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細胞培養范文1
【關鍵詞】 內耳干細胞 培養 移植 中毒性耳聾 動物模型 大鼠
長期或過量使用鏈霉素、慶大霉素及丁胺卡那霉素等類藥物導致的中毒性耳聾是臨床常見的藥物副作用。根據國家食品藥品監督管理局統計，每年我國因藥物造成聽力損害的患者高達數百萬人。經研究發現其致病機制主要為：耳毒類藥如氨基甙類抗生素可抑制ATP 酶的活化，使內、外淋巴液中K+、Na+ 倒置， 引起膜通透性改變和多種水解酶釋放， 最終使內耳毛細胞萎縮、變性、壞死，而且內耳毛細胞損傷通常是不可逆的。近年來，隨著神經干細胞研究的不斷深入，已有研究表明：內耳損傷后外源基因刺激可以產生新的毛細胞。因而，通過促進耳源性神經干細胞向毛細胞轉化，利用其本身的分化特性， 重建毛細胞形態和神經連接， 恢復毛細胞功能也許是治療中毒性耳聾的有效途徑之一。本實驗通過移植內耳干細胞入中毒性耳聾模型大鼠內耳，觀察移植后的內耳干細胞生長、整合等情況，為治療中毒性耳聾提供實驗理論依據。
1 材料和方法
1.1 實驗動物 選用健康SD大鼠20只，雌雄不限，體重350～400 g，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供。
1.2 試劑和抗體 Neurobasal培養基、B27輔助培養基（GIBCO公司）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，Sigma公司）、胰蛋白酶（Sigma公司）、巢蛋白（nestin）抗體（Sigma公司）、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)及其單克隆抗體（Sigma公司）。
1.3 主要儀器 離心機、超凈工作臺、二氧化碳培養箱、恒溫水浴箱、倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、FACS Calibur型流式細胞儀（BD公司）等。
1.4 中毒性耳聾模型的建立 聽耳廓反射和前庭功能正常的大鼠給予硫酸慶大霉素肌內注射。選用中等度的中毒劑量80 mg/（kg·d），連續使用10天。經聽耳廓反射測定器檢查判定鼠的聽力下降程度以及耳蝸切片觀察耳蝸損傷狀況，特別是內耳毛細胞崩解的程度，確定造模成功與否。
1.5 實驗分組 本實驗隨機分為2組，每組10只：干細胞組，行干細胞耳蝸內移植；生理鹽水組，耳蝸內注入生理鹽水。
1.6 耳蝸干細胞的分離、培養及鑒定
1.6.1 耳蝸干細胞取材 水合氯醛深度麻醉P0大鼠（胚鼠），無菌操作條件下分離內耳耳蝸。經碘酊、乙醇消毒后固定于燭臺， 去外膜，在解剖顯微鏡下操作，剪去動物耳廓及外耳道(外耳道為軟骨性) ，暴露鼓膜，透過菲薄的鼓膜可見到聽骨鏈。用耵聹鉤沿鼓膜下緣6點處進針，鉤住下鼓室部位稍用力迅速將顳骨乳突部連同鼓膜整塊摘除，暴露出鼓岬及其前下方的蝸錐，摘除聽骨，刺破兩窗膜(圓窗和卵圓窗)，用眼科剪剪開耳蝸前方的薄層骨連接至顱內，通過此口用耵聹鉤入顱內向后外方骨折取出完整的內耳標本，剪去連接的顳肌， 找到大鼠耳蝸內螺旋溝及內毛細胞下方區域并取材。HBSS液沖洗幾次后剪碎，加入0.125%胰蛋白酶37℃消化30 min。中止反應之后加入0.01% DNA 酶，吸管輕柔吹打成單細胞懸液。
1.6.2 耳蝸干細胞培養 無血清培養基進行培養〔DMEM/F12(1∶1)液 +2% B27 + bFGF 20 μg/L+表皮生長因子（EGF） 20 μg/L〕。待原代克隆形成后分離克隆制作單細胞懸液，按1×108/L 接種培養。7天后將其移至離心管中，500 r/min 離心， HBSS液洗滌，去上清，余液混勻，涂于多聚賴氨酸包被的載片上，晾干， 4%多聚甲醛固定。
1.6.3 耳蝸干細胞鑒定［1-2］ 免疫熒光細胞化學染色法，用抗巢蛋白抗體 (1∶200) 以及BrdU標記內耳干細胞，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。
1.7 耳蝸干細胞耳蝸內移植 將中毒性耳聾模型鼠麻醉后，在無菌條件下，用微量注射器將經BrdU標記的內耳干細胞沿耳蝸壁或者圓窗和卵圓窗注射入內耳耳蝸結構。對照組耳蝸內注射生理鹽水，方法同上。
1.8 取材與觀察 移植4周后，取大鼠內耳移植部位的組織，剪切，1%胰酶充分消化30 min，過濾，離心洗滌5 min，棄上清，沉淀以PBS制成細胞懸液，流式細胞儀計數分析。制作實驗動物內耳的組織切片及耳蝸鋪片，在熒光顯微鏡下觀察內耳組織結構的變化。
