500），山羊抗鼠（1∶1500），山羊抗兔（1∶1000），山羊抗鼠（1∶1000），山羊抗鼠（1∶1000），山羊抗兔（1∶1000），山羊抗小鼠（1∶4000），37℃孵育2h，PBS洗膜3次，暗室內膠片顯影、定影，重復實驗3次。結果進行統計學分析。Westernblot條帶的灰度值用ImagePro45分析軟件測定。
1．3統計學處理采用SPSS190軟件進行統計學單因素方差分析，數據用珋x±s表示。組間計量資料用方差分析。
2結果
2．1高糖對HK2細胞的體外增殖的影響MTT結果采用單因素方差分析進行主體間效應檢測，顯示差異有統計學意義（F＝11204，P＜001）。組間兩兩比較顯示，與對照組比較，高糖組（25、40mmol／L）的OD值依次降低，且糖濃度為40mmol／L抑制率達266％（P＜005，P＜001）；而甘露醇組與對照組比較，差異無統計學意義，表明體外高糖能抑制HK2細胞的體外增殖，與高晶體滲透壓無關。見表1。
2．2高糖對HK2細胞凋亡的影響結果采用單因素方差分析進行主體間效應檢測，差異有統計學意義（F＝8254，P＜001）。組間兩兩比較顯示：與對照組（99％）比較，高糖組（圖1B、1C）中期凋亡與末期凋亡所占的比例明顯升高，并且末期凋亡所占的比例隨著葡萄糖濃度的升高而升高；從圖1D、1E中可以觀察到甘露醇對細胞的凋亡影響不明顯。提示高糖能誘導HK2細胞凋亡，與高晶體滲透壓無關。見圖1、表2。
2．3高糖對Caspase蛋白酶原活性的影響單因素方差分析顯示高糖能夠增強Caspase7、Caspase3、Caspase9活性（F＝7143、5581、7432，P＜001）。組間兩兩比較顯示：與對照組比較，高糖組Caspase7、Caspase3、Caspase9活性呈上升趨勢，但甘露醇組活性沒有明顯變化。見圖2。
2．4高糖對Bcl2及Caspase蛋白酶原家族蛋白表達的影響單因素方差分析顯示高糖上調Bak、bax、cleavedCaspase9、cleavedCaspase3、cleavedCaspase7蛋白表達（F＝2741、4754、3722、41772547，P＜001）；下調Bcl2蛋白表達（F＝3314）。組間兩兩比較顯示：與對照組比較，Bcl2家族Bcl2蛋白表達量有所下降，Bak、Bax蛋白表達量顯著上升，且Bax／Bcl2的比值也呈上升趨勢。另外剪切后的Caspase蛋白酶原家族cleavedCaspase9、cleavedCaspase3、cleavedCaspase7蛋白表達明顯增加，見圖3。
3討論
DN是糖尿病重要并發癥之一，其基本病理特征主要表現為腎小球細胞外基質聚集與降解紊亂，導致腎小球病態增生、基底膜增厚和動脈硬化等，這些改變嚴重影響腎小管的營養供應，誘發上皮細胞程序性凋亡，從而導致腎間質纖維化［5］。國外相關報道［6］證實終末期腎病腎小球損傷多數從腎小球上皮細胞（足細胞）損傷開始；在糖尿病的早期，長期處于高糖環境下的細胞微環境發生改變，導致腎小球超過濾、誘發氧化應激、糖化終產物堆積、蛋白激酶C的激活、多元醇化、轉化生長因子的過表達和炎癥等，這些因素致使腎小管基底膜增厚，養分供應受阻，引起腎小管上皮細胞萎縮，導致腎衰竭。因此干預腎小管上皮細胞凋亡，維持上皮細胞活性，能有效的減緩腎臟的衰竭［5］。體內長期高血糖容易導致上皮、內皮細胞損傷和功能障礙，從而誘發多種疾病，如2型糖尿病等；因此，控制血糖，并通過調節細胞增殖和凋亡修復損傷的細胞有重要的臨床意義［7－8］。本研究模擬體內高糖環境，選取穩定性較好的人腎近曲小管上皮細胞株HK2進行體外培養。作為維持近曲小管功能的上皮細胞，HK2細胞的功能障礙在DN的發生發展中扮演著重要角色。實驗表明高糖刺激48h后HK2細胞的增殖抑制，且出現細胞凋亡現象。
上皮細胞范文3
【中圖分類號】d919．2；q75
【文獻標識碼】b
【文章編號】1007—9297(20__)o1—0048—02
