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水解蛋白范文1
【關鍵詞】 嬰兒； 牛奶蛋白過敏性腹瀉； 深度水解蛋白配方奶粉； 治療
中圖分類號 R725.7 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2016）27-0113-02
Effect Study of Depth Hydrolyzed Protein Formula Applied in Baby with Milk Protein Allergy Diarrhea/ZOU Su-juan，LI Wen-bin.//Chinese and Foreign Medical Research，2016，14（27）：113-114
【Abstract】 Objective：To investigate the effect of depth hydrolyzed protein infant formula applied in baby with milk protein allergy diarrhea.Method：From January 2013 to September 2015，50 cases of baby milk protein allergy diarrhea patients in our hospital were selected as the research objects，their clinical data were retrospectively analyzed.According to the method of random numbers they were divided into two groups，all patients avoided milk food，the control group received free amino acid milk powder（new kt） treatment，the research group was given depth hydrolyzed protein infant formula（new peptide）.The effect was compared between the two groups.Result：The total effective rate of the research group was 100%，higher than 76.0% of the control group，the difference was statistically significant（P
【Key words】 Infant； Milk protein allergy diarrhea； Depth hydrolyzed protein formula； Treatment
First-author’s address：Children’s Hospital of Okanagan Valley Area Maternity and Child Care Center in Quanzhou City，Quanzhou 362000，China
doi：10.14033/ki.cfmr.2016.27.059
嬰兒牛奶蛋白過敏性腹瀉屬于嬰幼兒常見疾病，主要因其胃腸道屏障及免疫系統發育不全，直接接觸牛奶蛋白后引發的胃腸道過敏癥狀，以腹瀉、嘔吐、便血及腹脹等為主要臨床癥狀，嚴重情況下會引發過敏性休克或死亡等風險[1-4]。及時采取正確、有效的治療方案治療，對于改善患兒預后有著積極的意義。筆者所在醫院借鑒相關研究將深度水解蛋白配方奶粉應用在嬰兒牛奶蛋白過敏性腹瀉中，取得了比較良好的效果，現報道如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選擇2013年1月-2015年9月筆者所在醫院接診的嬰兒牛奶蛋白過敏性腹瀉患兒50例為研究對象。入選患兒均及時確診，符合牛奶蛋白過敏性腹瀉診斷標準，月齡2～6個月，主要為奶粉配方喂養，病程不超過2個月，且以大便稀水樣或不消化樣為主要癥狀，無黏液膿血，經大便鏡檢等顯示無異常，無其他并發癥[5]。按照隨機數字表法將其分為兩組，各25例，對照組：月齡2～6個月，平均（3.8±0.8）個月；男14例，女11例；病程2 d～2個月，平均（6.9±1.1）d。研究組：月齡2～6個月，平均（3.6±0.7）個月；男13例，女12例；病程1 d～2個月，平均（6.7±1.3）d。兩組一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