1.9 統計學處理 所有數據均采用SPSS軟件包進行t檢驗。P＜0.05為差異有顯著性。
2 結 果
2.1 內耳干細胞的培養及鑒定 取自 P0大鼠內耳的內耳干細胞在無血清培養基中，鏡下觀察剛分離的單細胞呈圓形，大小不一，折光性好，懸浮在培養瓶中，無突起長出。培養1天少數細胞伸出突起，3～4天貼壁的細胞突起伸長，5～6天細胞的突起相連交織成網。將離心后的細胞重新制備成單細胞懸液，6～7天后可見大量懸浮的細胞團形成，細胞團中有很多生長狀態良好的單個細胞，呈桑葚形狀。上述細胞球經巢蛋白免疫熒光鑒定呈陽性，表明分離培養的細胞是具有自我更新能力的干細胞。BrdU特異性標記細胞核，細胞團打散后，可觀察到大量BrdU標記陽性的干細胞，說明這些細胞是具有增殖能力的內耳干細胞。繼續培養后，有些克隆球自然貼壁， 并沿球體周圍伸出突起向四周呈放射狀延伸。細胞球貼壁后，少數細胞從球體遷移出來，細胞形態不規則，呈三角形、錐形或多角形（圖1）。
2.2 內耳組織CD4（+）T細胞計數 用流式細胞儀計數分析，移植后內耳組織CD4（+）T細胞占整個淋巴細胞百分比與移植前差異無顯著性〔（48±5）% vs. (45±6)%，P＞0.05〕。
2.3 內耳的鏡下表現 在熒光顯微鏡下：生理鹽水組表現為毛細胞核消失，在毛細胞核的位置出現染色空白區； 而干細胞組發現有大量BrdU標記陽性的內耳干細胞在移植區域，部分存活的內耳干細胞遷移至耳蝸毛細胞表面， 形態上與內、外毛細胞相似（圖2）。
3 討 論
Li等［3］在成年大鼠橢圓囊斑位置發現存在內耳干細胞， 內耳干細胞在體內和體外培養可分化成毛細胞樣細胞，而且擁有高度的增生潛能和自我更新能力［4］。 Malgrange等［5］采用無血清培養基加絲裂原性生長因子( EGF或bFGF)從P0大鼠耳蝸和內耳螺旋溝區域分離培養出巢蛋白陽性的神經細胞球， 分裂后分化為耳蝸毛細胞和支持細胞， 提示這些巢蛋白陽性細胞可能是出生后損傷的Corti 器內新生毛細胞和支持細胞的來源。Ozeki等［6］也分別從E12和P5大鼠的耳泡和Corti器分離出永生化的毛細胞前體細胞系。
我們選擇在前期實驗中已得到證實的內耳Corti器位置取材，通過巢蛋白（早期神經上皮細胞的標志）以及BrdU（在細胞分裂前DNA的合成期，它可作為底物參與DNA的合成）標記，證明我們取材獲得的細胞是具有增殖能力的干細胞。將獲得的內耳干細胞移植前加BrdU（10 μmol/L）共培養72 h后，用微量注射器將耳蝸干細胞沿耳蝸壁或者圓窗和卵圓窗注射入內耳耳蝸內，鏡下觀察移植后4周大鼠內耳組織。其中生理鹽水組表現為毛細胞核消失，在毛細胞核的位置出現染色空白區或毛細胞核腫脹，核體積明顯增大，染色變淡，且不均勻，有些腫脹細胞核外形不規則［7］，表明毛細胞損傷是中毒性耳聾的前提；而干細胞組可見大量BrdU標記陽性的干細胞從移植區域向周圍擴散，部分存活的內耳干細胞遷移至耳蝸毛細胞表面， 形態上與內、外毛細胞相似， 移植的細胞團外圍與受體膠原有很好的融合，表明移植的內耳干細胞不僅能夠存活［8］，而且有一定的增殖能力。
用流式細胞儀計數分析，內耳組織CD4（+）T淋巴細胞的百分比與移植前沒有明顯變化，表明移植后排斥反應較輕［9］。這主要是由于內耳干細胞與其他干細胞一樣是一種非常原始的細胞，它們較低的免疫原性不會引起明顯的排斥反應。
本實驗結果顯示：移植到中毒性耳聾模型大鼠內耳的內耳干細胞能夠向周圍擴散、存活，而且有一定的增殖能力；移植的細胞團外圍與受體膠原有很好的融合，表現為正常的毛細胞形態。至于這種表現為內耳毛細胞形態的細胞能否重建毛細胞神經連接， 恢復毛細胞功能，是我們后期研究的內容。另外，由于屬于同種同源性移植［10-11］，加上內耳干細胞又是一種非常原始的細胞，它的免疫原性較低，移植后的排斥反應沒有想象的嚴重。
【參考文獻】
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細胞培養范文2
【關鍵詞】細胞培養室；技術服務與交流；培養室建設與管理
實驗室是高等學校從事科研的重要基地，營造一個好的實驗研究環境對實驗室管理和建設起著至關重要的作用。實驗室管理質量的好壞，直接關系到實驗研究是否進展順利。良好的實驗室建設，能給研究者帶來愉快的心情，同時也能有效的提高研究質量。
細胞培養室是綜合實驗室的一個重要組成部分, 細胞培養技術是生命科學各研究領域的一種最基本、最重要、也是應用最廣泛的研究技術之一。對于高等醫學院校來說,各生物醫學相關學科均建有細胞培養實驗室，其規模、檔次、技術水平、使用效率、管理模式、服務保障等方面都缺乏統一的標準，普遍存在著小而全、投資分散、資金浪費、缺乏有效管理、無法提供服務保障、不利于技術交流和創新等諸多問題。本文總結了筆者在細胞實驗室管理與建設方面的一些經驗，并與廣大同行進行探討。