熒光標記str分型技術在法醫物證檢驗中已經得到廣泛應
用，但在實際工作中，含有微量人體脫落上皮細胞的特殊載體在
很多情況下被忽略，關于皮膚脫落上皮細胞的dna檢驗比較
少。本文作者結合案例，對一些特殊載體上的脫落上皮細胞成
功地進行了str檢驗分型，并就檢驗中的相關問題進行討論，旨
在進一步提高辦案人員對此類檢材應用價值的注意。
案例資料
【案例1】20__年1月在某旅社內，犯罪嫌疑人王某將徐某
(女，27歲)掐頸致死，后用打火機燒灼電視機電線再用手拉成多
節，欲用于捆綁。鑒定人員在現場采用紗線兩步擦拭法轉移電
視機電線上的上皮細胞，用chelex一100法提取上皮細胞dna，
microcon一100純化柱處理，用ampfistr。profiler plus ”系統復
合擴增試劑盒進行str位點的復合擴增，擴增產物經abi 310
型基因。
表1 案例1有關檢材str結果
分析儀熒光檢測分型，結果顯示在現場電視機電線上檢出
混合dna譜帶。通過與死者徐某及嫌疑人的dna分型結果一
起比對，發現現場電視機電線上檢出混合的dna譜帶可由死者
徐某和犯罪嫌疑人王某的dna譜帶混合形成，見表1。由此推
斷，嫌疑人來過現場，并使用過該電線的可能性極大，為下一步
針對性的審訊提供了強有力的支持，并最終迫使犯罪嫌疑人交
待了殺人過程。
【案例2】20__年1月，李某(女，23歲)在某美容店被殺。
經勘查及調查訪問后，現場發現的一雙黑色棉皮手套確定為犯
罪分子作案后留下。因為是冬天，考慮到戴棉手套后會有較多
手汗浸人手套的內層。把手套的內層翻轉過來，將出汗較多的
手掌及手指對應位置的棉布各剪一塊置小燒杯中，加人蒸餾水
浸泡過夜，離心收集濃縮沉淀物，鏡檢見有核上皮細胞，用與案
例1相同的方法提取dna 進行檢測，結果檢出一男性dna 譜
帶。與抓獲的犯罪嫌疑人的dna分型結果進行比對，結果見表
2。經統計學計算，偶合率為2．3×10 。。在證據面前，犯罪分
子交代了犯罪事實。
討 論
人體皮膚脫落上皮細胞多為角質上皮細胞，細胞核多已退
化，因而一般情況下接觸物品時留下的上皮細胞多為角化細胞，
使得進行核dna str分型難度極大。但在有些情況下，如出
汗、和物品有摩擦時，會留下較多的有核上皮細胞，使得對這些
皮膚脫落上皮細胞的str檢測成為可能。
表2 案例2有關檢材str結果
對于這些附有微量脫落上皮細胞的載體，關鍵是盡可能收
法律與醫學雜志20__年第11卷(第1期)
集上皮細胞，提取時可以根據載體種類采用沾水棉線反復擦拭
后浸泡或直接浸泡載體等方法使上皮細胞完全解離到浸泡液
中，并采用高速離心收集含有上皮細胞的沉淀物。提取dna
時，向沉淀物加入50 1 chelex一100和2 1 10mg／ml蛋白酶k，
5cc消化2小時以上，以保證上皮細胞的充分消化裂解，消化后
經microcon一100純化柱純化濃縮后，用ampfistr~(r)profiler
plusⅲ系統復合擴增及靈敏度較高的abi 310型基因分析儀檢
測，往往可以得到較理想的dna譜帶。必要時可以經過兩次純
化柱純化濃縮，這樣可以進一步減少抑制劑對擴增的影響，又能
得到足夠用于擴增的dna量。
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參考文獻
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上皮細胞范文4
【摘要】 目的：檢測人膀胱上皮細胞(T24細胞)是否表達雙功能氧化酶(Duox1、Duox2)，并觀察炎癥細胞因子及佛波酯(PMA)對基因表達水平的影響。方法：體外培養人膀胱上皮(T24)細胞，經佛波酯(PMA)、炎癥細胞因子(TNFα及IFNγ)刺激后提取細胞總RNA，采用半定量RTPCR方法觀察細胞Duox1，Duox2 mRNA表達水平。結果：Duox1，Duox2 mRNA在T24細胞中組成性表達，在佛波酯(PMA)、TNFα及IFNγ作用下，Duox2基因表達水平明顯增加，而Duox1基因表達水平無明顯變化。結論：雙功能氧化酶Duox1和Duox2基因在膀胱上皮細胞表達，并受炎癥刺激的影響，其在膀胱上皮細胞中的生理功能值得深入研究。