兩組患兒入院后確診符合牛奶過敏所致腹瀉，回避食物2～4周，尤其要回避牛奶食品，對照組予以游離氨基酸配方奶粉（紐康特），至少食用3～6個月或者食用至9～12個月齡。研究組停用普通奶粉，并予以深度水解蛋白配方奶粉（紐肽特）。其中患兒有母乳混合喂養，則將母乳喂養也一并停用，采取深度水解蛋白配方奶粉喂養時間為2周；2周后可嘗試加用普通奶粉喂養，劑量控制在1/4普通奶粉+3/4深度水解蛋白配方奶粉，然后對患兒的大便性狀進行觀察，2～3 d，若正常則繼續增加1/4普通奶粉（1/2普通奶粉+1/2深度水解蛋白配方奶粉），繼續觀察大便性狀，2～3 d；反之，若大便異常則改回100%深度水解蛋白配方奶粉喂養，直到有所正常后才改為前述增加方案，直到最終患兒過渡為100%普通喂養為止。若為純母乳喂養的患兒則停母乳，媽媽回避牛奶及牛奶制品2周，嬰兒服用深度水解蛋白配方奶粉，2周后繼續母乳喂養，若再次發生腹瀉，則停母乳，改為深度水解蛋白配方奶粉喂養3～6個月。
1.3 觀察指標
對兩組患兒臨床癥狀、腹瀉次數、大便性狀等進行觀察，總結臨床效果及隨訪半年復發率，并對比分析。
1.4 療效評價標準
本研究療效按照《腹瀉病療效判斷的補充意見》中相關評價標準執行，顯效：治療5 d后患兒全身癥狀徹底消失；糞便性狀與次數均恢復正常。有效：治療5 d后全身癥狀顯著緩解；糞便性狀與次數明顯好轉。無效：全身癥狀未改善，亦或者是病情惡化[6]。總有效率=有效率+顯效率。
1.5 統計學處理
將本次研究的相關數據錄入EXCEL表格中，數據均經統計學軟件SPSS 18.0進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，P
2 結果
2.1 兩組臨床效果比較
研究組治療后顯效19例、有效6例、無效0例，總有效率100%，對照組則分別為8、11、6例，總有效率為76.0%，兩組總有效率比較差異有統計學意義（P
2.2 兩組隨訪半年復發率比較
研究組隨訪半年無任何患兒復發，而對照組則有3例復發，復發率為12.0%。兩組復發率比較差異有統計學意義（P
3 討論
牛奶蛋白過敏屬于比較常見的嬰幼兒癥狀，近幾年國內一些研究中顯示0～3歲小兒發生牛奶蛋白過敏的概率約為0.83%～3.50%，高居食物過敏第二位。嬰幼兒作為食物過敏公共健康問題高危人群，發生牛奶蛋白過敏后表現形式多樣，且癥狀輕重不一，輕者有腹瀉、腹痛、便血、嘔吐等，而嚴重情況下則有休克、死亡等，嚴重威脅患兒的生長發育，需加強重視。牛奶中有多種可引發過敏的蛋白質，這些蛋白質可能屬于過敏原而引發患兒發病，尤其是過敏性腹瀉極為常見。嬰兒在消化道黏膜、免疫系統等方面發育不完善，極易受到致病過敏原的侵襲。結合本次研究與同類研究，可見其主要特點有：其一，本次研究接診的患兒月齡均未超過6個月，而且大多數患兒為多次添加不同品牌配方奶粉喂養后發生超敏反應，以皮膚過敏反應為主，進而出現腹瀉；其二，盡管一些患兒經血液變應原篩查后對牛奶蛋白未過敏，但其IgE不足100 IU/ml[7]。為此，在治療前應對患兒有無病史進行詳細詢問，并了解與掌握他們牛奶喂養后出現癥狀的時間。筆者所在醫院針對接診的50例牛奶蛋白過敏性腹瀉患兒進行回顧性分析，按照隨機數字法分為兩組，對照組回避食物+氨基酸配方奶粉治療，研究組用深度水解蛋白配方奶粉治療。兩組總有效率比較差異有統計學意義（P
胃腸道作為小兒出生后最早接觸食物蛋白的部位，也是蛋白過敏最早的器官之一，若發生牛奶蛋白過敏后，極易出現嘔吐、腹瀉、腹脹及便血等，進而有休克等，嚴重情況下導致患兒死亡。基于此，盡早發現相關癥狀，及時入院診斷十分關鍵。牛奶蛋白過敏性腹瀉診斷需詳細詢問患兒病史，同時可實施皮膚點刺試驗、牛奶蛋白特異性IgE、血清總IgE及激發試驗等處理[8]。但是這些方式各有優劣，比如牛奶蛋白特異性IgE檢測，雖然有很高的特異性，但其費用昂貴，一般醫院難以普及；部分患兒胃腸道牛奶蛋白過敏為非IgE介導，為此血清總IgE檢測陰性也無法否定其屬于非IgE介導過敏；皮膚點刺試驗盡管費用低廉，但會對患兒產生額外疼痛，結果也不確定?？傊壳吧袩o確切統一的有效診斷方案，為此大多數學者一致認為可采取綜合診斷處理。
嬰兒發生牛奶蛋白過敏性腹瀉后，應及時回避牛奶及含有牛奶蛋白的食品，在未應用特殊藥物治療前，應及時回避原有配方奶、輔食及母乳喂養等，可更換為氨基酸配方奶粉處理。當然，母乳喂養屬于解決這類過敏最為理想的方式，但是目前無法母乳喂養的小兒較多，或者一些進入轉奶期的小兒，無法一直予以母乳喂養，此時需根據小兒過敏性疾病風險選取合適的低敏配方奶粉處理，比如深度水解蛋白配方奶粉、純氨基酸配方奶粉等，盡管后者可完全回避過敏原，但其價格昂貴且口感不佳，無法逐步耐受，不能作為初級預防處理。深度水解蛋白配方奶粉經加熱、超濾及水解等程序加工處理而成，使得蛋白質成分抗原性明顯降低，加上其營養價值等同于普通奶粉，成為近幾年治療牛奶蛋白過敏性腹瀉最為理想的配方奶粉。通過本次研究及同類研究，證實嬰兒牛奶蛋白過敏性腹瀉采取深度水解蛋白配方奶粉治療，不僅能緩解癥狀，且能支持患兒的正常發育[9-10]。
綜上所述，深度水解蛋白配方奶粉治療嬰兒牛奶蛋白過敏性腹瀉可取得不錯效果，可有效改善患兒癥狀，預防疾病復發，值得借鑒。
參考文獻
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水解蛋白范文2
1.1 大豆蛋白的研究背景