1 細胞培養室的服務職能
細胞培養除了需要嫻熟的操作技術外，更多的體現在培養技術的過程復雜，無菌要求嚴格。研究人員掌握該門技術的時間周期較長。如果成天陷入清洗，包裝和消毒等簡單繁瑣的勞動中，就會影響研究人員專心致志地從事研究活動中更重要的環節。建立大型細胞培養室，由專人進行工作流程服務，實驗室按研究人員的要求提供標準化、規范化的實驗用品和材料，可以極大地提高細胞培養實驗室的成功率，確保實驗器材符合細胞培養的要求，減少研究人員的無謂勞動。因此可以將研究人員從煩瑣的勞動中解放出來，安心從事更重要的研究活動。
2 細胞培養實驗室的技術交流
細胞培養是一項通用的技術平臺。但針對各個研究課題而言，每個研究人員進行細胞培養的目的和要求又各不相同，即既有共性，又有特殊性。一個學科自建的細胞培養室，一般僅局限于本學科領域內有限的研究方向所必需的細胞培養方法和技術，對其它的特殊方法了解不多，因此不利于技術創新。即便是某個研究生掌握的新方法，常常由于畢業分配等原因離開科室，而使新的特殊技術不復存在，不利于特殊技術的建立和完善。
如果大型細胞培養室面向全校開放，自學科的研究人員中具有豐富科研經驗的研究人員、博士、碩士等不同層次、不同研究目的和不同要求，他們相互之間不存在利害關系，容易交流，毫無技術保留。每個人的經驗和教訓很快為大家所用，可極大縮短技術學習的周期和提高新技術的交流。同時，實驗室建立了技術檔案制度，不同學科的研究人員探索的新技術不會因走人而流失，可以極大地豐富和積累特殊技術，提高技術水平，為后來者提供更多的方便。
3 細胞培養室的建設
3．1 細胞培養室面積和房間安排 實驗室的面積應由實驗臺的長度、凈化工作臺的大小等儀器設備情況決定，同時還應考慮科研及實驗人員有足夠的空間，以便安全地進行科研及實驗活動。此外,還應設置面積不小于6 m2的緩沖間及與工作分開的更衣柜等。如果細胞培養室面積大于一個標準單元，至少應有兩個出口，以隨時保持暢通。細胞室里的試驗臺和儀器布局應合理。一般來說，二氧化碳培養箱和凈化工臺不應對著門擺放，離心機不應離得太遠。
3．2 培養室的環境和設施 ① 照明以不影響對實驗中產生的各種現象的觀察為基準，一般采用熒光燈。宜設置專門電力變壓器供電,提高供電質量和可靠性；②房間裝修密閉性應較高，且不宜開設外窗，設窗主要為采光好，必要時還應安裝空調。門、窗、墻表面應涂布便于清洗去污和耐腐蝕的材料。由于細胞原代培養要求較高，設置空氣凈化裝置；③對于配制有毒的試劑，產生較大的氣味和有害氣體的實驗應在規范的通風柜中操作。操作有放射性同位素的實驗,應配備個人防護用品和淋浴室,其廢液應妥善處理。
4 細胞培養室管理制度的建立
4．1 消毒清潔制度 ①每個進入細胞室的工作人員應保證其個人衛生；②進入緩沖間時,應更換潔凈的工作服和拖鞋,進入培養室時須戴帽子和口罩。如做原代培養,工作服應消毒；③第一個進入培養室的人員請及時開啟空氣凈化裝置,最后離開人員請關閉空氣凈化裝置；④每天實驗前必須紫外線常規消毒1 h。每周一次衛生消毒工作并做空氣細菌培養檢查。每月一次全面清潔工作。
4．2 培養箱的使用 ①每天觀察二氧化碳壓力表,及時更換二氧化碳鋼瓶。同時觀察二氧化碳流量指示表,同時培養箱內應放置一溫度計,記錄其溫度與指示表溫度是否一致；②培養箱應劃分不同區域，不同細胞應放不同區域，同時保持適當的濕度；③有的培養箱有高溫消毒功能，注意非管理人員不要動此功能鍵，以免造成某些元件燒毀。
4．3 潔凈工作臺的使用 ①使用前1 h應紫外線照射；②潔凈臺內也應劃分不同的區域，如材料區、操作區、污物區等；③注意安全，特別是酒精燈，如有酒精漏出應立即吸干擦凈，如發生意外用紗布、棉布類蓋滅酒精燈；④ 實驗完畢,所用過的器皿、雜物必須清理,同時進行臺面清潔。
4．4 液氮瓶和低溫冰箱的管理 ①定期檢查液氮的容量，并做好記錄；②存、取細胞株時，注意防凍安全；③存放細胞株時，根據其種類不同，放置不同盒內，同時應標記好名稱和時間并記錄；④低溫冰箱使用時應按其種類劃分不同區域，做好標記并記錄。
4．5 實驗室資料管理制度 ①收集課題計劃書、實驗路線、操作步驟、操作記錄，各種實驗的數據及儀器說明書等；②由負責人指定專人負責并督促不同時段內完成。如果有不規范的資料，請有關人員及時糾正；③資料歸檔后的資料由專人統一管理。若有些課題涉及專利與發明等知識產權問題，應注意保密。