【關鍵詞】 膀胱上皮細胞;雙功能氧化酶;基因表達
吞噬細胞NADPH氧化酶被激活后，細胞發生呼吸爆發，產生大量活性氧(ROS)，成為細胞殺滅微生物的重要成分。2000年以后，在非吞噬細胞發現了NADPH氧化酶的同源物家族，被命名為NOX(NADPH oxidase)家族。人類NOX家族共有7個成員，即NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2[1-3]。NOX家族廣泛表達于機體的組織器官，其生物學功能成為研究的熱點。雙功能氧化酶(Duox1和Duox2)最初在甲狀腺中發現，它們除了具有NOX的C端結構域外，還有一個N端過氧化物酶樣胞外域，故稱為雙功能氧化酶。近年來，呼吸道、胰腺、腮腺、前列腺及腸胃道上皮等部位陸續發現Duox基因表達。泌尿道上皮是否表達Duox目前未見文獻報道，本實驗利用逆轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR)的方法，觀察膀胱上皮細胞中是否存在Duox表達，并初步探討基因的表達調控因素。
1 材料與方法
1.1 材料 人膀胱上皮細胞株(T24)為本實驗室保存，RPMI1640為GIBCO產品，新生小牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司，佛波酯(PMA)購自sigma公司，細胞因子(TNFα、IFNγ)為PeproTech公司產品，Trizol試劑購自Invitrogen 公司，逆轉試劑盒購自MBI公司，Taq mix DNA聚合酶，DL2000 DNA Marker為天根生物技術有限公司產品，PCR引物由Invitrogen 公司合成。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養及刺激 T24細胞采用含有10%新生小牛血清的1640培養基(無抗生素)常規培養和傳代。實驗前在每個細胞培養皿(60×15mm)中接種30萬個T24細胞，37℃ 5%CO2孵箱培養24h。加入PMA(濃度為5nM)或細胞因子(TNFα 20 ng·ml-1+IFNγ 20 ng·ml-1)，分別在刺激后的12、24h收集細胞抽提RNA。實驗同時設無刺激的空白對照組。
1.2.2 PCR引物設計 根據GenBank 的序列，用Prime5.0軟件分別設計Duox1(登錄號AF213465)，Duox2 (登錄號AF267981)，βactin (登錄號BC016045)的引物。
表1 PCR引物序列
基因上游引物下游引物片段長度(bp)Duox15'cgacattgagactgagttga 3'5'ctggaatgacgttaccttct3'106Duox25'aacctaagcagctcacaact3'5'cagagagcaatgatggtgat3'109βactin5'cgggaaatcgtgcgtgac3'5'tggaaggtggacagcgagg3'4431.2.3 總RNA提取 按Trizol試劑說明操作。貼壁T24細胞直接用Trizol試劑裂解，提取的總RNA用異丙醇沉淀，溶于經過DEPC處理的水中，紫外分光光度計檢測其含量及純度。
1.2.4 逆轉錄反應 在0.5 ml的Eppendorf 管中加入 RNasin 0.5μl，Oligo (dt) 1μl，總RNA 1μl，MgCl2 4μl，10(buffer緩沖液2μl，逆轉錄酶1μl，用DEPC處理過的水補足至總體積20μl ，混勻，42℃反應40min，95℃ 5 min 終止反應，冰浴冷卻5min，-70℃保存。