近年來，隨著人們生活水平的提高，對膳食結構的要求也越來越高，而大豆的營養價值很高，是一種優質的高蛋白、高脂肪作物，含蛋白質40％-45％，每100g含蛋白質36-50g，生物學價值接近肉類。氨基酸組成也與動物蛋白質近似，并含有較多的賴氨酸，屬于完全蛋白質(完全蛋白質就是包含有人體所需的22種氨基酸，且比例適當的蛋白質，動物蛋白和豆類蛋白都屬完全蛋白），可以充足地提供人體所需的八種必需氨基酸以及多種維生素和礦物質等，并有降低人體血液中膽固醇含量的作用，因此被越來越多的人所認可。并且，其在食品加工領域也有廣泛的應用前景，可制成各種富有營養的食品，充分使人體最大限度地吸收大豆蛋白質以滿足恢復期病人、消化功能衰退的老年人、消化能力尚束成熟的嬰幼兒及急需體力補充的運動員及高血脂、高血壓等人群的營養要求[1]。
大豆蛋白資源豐富，原料成本低廉，具有乳化性、起泡性等功能特性。同時，大豆蛋白也有一些性質不能滿足人們的要求，從而影響它作為食物的可接受性，例如溶解性、脹氣因子、不良氣味等。因為大豆蛋白主要由7s和11s球蛋白組成，從而使得SPI的消化率和生物效價遠不及牛奶等動物蛋白質：一般動物蛋白質的消化率為90％-98％ ，而植物蛋白質的消化率為73％。但經過對大豆蛋白的酶法水解，將大分子大豆蛋白質水解成小分子多肽和氨基酸，可提高大豆蛋白的生物效價，易為人體吸收和消化。同時還可以提高溶解度，降低粘度，改善大豆蛋白的功能特性[2]。
1.2 固定化酶的研究背景
1.2.1 酶固定化的方法
酶的固定化是利用化學或物理手段將游離酶定位于限定的空間區域，并使其保持活性和可反復使用的一種技術[3]。
酶的固定方法有很多，主要有吸附法、包埋法、結合法、交聯法和熱處理法等。
吸附法：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。采用吸附法制備固定化酶或固定化菌體，操作簡單，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價易得，而且可反復使用，但由于靠物理吸附作用，結合力較弱，酶與載體結合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。
包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。包埋法制備固定化酶或固定化菌體時，根據載體材料和方法的不同，可以分為凝膠包埋法和半透膜包埋法兩大類。包埋法不需要化學修飾酶蛋白的氨基酸殘基，反應條件溫和，很少改變酶結構[4]，應用最為廣泛。包埋法對大多數酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細胞都適用，包埋材料主要有瓊脂、瓊脂糖、卡拉膠、明膠、海藻酸鈉、聚丙烯酰胺、纖維素等，其中海藻酸鈉具有無毒、安全、價格低廉、材料易得等特點，是食品酶工程中常用的包埋材料之一[5]。
結合法：選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定方法。根據結合的化學鍵不同，結合法可分為離子鍵結合法和共價鍵結合法。用離子鍵結合法固定，條件溫和，操作簡便。只需要在一定的pH值，溫度和離子強度等條件下。用共價鍵結合法制備的固定化酶，結合很牢固，酶不會脫落，可以連續使用較長時間。但載體活化的操作復雜，比較麻煩，同時由于共價結合時可能影響酶的空間構想而影響酶的催化活性。
交聯法：借助雙功能試劑使用酶分子之間交聯作用，制成網狀結構的固定化酶的方法。交聯法制備的固定化酶或固定化菌體結合牢固，可以長時間使用。但由于交聯反應條件較激烈，酶分子的多個基團被交聯，致使酶活力損失較大，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不方便。
熱處理法：將含酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定在菌體內，而制備得到的固定化菌體。交聯法制備的固定化酶或固定化菌體結合牢固，可以長時間使用。但由于交聯反應條件較激烈，酶分子的多個基團被交聯，致使酶活力損失較大，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不方便。
以上這5種常見的酶的固定方法各自有各自的優點和缺點，必要時可以結合其中的不同種方法進行固定以取長補短，可以制備出酶活性高、機械強度又好的固定化酶或固定化菌體[6]。
1.2.2 固定化酶的應用
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之出，具有顯著的優點。因此已廣泛地應用于食品、醫藥、環境等領域。
(1) 固定化酶在食品方面的應用
固定化酶得到最早和最廣泛應用的領域是食品工業，目前已有幾十種酶應用于食品工業。據2000 年的統計，國際上所生產的酶總產量有近40%應用于食品工業的生產。而且應用的酶劑還在不斷增加。食品工業中應用的酶法生產方式也由傳統的向現代化的方式轉變。而且，固定化酶和固定化細胞在食品領域的應用越來越廣泛 [7]。比如說，固定化酶在乳酸生產、果汁生產等食品工業方面都有一定的應用。
(2) 固定化酶在醫藥方面的應用
固定化酶在醫藥方面的應用已經越來越廣泛。固定化酶應用于醫學工業不僅僅限制于藥物合成上。如Odaci 等[8]將漆酶固定于生物傳感器的氧極制成酶電極，用于檢測藥物撲熱息痛(paracetamol)。Tang 等[9]基于固定anti-AFP酶制成了一種免疫測定系統，并分析了它的作用原理,并預期能在臨床上有廣泛的用。