總之,隨著現代科學技術的快速發展,適應高等醫學院?？蒲幸?如何建設好和管理好大型細胞培養實驗室對于促進學?？茖W研究水平的提升是值得探討的課題。
參考文獻
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細胞培養范文3
關鍵詞：小鼠單核巨噬白血病細胞；細胞刮棒；高壓滅菌；酸堿度
細胞培養技術是目前很多醫學研究離不開的技術，腫瘤細胞在細胞培養中占據核心的地位。腫瘤是對人類威脅最大的疾病之一，是研究癌變機制和抗癌藥物篩選的重要手段。腫瘤細胞雖具有無限增殖的特性，但并不表示培養起來很容易，很多因素都會影響到細胞的形態及功能。如：酸堿度、CO2濃度、環境溫度等。小鼠單核巨噬白血病細胞（RAW264.7）是炎癥研究中非常常見的研究對象，炎癥是伴隨多種疾病的并發癥，因此越來越受到重視。本文根據實踐經驗，總結RAW264.7細胞在培養過程中的生活特性及影響因素，為細胞科研工作提幫助。
1 RAW264.7細胞研究
RAW264.7細胞是小鼠源性破骨前體細胞，該細胞株由Raschke WC等建立。它來自Abelson小鼠白血病病毒所致的腫瘤[1]。據知網上不完全統計，可以發現我國從1986年就已經有對 RAW264.7細胞的研究了[2]，至2014年共有2700余篇，截止2013年其研究趨勢，見圖1，可見RAW264.7細胞研究越來越受到重視，因此對于RAW264.7細胞的培養需一個規范化的標準。
圖1 RAW264.7細胞研究趨勢
2 RAW264.7細胞的培養
RAW264.7是破骨前體細胞，因此在培養過程中很容易分化形成破骨細胞，另外 RAW264.7細胞也是一種巨噬細胞，具有很強的黏附和吞噬抗原的能力，很容易將外界環境中抗原吞噬，而發生分化，出現偽足現象，這是困擾科研工作者的一個難題。因此對RAW264.7細胞的培養也是一個很長時間摸索的過程。正常的RAW264.7細胞是圓形透亮的，而分化之后很容易產生觸角，此時細胞已經在功能上發生改變，進而影響實驗結果。在我國很多細胞庫給購買者的建議是用0.25%的胰酶消化，因此我們采取了用0.25%的胰酶消化法來進行培養，發現用一般的胰酶配制的0.25%的胰酶可以很快的將細胞消化下來，但是對細胞的損傷很大，細胞傳代之后在培養瓶中很難貼壁，很少貼壁的細胞，細胞棱廓也變得模糊不清，細胞再也很難恢復之前的狀態。根據很多培養RAW264.7細胞的科研工作者的經驗，認為RAW264.7細胞很難用0.25%的胰酶消化這一說法，一直困惑著我們。提示這種反差的現象也許跟胰酶的純度有關。于是我們改用細胞刮棒的方法進行傳代，發現細胞狀態損傷較小，細胞在傳代2~4 h內基本貼壁，且細胞狀態完好。具體方法是沿著細胞壁的一端順勢往另一端刮，力度要輕柔，能夠將細胞刮掉即可。這里強調一定要輕，細胞是個很脆弱的個體，力度過大對細胞會造成物理損傷，嚴重時不能恢復其正常形態。對于RAW264.7細胞培養使用的培養基很多經驗者建議使用1640，中科院上海細胞庫則建議使用DMEM高糖培養基，胎牛血清可使用GIBCO胎牛血清，也可使用國產杭州四季清。因此我們對培養基和胎牛血清（FBS）的使用進行了正交實驗，研究發現DMEM高糖培養基與GIBCO胎牛血清培養的細胞狀態最好，但對于資金短缺的科研工作者也可以使用DMEM高糖培養基與國產杭州四季清進行培養，1640則需與GBICO胎牛血清配合使用，這樣才能保證細胞狀態圓而透亮。關于FBS是否滅活則需要根據你所買的FBS是否含有對細胞刺激較大的抗原決定，如有些杭州四季清含有低內毒素，內毒素是引起巨噬細胞炎癥反應的激動劑[3]，此時我們則需滅活，因此在購買血清時應盡量避免含有這類抗原的血清。血清購買回來需及時分裝，分裝需在無菌條件下操作，然后置于-20℃保存。下面根據對RAW264.7培養研究，將細胞復蘇，細胞傳代以及細胞凍存的要點歸納如下。
2.1細胞復蘇 從液氮罐中取出凍存管，迅速將凍存管放到已經預熱的水浴鍋（37℃）中迅速解凍，不斷的搖動，待凍存管內液體完全溶解（控制在1 min內），取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內，將凍存管內的液體轉入15 mL離心管，加入2倍體積含10%胎牛血清的DMEM培養基，800 rpm離心3 min，棄去上清液，重懸細胞，接種到培養瓶中，37℃，5%CO2條件下培養，此時重點是細胞凍存本來就是對細胞的損傷，需采用的是20%的胎牛血清進行復蘇培養，第二次傳代后換成10%FBS培養。