1.2.5 PCR擴增Taqmix酶12.5μl，cDNA2μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，加水補足總體積25μl。Duox反應程序：94℃ 10min，94℃ 45s，53℃ 45s，72℃ 1min，40個循環，最后72℃延伸10min，4℃保存。βactin反應程序：94℃ 3min，94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 1min， 27個循環，72℃ 5min，4℃保存。
1.2.6 PCR產物的鑒定 取5μlPCR產物，加1μl 6×lodding buffer，以1×TAE電泳緩沖液，在2%瓊脂糖凝膠上電泳約60min，BioRad凝膠圖像分析儀拍照，Quantity One分析軟件對PCR擴增產物的特異性條帶進行灰度掃描，以βactin產物作校正分析，計算目的基因與內參照βactin灰度比。
1.3 統計學處理 利用SPSS軟件13.0對數據進行統計學處理。
2 結果
2.1 總RNA的鑒定
實驗提取的細胞總RNA用紫外分光光度計檢測OD260/OD280比值在1.79-1.90之間，表明所提RNA的純度較高，蛋白質和DNA污染少。從凝膠電泳上可以清晰看到28sRNA和18sRNA兩條帶(圖1)，其亮度之比約為2∶1，5sRNA帶不明顯，表明RNA沒有降解。
2.2 RTPCR擴增結果
PCR擴增結果顯示Duox1，Duox2在T24細胞中有組成性表達(Constructive expression)。佛波酯(PMA)刺激后，Duox1基因表達無明顯改變，而Duox2基因表達增加，并以細胞刺激后12h表達量最高，與未刺激對照細胞相比增加4.5倍(P
3 討論
吞噬細胞(中性粒細胞、單核/巨噬細胞)殺菌機理研究揭示，通過細胞呼吸爆發產生大量超氧陰離子和活性氧(ROS)，是吞噬細胞重要的殺菌方式。NADPH氧化酶(NADPH oxidase)是吞噬細胞呼吸爆發的關鍵酶，該酶在吞噬細胞特異表達?；蛲蛔兌筃ADPH氧化酶活性喪失的病人很容易感染細菌和真菌，這種疾病稱為慢性肉芽腫病(Chronic granulomatous disease，CGD)。2000年以來，通過基因同源檢索，發現人的基因組中另外還有6個基因編碼的蛋白分子與NADPH氧化酶結構和活性相似，因此具有NADPH氧化酶活性的分子被重新分類，分別稱為NOX15(NOX是NADPH oxidase 的簡稱)以及Duox1和Duox2。在吞噬細胞特異表達的NADPH氧化酶現在稱為NOX2，而其他NOX分子廣泛表達于機體的上皮細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞[4-6]。
活性氧(ROS)參與了許多重要生命活動，比如信號轉導、細胞凋亡、炎癥反應、免疫防御、組織損傷等，因此細胞(特別是非吞噬細胞)產生活性氧的分子基礎受人關注。雙功能氧化酶(Duox1、Duox2)是NADPH氧化酶(NOX)家族的兩個重要成員，最早發現它們在甲狀腺中高表達，研究表明Duox2基因突變將使甲狀腺激素合成減少，而Duox1在甲狀腺中表達的生物學意義尚有待明確。近年來研究顯示Duox1、Duox2在呼吸道、腸道上皮細胞也有很高的表達，并把它們與這些粘膜部位的免疫防御功能相聯系，氣管上皮細胞Duox2產生的過氧化氫在乳過氧化物酶及硫氰酸鹽存在的情況下生成具有抗菌活性的次硫氰酸鹽，可能是呼吸道上皮的一種抗菌機制[7-8]。
雙功能氧化酶(Duox1、Duox2)是否在泌尿道粘膜上皮表達目前未見報道。本實驗通過RTPCR檢測表明在膀胱上皮細胞T24中Duox1、Duox2有組成性表達，并且佛波酯(PMA)以及炎癥細胞因子(TNFα和IFNγ)作用均能刺激細胞Duox2的表達，但兩種刺激因素并不能改變Duox1的表達，這與呼吸道上皮細胞雙功能氧化酶表達調控研究比較相似，Duox2表達受IFNγ刺激，而Duox1表達受IL4和IL13刺激[9]。本實驗證實了膀胱上皮細胞表達雙功能氧化酶，因此它們在泌尿道粘膜的生物學功能值得研究。而炎癥刺激增加Duox2基因表達，提示雙功能氧化酶可能參與膀胱粘膜免疫防御過程，為膀胱粘膜抗感染機制研究提供了新的線索。