(3) 固定化酶在環境方面的應用
廢水處理中，由于廢水組分復雜而且經常變化，利用單一的固定化酶，很難收到好的處理效果。因此，要用多種單一的固定化酶組合處理，才能使有機物完全無機化和穩定化。如德國將九種降解對硫磷農藥的酶共價組合固定在多孔玻璃珠、硅膠珠上，制成酶柱處理硫磷廢水獲得95%以上的處理效果，連續工作70天酶的活性沒有變化，說明多種酶的作用大于單一酶的作用[10]。
(4) 固定化酶應用的展望
毋庸置疑，固定化酶已經在多個方面都有了廣泛的應用，而且仍有很多尚在研究過程中。不過，有一點是可以明確地：隨著固定化技術的發展, 將會有更多的固定化酶應用于生產, 充分顯示出固定化技術的優越性, 開啟固定化技術的新局面。
1.3 固定化酶水解大豆蛋白的優勢
傳統工業從大豆中得到能被人體直接吸收的游離氨基酸是采用酸水解，但是在酸水解過程中常會產生對人體有害的致癌物——氯丙醇[11]。中性蛋白酶具有較高的蛋白水解能力，但是如果直接用游離酶進行水解，酶的穩定性差，酶只能使用一次，所得的產物難以分 離。而固定化酶可提高酶的穩定性，其熱穩定性、pH穩定性均顯著高于游離酶[12]，還有易于和產物分離、可反復多次使用等優點，因而受到越來越廣泛的重視和應用。目前世界各國都在不斷研究這一領域。
2.實驗部分
2.1 材料和準備工作
2.1.1 實驗材料與儀器設備
(1) 主要實驗材料
木瓜蛋白酶（BR）： 江蘇天錫天達酶制劑有限公司
無水氯化鈣（AR）： 衢州巨化試劑有限公司
海藻酸鈉（AR）： 中國醫藥上?；瘜W試劑公司
無水乙醇（AR）： 安徽安特生物化學有限公司
氫氧化鈉（AR）： 杭州蕭山試劑廠
甲醛（AR）： 衢州巨化試劑有限公司
草酸（AR）： 上海美興化工有限公司
其他試劑均為常規試劑
大豆： 市售
(2) 主要實驗設備
SW-CJ-1B型單人單面凈化工作臺： 蘇州凈化設備有限公司
XQ-LS-30SI型立式壓力蒸汽滅菌鍋： 上海博迅有限公司醫療設備廠
DHZ-DA型搖床： 太倉實驗設備廠
HZ-9210K型搖床： 太倉市科教器材廠華利達實驗設備公司
MJX-250B-Z型霉菌培養箱： 上海博迅有限公司醫療設備廠
雙層鐵皮電爐： 浙江嘉興市鳳橋電熱器廠
GO-5003B型攪拌機： 廣東省中山市哥爾電器有限公司
自制固定床裝置如圖1所示。
↑產物
大豆蛋白液→
圖1 自制固定床裝置圖
2.1.2 準備工作
(1) 大豆蛋白液制備
稱取一定量大豆加一定量溫水浸泡12h后在0.1Mpa高壓蒸汽滅菌鍋內煮熟10min，迅速降壓至常壓下取出，用豆漿機磨漿，過濾去渣， 調pH值到中性（pH=7.0），再用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，冷卻后放入4OC冰箱中備用。
(2) NaOH標準溶液的配制及標定
a. 快速稱取化學純固體氫氧化鈉約4g（因它易吸潮，不易稱準），先用燒杯將NaOH溶解，倒入容量瓶中加蒸餾水定容到1L。
b. 標定：用草酸標定
干凈的堿式滴定管用少量NaOH溶液洗三遍, 再將NaOH溶液裝入滴定管中,趕走橡皮管和尖嘴部分的氣泡,調整管內液面的位置恰好為“0.00”。
用洗凈且已用標準草酸溶液潤洗過三遍的移液管準確量取20.00mL標準草酸溶液，加入錐形瓶中,加入2-3滴酚酞指示劑,搖勻。
將NaOH溶液滴入錐形瓶中,邊滴邊搖動，開始時，滴定速度可快一點，當接近終點，粉紅色消失較慢時，開始逐滴加入堿液，每加入一滴都應搖勻,觀察紅色是否消失，決定是否再滴加，最后應控制加入半滴堿液,并用洗瓶沖洗錐瓶內壁,搖勻,30s內粉紅色不消失,即認為已達終點,記下滴定管液面的位置。
如此標定三次（求三次液量相差不超過0.05mL），取其平均值。按N1V1=2N2V2公式計算當量濃度。
2.2 實驗方法
2.2.1 酶的固定化方法
本實驗采用海藻酸鈉包埋法。
用天平準確稱取一定量的海藻酸鈉于100mL水中，再準確稱取10g CaCl2于200mL水中，放入立式壓力蒸汽滅菌鍋滅菌中滅菌（另量取一定體積的水放入其中一起滅菌以制備無菌水）。
先將儀器、玻璃器皿等在凈化工作臺中在紫外燈的照射下滅菌15min，再用天平準確稱取一定量的酶，在凈化工作臺將酶緩慢加入滅菌好的海藻酸鈉溶液中，一邊加一邊攪勻（因中性蛋白酶在海藻酸鈉溶液中極易結成顆粒狀，不攪勻會導致酶的分布不均勻，而且會引起后面用注射器制備海藻酸鈉凝膠珠過程中堵塞注射器）?；旌暇鶆蚝?，用注射器逐滴滴入滅菌好的5%（w/v）CaCl2溶液中進行凝膠化反應，于4oC冰箱中鈣化2-3h，制備成直徑約為3mm的海藻酸鈉凝膠珠，用無菌水洗滌3次以洗去附在表面的CaCl2溶液，即得球狀固定化顆粒。
圖2 用注射器滴入CaCl2中
圖3 包埋法固定化酶模式
2.2.2 自制固定床的安裝
取固定化酶填充至反應柱, 將一定量一定濃度的大豆蛋白溶液倒入1500mL三口燒瓶中，并置于恒溫水浴鍋保溫,然后用皮管將固定床、泵和三口燒瓶連成一個密封的循環，以恒流泵控制較緩和的系統流速, 循環反應。皮管中間連一段玻璃管，以便運行過程中觀察循環是否正常，而且留一個取樣口，平時用夾子夾住以維持無菌狀態。此固定床下口為進口，上口為出口，如圖1 所示。固定床在使用前要在凈化工作臺紫外線殺菌15min,裝固定化酶過程中，手及皮管要用75%的乙醇殺菌。