2.2細胞傳代 待細胞長至80%~90%時，從培養箱內取出細胞，小心吸出培養液，用PBS清洗，加入3 mL 10%胎牛血清的DMEM培養基，用細胞刮棒沿一個方向輕輕的將細胞刮下來，將細胞懸液轉移到15 mL離心管中，800 rpm離心3 min，棄去上清液，加入培養液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液，分裝入培養瓶后，放入培養箱37℃，5%CO2條件下培養，因為RAW264.7細胞的增殖非?？欤虼藗鞔壤鶕约簩嶒炐枰?∶3~1∶10均可。
2.3細胞凍存 待細胞長至80%~90%時，按細胞傳代方法把細胞收集起來，將配制好的凍存液加入細胞中重懸，每管2 mL，凍存液的配制方法是：胎牛血清與二甲基亞砜（DMSO）的比例為9∶1，依次放在4℃中40 min，-20℃中40 min，-80℃中過夜，第2 d轉移至液氮灌中保存。
3影響RAW264.7細胞培養的因素
3.1培養基酸堿度 根據對RAW264.7的培養研究發現酸堿度對于RAW264.7細胞的培養影響最大，GBICO的DMEM建議在配制過程中加入3.7 g NaHCO3，中科院上海細胞庫建議加1.5 g NaHCO3，然后用1MHCL調pH至7.2～7.4，過濾分裝置在4℃冰箱備用。但是在冰箱里放置3 d或1 w后培養基就很容易變紫，但是很多研究者并沒有在意這個問題，仍然用變紫的培養基繼續培養，之后細胞就會出現漂浮或者變成梭形。文獻提示可采用HEPES法進行緩沖[4]，我們研究發現雖然HEPES緩沖能力更強，培養基變堿的時間會延長，但放置時間久后仍然會變紫，通過比較可采用將HEPES配置成母液，過濾并分裝，然后每次傳代的時候用HEPES調節培養基，將培養基調至所需的pH。
3.2培養耗材 RAW264.7細胞是一類巨噬細胞，因此對于接觸細胞的培養耗材如：槍頭、培養皿等要求需要高一些，研究發現高溫180℃烘干的耗材比120℃高壓滅菌的耗材培養的細胞，細胞的形態更圓更亮，提示盡量減少抗原有助于RAW264.7細胞的培養，這與方瑤等研究發現相一致[5]。
4結論
RAW264.7細胞的培養和研究已然成為一個趨勢，對于RAW264.7細胞的培養也需要標準化的方法，本實驗研究發現RAW.264.7細胞的最佳優化條件即：DMEM高唐培養基+10%FBS，細胞刮棒沿著一個方向輕輕刮取細胞，傳代的比例最佳為1∶4，采用過濾的HEPES每次實驗時調節pH。細胞的培養本身就是一個復雜的過程，只有細胞處于最佳狀態時才能給科研工作者帶來更可靠的實驗結果，因此對于細胞的培養，我們更要花耐心和精力去呵護。
參考文獻：
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細胞培養范文4
【關鍵詞】高職院校；細胞培養技術；教學改革
一、細胞培養技術課程教學中存在的問題
（一）課程的教學目標與工作需求之間存在一定差距。高職教育應注重培養學生的實踐操作能力，因此在實際的教學過程中也要以此為目標進行教學。但在實際的教學過程中，盡管學校安排的實踐教學的課時不少，但卻并沒有取得良好的教學效果，其原因在于教學的過程過于形式化，并沒有把培養綜合動手能力這一具體教學目標滲透到實踐教學中，并且，在該課程考試中，也偏重于對理論知識的考核，輕視對職業技能的考核。教學目標并沒有完全納入整個課程的教學體系，不能有效滿足社會對人才的需求。
（二）課程的教學內容與實踐工作聯系不緊密。在課程的實踐教學內容中，普遍存在著設計性、綜合性實驗較少的問題，新的知識和技術不能有效的運用于實驗中，這就造成了學習內容與工作內容相脫離的現象。不利于學生日后的工作發展。
（三）課程的保障設施不足制約教學進一步深入。細胞培訓課程需要良好的配套設施來支撐整個教學計劃，然而，目前高職院校普遍存在著教學實踐設備不足、缺乏現代化生產模型的問題。并且，在校外實訓環節，由于缺乏與實際一線工廠的聯系和溝通，學生在實訓場合沒有太多的鍛煉機會，這些都制約著課程的推進和學生實踐能力的提升。
（四）課程的實踐教學環節管理不規范。高職院校對學生的實踐過程未能實現全程管理，缺乏對學生的實時指導，學生在實踐環節中主要依靠自覺性進行自我鍛煉。管理的不科學、不深入、不具體造成了很多學生在實習中敷衍了事，影響了整體的教學質量。
二、細胞培養技術實踐教學的設計理念
（一）細胞培養技術課程的具體定位。高職院校的細胞培養技術課程應立足于市場，深入探究當前農業、畜牧業、食品加工等行業的具體需求，依托自身的資源優勢，培養符合企業要求的具有高素質技能的人才。