參考文獻
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上皮細胞范文5
[關鍵詞]糖基化終產物;fractalkine;糖尿病腎病
[中圖分類號]R587.2
[文獻標識碼]B
[文章編號]1006-1959(2009)11-0015-02
糖尿病腎病(DN)是糖尿病嚴重的微血管并發癥之一,是導致終末期腎臟疾病最常見的原因。近期研究證實,糖尿病腎損傷不僅是腎小球的硬化,同時也發生在腎小管。許多研究顯示糖基化終末產物(AGEs)形成與堆積是DN的主要發病機制之一[1]。近年來發現,細胞因子尤其趨化因子和糖尿病腎病的病理變化及臨床表現密切相關。fractalkine(FKN) 是目前發現的趨化因子CX3C家族的唯一成員,它是否在AGEs致DN腎小管間質病變的發病機制中發揮重要作用,值得深入研究和探討。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑:新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所產品)、DMEM培養基(Gibco產品) 、Trizol總RNA提取試劑盒(TaKaRa產品)、RT-PCR試劑盒RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit MBI(Fermentas)產品、DNA Marker D2000(2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100bp)購自天為時代公司、FKN mRNA及β-actin mRNA引物委托上海生物工程公司合成。
1.1.2 AGE-BSA的制備:在PH 7.4的PBS溶液里加入BSA和不同量的葡萄糖,使BSA的終濃度為5.0 g/L,葡萄糖的終濃度為50 mmol/L,過濾除菌,PH 7.4 PBS溶液透析除去未結合的葡萄糖。對照組BSA中不含葡萄糖,其余條件一致。熒光光譜掃描分析鑒定AGE-BSA。
1.1.3 TEC的培養:首先將凍存的人腎小管上皮細胞(TEC)復蘇,將細胞懸液移入培養瓶內,加適量培養液進行培養。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組及干預:實驗設AGE組、對照組。將處于對數生長期的細胞按1∶3移入6孔板中,待細胞生長至80%～90%融合時,換用無血清的DMEM同步化饑餓24h后進行干預:①分別加入不同濃度(50、100、200、400 mg/L)的AGE-BSA對TEC干預24h;②加入200 mg/L 的AGE-BSA對TEC分別干預0、12、24、48h。用不含葡萄糖BSA和無血清培養基DMEM作為對照。
1.2.2 半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測FKN mRNA表達:按Trizol總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA,取2μg為模板逆轉錄。應用RT-PCR試劑盒進行FKN及β-actin的cDNA第一鏈合成,總反應體積25μl。取2μl cDNA進行PCR擴增,以1.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物,用自動凝膠圖像分析儀掃描凝膠圖譜,用LabImage分析軟件對DNA條帶進行密度掃描分析,以特意擴增產物條帶光密度值與內參照條帶光密度值之比值作半定量分析。