2.2.3 游離氨基酸的測定方法
游離氨基氮的測量用雙指示劑甲醛滴定法。
水溶液中的氨基酸為兼性離子，因而不能直接用堿滴定氨基酸的羧基。甲醛可與氨基酸上的—N+H3結合，使N+H3上的H+游離出來，與甲醛的反應：用過量的中性甲醛與氨基酸反應，可游離出氫離子，然后用NaOH滴定，從消耗的堿量可以計算出氨基氮的含量。
(1) 具體測量步驟
用10.00mL移液管精確吸取10.00mL樣品水解液放入250mL燒杯中用于氨基氮的測量，加入蒸餾水80.00mL及3滴1%酚酞指示劑，用標定好的NaOH標準溶液滴定至剛顯微紅色（與未滴定的一瓶對照），所耗用的NaOH標準溶液毫升數即總酸滴定數。然后吸取甲醛10.00mL加入其中，搖勻，馬上再用標定好的NaOH標準溶液滴定至粉紅色（顏色與第一次相比，紅色更深），記下加入甲醛后所耗的NaOH標準溶液毫升數（V），同時做空白實驗，用蒸餾水代替樣品液在同一條件下，作一空白滴定，記下所耗的NaOH標準溶液毫升數（V1）。
(2) 游離氨基氮計算：
氨基酸氮（g/100mL）=
式中V——加入甲醛后所耗用的已標定好的NaOH標準溶液毫升數
V1——空白滴定所耗用的已標定好的NaOH標準溶液毫升數
N——所用標定好的NaOH標準溶液的當量濃度
0.014——氮的毫克當量
10——吸取樣品水解液10.00mL
2.2.4 實驗流程
配海藻酸鈉、CaCl2溶液→滅菌→將酶加入海藻酸鈉中→酶的固定化
↓
大豆浸泡→大豆磨漿→調大豆蛋白液PH值→滅菌 →在無菌條件下放
入搖床(或者固定床)→每12小時測游離氨基值
3. 結果與討論
3.1 NaOH標準溶液的濃度
經過3次標定，得值：10.19，10.21，10.23，取平均值10.21代入CNaOHVNaOH=2C草酸V草酸計算得NaOH濃度：
CNaOH=0.098mol/L
3.2空白滴定的結果
經滴定得空白對照：V1=1.09mL
3.3 固定化酶與游離酶的性能比較
固定化酶和游離酶對大豆蛋白的水解效果有較大的差別。取底物濃度（大豆：水）為1：7，固定化時間為2.5h，酶濃度（酶量：海藻酸鈉溶液體積）為1%，海藻酸鈉濃度（w/v）為3%，進行對比實驗，實驗結果如圖4所示。
圖4 游離酶和固定化酶的活性比較
由圖4可看出：水解剛剛開始后，游離酶的水解效果要明顯好于固定化酶。因為酶固定化后，酶與底物的接觸受到了一定程度的阻礙，固定化酶與底物的接觸明顯沒有游離酶與底物的接觸充分。因此，游離酶在水解剛開始時得水解效果要好得多，并比固定化酶早12h到達峰值。
然而，游離酶與底物極難分離，如果要從中分離出游離酶則要付出較大的成本。
3.4 單因素實驗確定最佳固定化條件
3.4.1 海藻酸鈉濃度對酶固定化的影響
海藻酸鈉濃度不但影響到凝膠珠的機械強度，而且還影響著底物及產物的擴散，進而影響帶固定化酶的生物活性。當海藻酸鈉濃度為2.0%時，形成的凝膠珠的機械強度較弱，有明顯的拖尾現象，且凝珠脆弱，易破壁；當海藻酸鈉濃度為4.0%時，由于溶液粘度較高，固定化時不易成球。
取底物濃度（大豆：水）為1：7，固定化時間為2.5h，酶濃度（酶量：海藻酸鈉溶液體積）為1%，海藻酸鈉濃度（w/v）分別為2.0%、3.0%、4.0%，進行單因素實驗，實驗結果如表1和圖5所示。
表1 不同海藻酸鈉濃度對酶固定化效果的影響
海藻酸鈉濃度 凝膠珠強弱 凝膠珠形狀 使用時間 游離氨基峰值（g/100mL） 成球難易度
2.0% 較弱 偏圓形 10d 0.129 較難
3.0% 適中 圓形 25d 0.120 易
4.0% - 不成球 - - -
圖5 不同海藻酸鈉濃度下水解效果
從表1和圖5可知：海藻酸鈉濃度過低，雖然游離氨基的峰值，可以達到較高水平，但是其可使用時間稍短，不利于固定化酶的反復使用，如2%濃度下，游離氨基峰值要高于3%濃度，這可能是因為在酶促反應期間底物和產物易通過凝珠微孔，反應速度較快。但其可是使用時間太少；海藻酸鈉濃度過高，使用時間可以達到比較理想的狀態，但是與外界的能量和物質的傳遞都受到了不小的障礙，酶的活性受阻，其游離氨基的峰值并不理想；而且當海藻酸鈉濃度為4.0%時，由于溶液粘度較高，固定化時不易成球。當海藻酸鈉濃度為3.0%時，雖然游離氨基的峰值有少許的降低，但是其可利用時間可達25d，符合反復使用的特性，凝珠的機械強度適宜，反應速度也較快。
3.4.2 固定化時間對酶固定化的影響
海藻酸鈉的固定化過程是一個化學反應過程：CaCl2溶液中的Ca2+通過海藻酸鈉凝膠珠由外向內置換Na+而形成海藻酸鈣，而置換反應是需要一定時間的。不同固定化時間對大豆蛋白水解效果有所影響。取底物濃度（大豆：水）為1：7，酶濃度（酶量：海藻酸鈉溶液體積）為1%，海藻酸鈉濃度（w/v）為3.0%，固定化時間分別為2h、2.5h、3h，進行單因素實驗，實驗結果如表2和圖6所示。
表2 不同固定化時間下水解大豆蛋白的峰值
固定化時間 游離氨基峰值（g/100mL）
2h 0.107
2.5h 0.119
3h 0.088
圖6 不同固定化時間下水解效果