（二）細胞培養技術課程的未來崗位技能需求。通過對高職院校學生就業情況、生物科技行業發展情況、企業崗位的需求情況的調研，市場上主流的關鍵技能為動物細胞培養技術、生物檢測技術、分離純化技術。專業的設置要充分滿足企業對專業技能的需求，只有這樣才能真正提高學生的職業技能。
（三）細胞培養技術課程的教學設計思路。搭建開放性和職業性的實踐平臺，充分體現專業內涵，著重培養學生的職業能力素養。實踐的內容要嚴格基于工作過程需求，并在此基礎上改變過去單一學校的教育模式，積極實施校企合作的教學理念，讓學生在學校期間就能切實體會到工作環境和氛圍，從而提升細胞培養技術的教學質量。
三、細胞培養技術課程的教學新體系的建立
（一）立足企業產品，設計教學活動。以疫苗為例，細胞培養技術的課程未來的就業方向其中很有分量的一份工作就是生產疫苗。目前，疫苗的生產主要依托于雞胚成纖維細胞進行。所以，在課程的實踐教學活動中要以雞胚成纖維細胞的培養為側重點，以具體的崗位要求為標準，設置相應的教學體系。
（二）以工作過程為導向，設計教學的具體任務。以企業雞胚成纖維細胞疫苗的生產為例，要結合具體的生產崗位需求，按照生產流程，把細胞培養技術課程分解為六個部分。分別為雞胚成纖維細胞培養準備工作、雞胚成纖維細胞的原代培養、雞胚成纖維細胞培養過程的檢測、雞胚成纖維細胞的傳代培養、雞胚成纖維細胞的病變培養、雞胚成纖維細胞的凍存與復蘇六項具體任務。通過細化培訓任務，把教學目標融入到實際的教學環節中，進一步培養學生嚴謹的科學態度，培養學生分析和解決問題的能力，鍛煉學生的創新意識和職業能力，為學生適應好日后的工作打下堅實的基礎。
（三）以教學做一體化為核心，設計教學模式。所謂教學做一體化是指重點培養學生的自主學習能力，以學生為主體，在教師的主導下，通過實踐活動鍛煉學生的創新意識和職業素養。在具體的教學實踐中，以行動為導向，以任務為驅動，拓寬實踐教學的渠道，從感知理解到學以致用，充分激發學生的學習熱情，營造和諧有序的學習氛圍。
四、細胞培養技術課程的教學體系的組織和落實
（一）校企合作共同開發課程的實踐內容和目標。改變傳統的教材編寫模式，采用校企合作的方式，以具體的工作流程為主線，以工作任務為載體，嚴格按照企業的崗位需求進行編寫實踐教學內容，使教學與工作不分離，使教學更有針對性。
（二）具體教學任務的開展。緊緊圍繞教學目標，把具體的工作任務細化為七個步驟，第一，教師講解工作任務和工作方式；第二，學生根據具體任務組建團隊，并策劃出具體工作方案；第三，將團隊工作方案進行匯報，經教師指導進一步完善實施方案；第四，在教師指導下，開展團隊工作；第五，團隊進行內部總結和交流；第六，班級內開展團隊間的交流與溝通；第七，以團隊為單位進行教學實踐活動總結。
（三）搭建開放式教學實踐平臺。開放式教學是產學研相結合人才培養模式，是指在時間、地點、內容、手段等方面全方位的向學生開發的教學模式。高職院校與企業合作，運用實際的企業項目進行教學實踐，由學生分組進行，采取教師帶隊、組長負責的原則，利用課余時間開展項目研究，并定期對項目進展做出報告，最終實現項目的成功研發。
五、細胞培養技術課程的教學評價體系
科學的教學評價體系不僅是對教學實踐的監控，更重要的是有利于激發學生的學習興趣，培養學生的職業素養、創新精神和團隊精神。根據細胞培養技術課程的自身特點，考核體系主要分為四個部分，即常規教學部分，開放實踐教學部分、專門考核部分和獎勵部分。結合技能評價、定量評價、校企合作評價等方式完善評價體系。
細胞培養技術課程的改革任重而道遠，需要學校、企業、學生三方的密切配合，不斷深化改革，切實實現教學做一體化，推動高職院校的細胞培養技術課程的教學培養質量，為社會輸送高素質的人才。
細胞培養范文5
羊水細胞培養是產前診斷的一個重要技術手段，主要應用于胎兒染色體疾病的產前診斷。由于羊水中存活細胞比較少、培養周期長、無菌要求和技術要求高，容易失敗，使羊水細胞培養在產前診斷的應用受到限制。針對以上情況，近年來我們吸取了國內外的一些先進經驗[1，2]，結合自身的條件，與相關科室進行合作，對羊水細胞培養技術進行改進，并對1 200例孕15～30周孕婦進行了羊水細胞培養的產前診斷，取得了理想效果。
對象與方法
1.對象：選取2003年7月至2005年12月在河南省新鄉市婦幼保健院接受產前羊水細胞培養檢查的孕婦共計1 200例，常規羊水細胞培養(常規組)和高效改良羊水細胞培養(改良組)均抽取600例。來診孕婦按1∶1的比例隨機分成2組。常規組年齡分布(28.8±3.6)歲，孕周分布孕15～24周，平均(20.2±2.8)周，改良組年齡分布(28.5±3.7)歲，孕周分布15～24周，平均(20.3±2.7)周，2組年齡、孕周比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本次高效改良羊水細胞培養科研項目經過新鄉市婦幼保健院醫學倫理委員會批準施行。