1.3 統計學處理:計量數據以均數±標準差(x±s)表示,應用SPSS13.0統計軟件分析數據,采用one-way ANOVA進行顯著性檢驗,組間比較采用S-N-K檢驗,P
2 結果
2.1 不同濃度的AGE-BSA對TEC FKN mRNA表達的影響 :TEC在DMEM組和BSA組有少量FKN mRNA表達,FKN/β-actin mRNA光密度比值分別是:DMEM 0.675±0.039,BSA 0.761±0.078。50、100、200、400 mg/L的AGE-BSA干預后,各組細胞光密度比值分別是:0.880±0.082,0.904±0.060,0.991±0.152,1.125±0.174,FKN mRNA表達隨AGE-BSA濃度增高而增高(P
2.2 AGE-BSA干預TEC不同時間對FKN mRNA表達的影響:用濃度為200 mg/L的AGE-BSA干預TEC 0、12、24、48h,各組的FKN/β-actin mRNA光密度比值分別是:BSA 0.628±0.065,0h 0.595±0.060,12h 0.676±0.058,24h 0.784±0.056,48h 0.982±0.287(P
圖1的DNA電泳圖①Marker;②DMEM;③BSA(200mg/L);④AGE-BSA (50mg/L);⑤AGE-BSA (100mg/L);⑥AGE-BSA (200mg/L);⑦AGE-BSA (400mg/L)
圖2的DNA電泳圖①Marker;②BSA;③AGE-BSA干預0h;④AGE-BSA干預12h;⑤AGE-BSA干預24h;⑥AGE-BSA 干預48h
3 討論
DN的發病機制非常復雜,目前尚未明確。長期以來,人們把研究和治療重點放在腎小球損害上,但研究顯示腎小管的損害在DN的發生、發展中同樣重要,糖尿病患者尿白蛋白排泄率在正常范圍時,就已經存在腎小管損害。腎小管間質病變程度是反映腎功能下降嚴重程度和判斷預后最重要的指標,故對其機制的研究可以為臨床防治DN有重要意義。其中高血糖引起蛋白質非酶糖基化導致的糖基化終末產物和一些炎性趨化因子在其中的相互作用及致病機制正逐漸被認識。
AGEs是由葡萄糖或其他還原糖與蛋白質的游離氨基端經一系列脫水、環化、氧化及重排等反應后形成的不可逆產物,大量研究結果顯示,AGEs參與DN發生機制[2]。而炎癥反應是DN發生發展中的重要環節之一[3]。在DN狀態下由于存在的高糖和血流動力學障礙,引起腎臟固有細胞的損傷,釋放前炎癥介質,白細胞遷移至損傷部位,釋放更多的趨化因子[4],刺激腎系膜細胞分泌膠原纖維、層粘連蛋白、纖連蛋白導致腎小球硬化。腎小管上皮細胞則分泌免疫介質、細胞因子,使腎臟間質單核/巨噬細胞聚集,導致腎間質纖維化[5]。既往研究已證實AGE-BSA干預腎系膜細胞后趨化因子家族中CC亞族MCP-1、RANTES表達增加[6],本實驗進一步研究AGEs對腎小管上皮細胞CX3C亞族的趨化因子-FKN mRNA的表達影響,從而了解糖尿病腎小管間質病變可能機制。
上皮細胞范文6
目的：觀察各種乳腺疾病患者肌上皮細胞(mecs)中單克隆抗體標志物p63的表達及意義。方法:選擇近期在我院接受女性乳腺手術存檔石蠟標本135 例(良性病變 53例,原位癌 27例，浸潤性癌36例,正常乳腺組織19例)，進行s-p法免疫組化染色，標記 p63。結果:p63在正常乳腺組、良性病變組及原位癌組中mecs陽性表達率分別為94.74%、96.23%和59.26%，在浸潤癌組表達僅為2.78%。結論:p63標記乳腺肌上皮細胞具有較高的敏感性和特異性，有助于對乳腺病變的確診。
【關鍵詞】 乳腺疾病 肌上皮細胞 p63 免疫組化染色
肌上皮細胞(myoepithelial cells, mecs)構成乳腺上皮結構的基底細胞層, 在良性病變中, 腺體周圍mecs存在, 而在惡性病變出現浸潤時mecs消失[1，2]。我科應用免疫組化雙標記法檢測135 例我院女性乳腺手術存檔石蠟標本中的mecs，現報告如下:
1 資料和方法
1.1 資料 收集2005年7月～2008年7月在我院接受女性乳腺手術存檔石蠟標本135例, 入選患者術前未經歷放療、化療。其中，良性病變53例 (增生疾病46例、纖維腺瘤23例、導管內狀瘤14例),原位癌27例(小葉原位癌12例、導管內癌15例)，浸潤性癌36例(包括浸潤性導管癌27例，浸潤性小葉癌9例)，正常乳腺組織19例。入選標本病理診斷無異議。
1.2 方法 單克隆抗體p63免疫組化染色采用s-p法,p63抗體及s-p試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司, 實驗步驟參照說明書進行。結果判定以細胞核出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。
2 結果
19例正常乳腺組織mecs呈p63陽性表達18例(94.74%)，53例乳腺良性病變中, mecs呈p63陽性表達51例(96.23%), 表現為陽性細胞圍繞腺體上皮形成一層大致均勻間隔的點狀結構,2例(纖維腺瘤)部分mecs p63表達陰性。27例原位癌p63陽性表達為16例(59.26%)，且表達不盡相同，即在同一病例中癌性導管周圍p63陽性的mecs表達也不一致，顯示為有完整的肌上皮細胞或有不同程度的缺失，36例浸潤癌中僅有1例(2.78%)在癌組織中有小灶狀p63陽性表達，且表達模式是胞漿和胞核同時表達。
3 討論
p63基因是近年來新發現的一種基因，定位于3q27-3q29，由于其結合域與p53基因有高度的同源性，被認為是p53家族的新成員。一些研究[1，2]表明，p63免疫活性表達通常限于肌上皮前驅細胞，因此觀察p63表達有助于判定靜止乳腺肌上皮前驅細胞，后者對乳腺疾病的臨床病理診斷非常有價值。本研究選擇近期存檔我科的女性乳腺手術石蠟標本標測結果表明，p63在正常乳腺組、良性病變組及原位癌組中mecs陽性表達率分別為94.74%、96.23%和59.26%，在浸潤癌組中一般不表達，這說明乳腺mecsp63標記具有較高的敏感性和特異性。國內另一些作者[3]也觀察到，乳腺組織單克隆抗體p63標記能準確地顯示肌上皮細胞核，而不顯示其他細胞成份。在正常乳腺組織腺體及乳腺良性病變腺體周圍，顯示肌上皮連續性圍繞;而在導管原位癌、小葉原位癌癌巢周圍，肌上皮數目減少呈間斷或不連續環狀;而乳腺早期浸潤性導管癌和乳腺浸潤性癌癌巢周圍，可見肌上皮部分消失及肌上皮全部消失。這說明，從正常乳腺腺體、良性腺體到原位癌、早期浸潤和浸潤性癌性腺體，肌上皮的減少、消失是一逐漸發展的過程。
一般認為，肌上皮細胞對于維持正常乳腺微環境較為重要。國外學者研究表明，乳腺肌上皮細胞能減少乳腺癌細胞的浸潤，在控制乳腺的微環境中起著重要作用。其作用機制為，肌上皮細胞能分泌一種抗癌蛋白maspin，后者可以通過對細胞作用來影響腫瘤組織生物學特性，特別是在肌上皮細胞抑制乳腺癌細胞體外浸潤能力中扮演角色。這些研究[4]認為，肌上皮細胞的存在是乳腺組織的一個保護因素。
綜上所述，p63標記mecs具有較高的敏感性和特異性，可作為乳腺良惡性疾病鑒別診斷的重要參考指標。但p63抗體臨床應用也有一些局限性：①少數部分腫瘤細胞可有表達;②由于p63為核陽性，雖然mecs在正常乳腺組織及良性乳腺病變組織中是連續的，但mecs細胞核是分離的。因此，p63在良性乳腺病變組織中不能顯示連續的mecs，這雖然對大多數乳腺良惡性病變診斷不會帶來困難，但在小管狀硬化性腺病和小管癌做鑒別時應謹慎。
【參考文獻】
[1] 袁慧敏.乳腺良惡性病變的肌上皮細胞免疫組化檢查[j].現代實用醫學,2006,18(11)：809-810.
[2] 張艷梅，李瑩杰，杜金榮.免疫組化在乳腺良、惡性疾病鑒別診斷中的意義[j].哈爾濱醫科大學學報，2008，42(5)：492-493.