由表2和圖6可以看出，固定化時間較短時，固定化酶的活性較低；固定化時間2.5h時效果最好，游離氨基峰值可達0.119g/100mL；當固定化時間繼續增加，固定化酶的活性又降低，這主要是因為固定化時間較長，交聯程度高，高分子鏈結較致密，底物擴散阻力增加，固定化酶活性降低[13]。
3.4.3 固定化酶濃度對水解效果的影響
固定化酶量直接關系到固定化酶的活性。酶液濃度越高，反應所需時間越短，反應速度越快。取底物濃度（大豆：水）為1：7，固定化時間為2.5h，海藻酸鈉濃度（w/v）為3.0%，將酶濃度（固定化酶量：海藻酸鈉溶液體積）調整為0.5%，1%，1.5%進行固定化后，進行單因素實驗，測定固定化酶的活性，實驗結果如表3所示。
表3 不同酶量下水解大豆蛋白的峰值水解大豆蛋白的峰值
固定化酶濃度 游離氨基峰值（g/100mL）
0.5% 0.105
1% 0.123
1.5% 0.124
由表3可以看出，在其他條件不變時，隨著酶液量的增加，酶的活性有所提高。當酶液量與海藻酸鈉用量比從0.5%增加到1%時，固定化酶活性極顯著提高，之后酶液量與海藻酸鈉用量從1%增加到1.5%，固定化酶活性變化不大。而酶的價錢是比較昂貴的，因此酶液量與海藻酸鈉用量比為1%較為合適。
3.4.4 底物濃度對水解效果的影響
不同底物濃度對固定化酶水解大豆蛋白液效果有重要的影響。取固定化時間為2.5h，酶濃度（酶量：海藻酸鈉溶液濃度）為1%，海藻酸鈉濃度（w/v）為3%，改變最佳底物濃度（大豆：水）分別為1:5、1:6、1:7、1:8，進行單因素實驗，實驗結果如表4和圖7所示。
表4 不同底物濃度下水解大豆蛋白的峰值
大豆：水 游離氨基峰值（g/100mL）
1:5 0.098
1:6 0.100
1:7 0.129
1:8 0.121
圖7 不同大豆蛋白液濃度下水解效果
從表4和圖7可以看出，當大豆蛋白稀釋較小時，底物濃度過高，而固定化凝膠珠與底物接觸不良，很容易覆蓋固定化凝膠珠，從而影響水解效果［14］；而當大豆蛋白稀釋較大時，底物濃度過低，底物中含有大量的水，在不斷的使用中，固定化凝膠珠會吸水脹破，影響固定化酶的使用時間。由圖可知：大豆：水=1：7時水解效果最好。
3.5 固定化酶在固定床與搖床中的比較實驗
取最適固定化時間為2.5h，最適酶濃度（酶量：海藻酸鈉溶液體積）為1%，最適海藻酸鈉濃度（w/v）為3%，最佳底物濃度（大豆：水）為1:7，其比較實驗結果如表5和圖8所示。
3.5.1固定化酶在固定床與搖床中的性能比較
表5 固定化酶在固定床與搖床中對水解效果的影響
使用時間（d） 嗅覺 游離氨基峰值（g/100mL）
固定床 〉40 輕微異味 0.122
搖床 25 強烈異味
0.118
從表5中可知，固定化酶在搖床和固定床中對水解效果的影響有一定影響:對游離氨基峰值影響不大，但在使用時間和嗅覺方面有較大的差異。固定化酶在固定床中可以反復使用的時間大大高于在搖床中，這主要是因為搖床的不斷搖動使得固定化酶珠之間、酶珠與三角燒瓶壁之間不斷的發生摩擦，酶珠與大豆蛋白液之間的劇烈沖洗，從而使固定化酶在使用一段時間以后破裂，導致仍具剩余活性的酶不能實現再利用，減少了固定化酶重復使用次數，降低了酶活性的利用率。
而在嗅覺方面的差異，主要是由于染菌引起的，因反應時間較長，反應溫度為50 oC，比較適合一些菌種的生長。實驗過程中，固定床取樣是從事先設計好的取樣口取樣的，不易染菌；而從搖床中的錐形瓶中取樣測量時，雖然在凈化工作臺中進行，手與相關器皿也都用75%乙醇殺菌，但其染菌的概率仍然大大高于在固定床中。
3.5.2固定化酶在固定床與搖床中水解效果的比較
圖8 搖床和固定床 中水解效果
從圖8可以看出，在反應之初，固定化酶在搖床中的水解效果要略微好于在固定床中，這主要是因為在搖床中，底物與固定化酶之間的接觸要比在固定床中更充分。但隨著時間的推移，在搖床中的水解效果反而不如在固定床中。這主要是因為，在多次取樣測量游離氨基以后，搖床中染菌造成的。細菌消耗了一部份產物或者尚未被完全水解的蛋白質，從而降低了游離氨基的值。
3.6 實驗中注意點
(1) 滴定完畢后,尖嘴外不應留有液滴, 尖嘴內不應留有氣泡。
(2) 由于空氣中CO2影響，已達終點的溶液放久后仍會褪色，這并不說明中和反應沒有
完全，而是因為溶液中的NaOH與空氣中的CO2反應成中性的Na2CO3，從而使溶液成中性而褪色。
(3) 因本實驗過程需要3-4d，并且反應溫度為50OC，大豆蛋白液極易染菌變質，所以實驗中的各步驟都盡量應在凈化工作臺中進行，如取樣測值等操作。
(4) 本次實驗中取樣測值的次數較多，所以應盡量減少取樣對水解反應的影響，應采取的措施：減少取樣次數，或者以相同的比例增加反應所需的各溶液量。
4.總結與展望
4.1 總結
經過這段時間的實驗，我學到了很多知識與技能。通過查閱文獻，我鞏固了文獻檢索的方法，進一步學習了固定化酶的研究進展、應用、優點和水解蛋白的相關知識，還探索了固定床在固定化酶水解植物蛋白方面應用的可能性。而實驗中，我更將理論知識應用到實際中去，提高了動手能力：學會了海藻酸鈉固定化酶的具體操作步驟、水解植物蛋白的條件控制，并在導師的指導下，參與固定床的自制和安裝。
經過實驗，我得出：