2.檢驗方法：對羊水細胞培養后在顯微鏡下進行觀察，檢查染色體情況，進行染色體異型性分析。根據分析結果統計檢驗量。(1)常規羊水細胞培養。取妊娠16～20周的羊水10～20 ml，注入10 ml離心管中，1 000 r/min心10 min，棄去上清液，留0.5～1.0 ml輕輕吹打成細胞懸液，移入25 ml培養瓶中，加入pH值為6.8的F10培養液3 ml和血清1 ml，置37 ℃溫箱中靜置培養5～6 d，見纖維或上皮樣細胞生長，以后每天或隔天觀察一次，一般培養8～14 d，細胞進入旺盛生長期[3]。(2)高效改良羊水細胞培養。穿刺抽取羊水25 ml，然后分別取10 ml注入2只20 ml試管中，高速離心(1 000 r/min)8 min，上清液棄去，每只試管中留4～5 ml制備成細胞混懸液。在培養皿中培養液4 ml，緩慢滴入細胞混懸液，恒溫(37.5 ℃)靜置。根據文獻報道，一般6～9 d細胞生長最為旺盛，可以收獲細胞。收獲前30 min，滴定秋水仙素終末濃度2 mg/L。收獲先后進行離心，低滲，固定和制片程序。標本經過老化后用胰酶染色并消化，然后在顯微鏡下觀察。我們于10倍目鏡和10倍物鏡下觀察。以梭長形羊水細胞為主要類型的生長細胞，形成的細胞克隆覆蓋1個或1個以上的完整視野;培養瓶中有2～3個以上細胞克隆，且每個細胞克隆中存在有20個以上的圓形、雙圓形或葡萄狀透亮細胞，細胞核大而圓，細胞圓而大，明亮如一片明珠，相互聯接，細胞克隆中央的細胞開始老化，克隆周邊細胞生長旺盛。
3.統計學處理：統計培養時間，鏡下觀察后，進行統計記錄，然后進行計數資料的χ2檢驗。
結果
1.2組培養時間比較：常規組的總體培養時間為9～14 d，平均(11.0±2.6) d;改良組的總體培養時間6～10 d，平均(7.5±2.3) d。改良組培養時間和常規組相比較明顯縮短，差異有統計學意義(P
2.成功率比較：改良組羊水細胞培養的成功率為95.8 %(575/600)，常規組成功率為37.7 %(226/600)，改良組羊水細胞培養的成功率明顯高于常規組，差異有統計學意義(χ2 =4.25，P
3.分裂相檢出率比較：改良組分裂相平均每例為(93.6±22.1)個，常規組分裂相為(53.2±19.9)個，改良組分裂相的檢出率明顯高于常規組，差異有統計學意義(χ2=4.95，P
4.異常檢出率比較：改良組發現異常核型12例，其中21-三體綜合征6例(50.0 %)，18-三體綜合征3例(25.0 %)，其他3例(25.0 %)，總陽性率為2.0 %(12/6 000)。常規組發現異常核型4例，其中21-三體綜合征2例(50.0 %)，18-三體綜合征2例(25.0 %)，其他2例(25.0 %)，總陽性率為0.7 %(4/6 000)。改良組異常核型檢出率高于常規組，但是2組檢出的異常核型的比例基本相同，都分別是21-三體綜合征50.0 %，18-三體綜合征25.0 %，其他25.0 %，差異有統計學意義 (χ2 =4.12，P
討論
羊水細胞培養法是1966年首先應用于臨床胎兒染色體疾病的產前診斷并獲得成功的[4]，此后廣泛應用并成為目前產前診斷的重要技術手段[5];然而其無菌要求、恒溫要求、培養接種和收獲技巧比較高，容易失敗。在此基礎上，我們結合臨床實際，對該方法進行了改良：(1)增加抽取羊水量;(2)2只試管離心;(3)細胞懸液量增加;(4)收獲前30 min，滴定秋水仙素終末濃度2 mg/L。收獲先后進行離心，低滲，固定和制片程序。標本經過老化后用胰酶染色并消化。經改良后提高了效率，并且在臨床應用中取得了良好的效果。
普通羊水細胞培養法和高效改良羊水細胞培養法都是比較安全可靠的產前診斷方法。高效改良羊水細胞培養法的培養時間可以縮短3～4 d，培養成功率遠遠高于普通羊水細胞培養法，而且分裂相，異常核型的發現比率等技術指標都高于普通羊水細胞培養法，具有較高的臨床應用價值，值得在臨床推廣應用。
參考文獻
1Lam Y H， Tang M H， Sin S Y， et al.Clinical significance of amniotic-fluid-cell culture failure[J]. Prenat Diagn，1998.18(4)：343-347.
2馬長俊，陳園茶，霍沛丹.羊水培養與染色體制片方法[J].生殖與避孕，1985，5:23.
3程在玉，主編.醫學遺傳學基礎與臨床[M].青島：青島出版社，1993.75.