(1) 固定化酶水解植物蛋白最佳參數：最佳底物濃度（大豆：水）為1：7；最適固定化時間為2.5h；最適酶濃度（酶量：海藻酸鈉溶液體積）為1%；最適海藻酸鈉濃度（w/v）為3%。
(2) 并在此最佳參數基礎上，進行在固定床與搖床條件下的對比實驗，得出：在固定床中，固定化酶使用次數和時間方面有很大的改善，從而使得酶的利用率更高；而且實現批量或連續操作模型的可能，更適于產業化、連續化、自動化生產。
由于客觀條件所限制和關于固定化酶在固定床中水解植物蛋白的研究寥寥無幾，本實驗尚有諸多不足之處，比如:蛋白水解液仍有染菌幾率，對實驗有些許影響；實驗中所用的自制固定床比較容易堵塞，且會發生泄漏現象，從而要經常檢查；因時間緊迫，酶的固定化條件除了本實驗所研究的4個參數外，還有pH、溫度等因素的影響沒有研究，而是經過查詢相關文獻取最佳參數的。
4.2 展望
展望未來，固定化技術作為一項新興技術有著不可限量的活力,引起了酶工業極大的變化。固定化酶作為第二代酶制劑正日益成為酶應用方面的主力軍?？梢灶A期,今后最引人注目的進展將會是優良菌株固定化技術和連續反應器的巧妙結合。 毫無疑問,這將在工業生產中將發揮越來越重要的作用。
致 謝
首先我要感謝我的導師王克明教授。本課題在選題及研究過程中得到王克明教授的悉心指導。王克明教授在百忙之中，仍對我們的實驗進行細心的指導，多次詢問研究進程，并為我指點迷津，幫助我開拓研究思路，精心點撥、熱忱鼓勵。王老師一絲不茍的作風，嚴謹求實的態度，踏踏實實的精神，不僅授我以文，而且教我做人，給予我終生受益之道。在此，學生謹向導師表示衷心的感謝！
其次，我要感謝生化學院的全體老師和學校，是你們讓我在大學的四年里，不但學到了知識，更學會了做人；是你們為我提供了良好的研究條件。
再次，我要感謝我的同學。在我迷茫時，你們鼓勵我；在我困難時，你們幫助我。并在實驗過程中不斷地對我伸出援助之手。
最后，我要衷心感謝審閱此文的各位老師。
程 慧
2007年6月17日
參考文獻
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水解蛋白范文3
1 材料和方法
1.1 材料和試劑
脫脂蠶蛹蛋白購自南通福爾生物制品有限公司，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶購自諾維信（中國）生物技術有限公司，其他試劑為國產分析純試劑。
1.2 方法
1.2.1 復合酶水解脫脂蠶蛹蛋白
準確稱取50g脫脂蠶蛹蛋白置于1000mL燒杯中，加入純水定容至500ml，攪拌均勻，水浴加熱至90℃維持10min使蛋白質變性，然后冷卻至55℃并維持，加入5%的復合蛋白酶自然pH值酶解10小時。
1.2.2 水解度的測定方法
蛋白水解度（DH）是指蛋白質水解過程中被裂解的肽鍵數與給定蛋白質的總肽鍵數之比[3]。蛋白質的肽鍵斷裂后α-氨基氮含量增加，因此可以根據水解過程中生成的α-氨基氮的含量來計算DH。使用甲醛滴定法測定水解后α-氨基氮的量，使用凱氏定氮法測定樣品的總氮量[4]，計算DH的公式如下：
1.2.3 響應面優化試驗
使用中心組合Central Composite Design （CCD）響應面試驗設計法[5]，對復合蛋白酶組成中的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶的配比進行優化。以堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶在復合酶組成中的百分比為考察因素，分別以A、B、C表示，則C=100%-A-B，因此以A和B為因素水平、DH為考察指標進行響應面試驗設計優化。采用Design-Expert（Version 8.05b）軟件對響應面試驗得到的數據進行分析。
2 結果與分析
2.1 響應面優化試驗
設定堿性蛋白酶A、中性蛋白酶B的因素水平見表1所示，采用CCD響應面設計法進行優化，試驗安排與結果如表2所示。
2.2 回歸方程與方差分析
由表3 回歸模型的方差分析中可以看出，通過Design-Expert軟件計算得到的多元回歸方程模型p值=0.0343顯著，而失擬項p值=0.9035不顯著，說明模型的擬合度較好，能夠反映試驗的具體水平結果。
2.3 響應因子水平優化
使用Design-Expert軟件做出回歸模型響應值與因素水平間的響應曲面和等高線圖，見圖1。
從圖1中可以看出，各因素水平對響應值的影響變化趨勢及因素水平之間交互作用。從圖中可以看出，兩個因素水平的響應值對應的曲面和等高線具有最優的響應區域。使用Design-Expert軟件進行嶺脊分析及回歸方程計算，可以得到最優的響應值相對應的因素水平為：堿性蛋白酶48.40%、中性蛋白酶32.09%，計算出風味蛋白酶為19.51%。使用該最優的復合酶配方，DH的最大預測值為38.4%。以此試驗得到的最優配方進行3次平行驗證試驗，得到的DH平均值為38.7%，與預測值吻合度較高，說明該響應面模型能夠較好的反映實際試驗情況，并能準確預測正常的試驗結果。
水解蛋白范文4
關鍵詞：全絲膠蠶品種 風味蛋白酶 抗氧化能力