細胞培養范文6
膠原是動物體內含量最豐富的蛋白質，屬于不溶性纖維蛋白質，遍布于體內各種器官和組織，如皮膚、骨、軟骨、肌腱、角膜等等。明膠（Gelatin. Gel），是膠原的部分變性衍生物，無抗原性，生物相容性好，可生物降解[7]。
甲殼素是一種天然高分子化合物，屬于多糖。殼聚糖（Chitosan, CS）, 是甲殼素的脫乙酰化產物，是細胞外基質中糖胺聚糖結構類似物。殼聚糖是一種具有優良生物相容性的可降解材料，其在哺乳動物體內能被溶菌酶降解成氨基糖，氨基糖可以進入糖胺聚糖和糖蛋白的代謝循環，也可以排除體外。它還具有低抗原性、促進傷口愈合，抗菌等特性。此外殼聚糖是帶正電荷的線性多糖，它可與帶負電的生物大分子，如明膠形成聚電解質配合物。殼聚糖還具有較好的力學性能，而且易于加工成型。綜合明膠和殼聚糖的優點，將殼聚糖和明膠復合制備多孔支架材料, 將能滿足對支架材料的要求[8-10]。
目前，氣管組織工程研究的方法是在體外的支架材料上培養氣道平滑肌細胞(airwaysmooth muscle cell, ASMC )，形成有功能的組織。本實驗研究在不同條件下制備殼聚糖-明膠三維支架的結構和性質，以及平滑肌細胞在支架中生長的狀態，為篩選可作為氣道組織工程研究用的材料奠定基礎。
2 材料和方法明
明 膠（ Sigma Chemical Co. ） ； 殼聚糖（HaiHui Bioengineering Co. ） ； 溶菌酶（7000u/mg,Biosharp,Japan）；戊二醛(分析純,成都科龍化工試劑)；醋酸（分析純，成都科龍化工試劑）；DMEM/F-12 培養基（Hyclone, USA）；胎牛血清(Sigma, USA)；培養用三蒸水；細胞培養瓶及培養板（Costar，USA）；MTT（Sigma, USA）；FITC-Phalloidin（Sigma,USA）。
2.1 制備三維殼聚糖-明膠支架 2.2 結構觀察
用掃描電子顯微鏡（SEM，TESCAN VEGA ?? LMU）對支架的架構進行觀察。在使用SEM 觀察支架之前，先用液氮冷凍支架的表面和部分使之斷裂,然后噴涂上金。支架孔的平均直徑作為支架的有效孔徑。隨機選擇每個樣品的三個不同區域，至少選擇20 個孔測量孔徑。
2.3 孔隙度的測量 支架浸入量筒后，原正己烷和支架的總體積記為（V2）。取出支架后，剩余的正己烷體積記為（V3）。支架的孔隙度ε 可以通過以下公式獲得：ε（%）=（V1－V3）／(V2－V3) [13]。
2.4 大鼠氣道平滑肌細胞的培養 2.5 細胞在殼聚糖-明膠三維支架中的增殖 2.6 免疫熒光染色
將細胞種植于三維支架材料上以后，選擇適當的時間，對細胞骨架進行染色。實驗步驟： 2.7 統計學方法
所有實驗都反復進行4 次，數據用平均值±標準方差表示，n=4。組間數據采用χ2 分析，p<0.01 表示差異有顯著統計學意義；p<0.05 表示差異有統計學意義。計算、統計軟件采用Originpro7.5 及ImageJ 1.4g program。
3 結果
3.1 預凍溫度和材料濃度對支架微結構的影響 比較不同的預凍溫度，最高的孔隙度為93±0.6 %，其預凍溫度為-196℃。而同樣的預凍溫度下，濃度為2wt%和3wt%的支架的孔隙度降為90±0.6%和84±4.7%（表1）。在-20℃、-80℃的預凍溫度下，孔隙度有著同樣的變化趨勢，而相比于-196℃的預凍溫度，孔隙度都降低了，顯示出孔隙度取決于材料的預凍溫度和濃度。
凍干過程是在冰點以下使材料中冰晶升華，形成與原冰晶同樣尺度的孔徑。在較低的預凍溫度下，由于冷凍速度較快，形成數量較多和體積細小的冰晶，導致凍干材料孔徑較小，孔壁較薄，孔隙度較大。在預凍溫度較高時，冰晶可以不斷生長，形成數量較少和體積較大的晶體，導致凍干材料孔徑較大，孔壁較厚，孔隙度較小 [19]。而溶液的濃度直接影響溶液的粘度。當溶液濃度較大即粘度較大時，不利于水和分子鏈的遷移，以至于形成的冰晶較小。
因此孔徑與溶液的濃度成反比[13]。
3.2 細胞在支架中的生長
通過掃描電鏡來觀察平滑肌細胞在材料上的生長。由圖2 可以看出，細胞接種到三維支架上以后，能貼附到支架上，在細胞數較少的情況下，細胞更趨向于沿著孔壁生長。多孔結構的優勢在于為細胞提供了足夠的生長空間和更大的附著面積, 同時有利于營養成分的進入和代謝產物的排出而不致引起細胞的生長抑制作用[20]。培養6 天的時間內，細胞在支架上黏附生長良好，但細胞并未完全伸展。同時細胞沒有鋪滿孔壁，還較少向孔中生長。
3.3 MTT 檢測細胞增殖
通過MTT 實驗來測試氣道平滑肌細胞在材料中的細胞活性。細胞在材料中的生長受到多種因素的影響，包括表面結構、理化性質等。把等量的細胞種植于支架中。由圖3 可見，隨著時間的增加OD 值也隨之增加，說明細胞在材料中生長良好。同時有圖3 可以看出，支架的微結構對細胞的增殖情況有一定的影響。實驗發現，隨著支架孔徑以及孔隙度的增大，時間的延長， 細胞的增殖情況良好。而且孔隙度對細胞增殖的影響較為顯著（*p<0.01,**p<0.05）, 說明支架的孔徑對細胞的增殖起著重要的作用，然而支架的孔隙度在細胞增殖過程中起著更為顯著和決定性作用。
3.4 免疫熒光染色