自由基引發氧化作用，人體體外發生氧化，光和空氣容易產生活性氧化酶和促進酪氨酸活性化活性，使皮膚發皺、產生斑點、變黑老化、引發皮膚癌變的可能。人體皮膚體內發生氧化，由于活性氧化酶作用，會引起精神緊張、心累、苦痛、寒冷、感染等極其普遍的刺激，而產生身體機能的變化，與癌、動脈硬化、糖尿病等具有密切關系。人類的食品發生氧化，人體本身是產生活性氧化酶和促進酪氨酸活性化活性的良好環境，食品的氧化是酶的褐變和黑色素的積累過程，使食品變質，營養破壞，導致一系列的食品制造、安全保鮮、營養吸收等惡劣后果。各種自由基所引發的氧化作用，是導致身體中各組織和器官損傷、病變的重要原因之一。人的衰老、動脈硬化、心臟病、腫瘤、腎病、肝病、糖尿病、白內障等近百種疾病的發生和發展均與自由基所引發氧化有關。
諸多專家研究結果說明絲膠蛋白質本身不具有去除自由基的作用，而絲膠蛋白質水解物對去除羥基、超氧自由基的能力較強。但不同水解酶的短肽絲膠蛋白物的抗氧化能力不同，水解條件也較大程度影響抗氧化能力。本文對多種水解酶對全天然絲膠蛋白質的抗氧能力的結果進行比較，認為風味蛋白酶水解的全天然絲膠蛋白質抗氧化能力較強；對風味蛋白酶水解的條件進行了統計分析，認為風味蛋白酶濃度為0.1g／ml，反應溫度為50℃，水解時間為2h溶液，pH為中性，絲膠蛋白濃度為0.1g／ml，抗氧化能力最強。為食品、化妝品、醫藥功能及醫學生物材料等的研發提供良好的依據。
一 材料與方法
1 供試材料
1.1 供試品種蠶繭殼
全由安徽省農業科學院蠶桑研究所提供天然白絲膠品種“白S”。
1.2供試絲膠蛋白質
絲膠溶解、濃縮、干燥方法參照葉崇軍方法獲得
2 試驗方法
供試絲膠蛋白質天然白絲膠品種“白s”繭殼的溶解、濃縮、干燥，參照葉崇軍…方法獲得。
2.2清除羥自由基(?OH)能力測定方法
2.1不同蛋白酶水解絲膠蛋白抗氧化能力比較
設置在加酶量、底物濃度、反應溫度、反應時間、pH同等條件下，對風味蛋白酶、動物蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶水解液作為樣品溶液進行去除羥基自由基的比較實驗。酶的滅活條件為100℃水煮10min。
取0.562g絲膠蛋白溶于5.62ml蒸餾水，配成0.1g／ml的絲膠蛋白溶液；各取0.2g動物蛋白酶，木瓜蛋白酶，風味蛋白酶，堿性蛋白酶，中性蛋白酶溶于2ml蒸餾水中，調制PH為7.0。取1ml蛋白質溶液加入0.02ml酶液，調制pH值中性，50℃下反應2h。
用FeSO4+H2O2產生－OH，以－OH氧化水楊酸鈉所得產物的吸光值表示－OH的多少，吸光值越大，－OH越多。反應試管中加入0.5 m19 mmol／L FeSO4、0.5m19 mmol／1水楊酸－乙醇及0.5ml不同蛋白酶水解過的絲膠蛋白溶液，最后加入10mmol／1H202 5 ml啟動反應，37℃溫浴1h，于536nm處測吸光值。
清除率(％)=[A3-(A1－A2)]／A3×100
式中：A3為對照，不加樣品；
A1為某濃度時的吸光值；
A2為無顯色劑FeSO4時的該濃度的本底值。
2.2風味蛋白酶去除羥自由基(?OH)的條件優選
分別配制2mg／ml，4mg／ml，6mg／mL,8mg／ml，10mg／ml，12mg／ml,14mg／ml的絲膠蛋白溶液；配制1mg／ml的風味蛋白酶溶液。各取1.5ml不同濃度的絲膠蛋白溶液然后分別加入0.03ml，0.06ml，0.09ml，0.12ml，0.15ml，0.18ml，0.21ml的1mg／ml的風味酶液反應時間分別設置為1、2、3h。按照正交方案實驗。
清除超氧自由基(?02－)能力
采用鄰苯三酚自氧化法進行測定。取0.05mol／ITris－HCI緩沖液(Ph8.2)4ml，置于25℃水浴中預熱20min，分別加入經過風味蛋白酶水解過的不同濃度的待測液2ml和25mmol／1鄰苯三酚溶液1ml，混勻后于25℃水浴中反應5min，加入8％的HC10.1ml終止反應，在320nm處測吸光度(A)，以1ml蒸餾水作空白代替待測液作空白試驗。
清除率(％)=[A3－(A1－A2)]／A3×100
式中：A1－某濃度提取液的吸光值；
A2-不加入鄰苯三酚無顯色時的吸光值；
A3-不加絲膠蛋白短肽的吸光值。
二 結果與分析
2.1不同蛋白酶水解絲膠蛋白抗氧化能力比較
不同的酶水解絲膠蛋白后所產生的短肽抗氧化能力不同，本實驗采用單因素實驗，在反應時間均為2h的條件下調查了不同的酶水解絲膠蛋白后清除?OH的能力，結果如圖1所示。由表可以看出，風味蛋白酶水解絲膠蛋白后其清除OH的能力最強。
2.2風味蛋白酶水解的絲膠蛋白清除-OH的條件的優化
影響風味蛋白酶水解絲膠蛋白程度的因素主要有風味酶與蛋白的濃度比以及水解時間，本實驗通過正交
試驗分析了風味蛋白酶濃度、絲膠蛋白質濃度和水解時間的對?OH清除的最佳條件。
F0.05(2，4)=6.94，F0.01(2，4)=18.00
各因素的F值，A高度顯著，B顯著，即酶和蛋白濃度對實驗結果影響高度顯著，反應時間對實驗結果影響顯著。根據K值選擇最佳濃度比(酶：蛋白)為1：100，最佳反應時間為2h。
2.3風味蛋白酶水解“白s”絲膠蛋白質清除的羥基自由基(?OH)能力
圖2表明在風味蛋白質濃度為0.1g／ml條件下，不同濃度的絲膠樣品均有一定的清除羥基自由基(?OH)能力，隨著絲膠蛋白濃度的增加，其清除羥基自由基(?OH)能力逐漸增大，濃度為10mg／ml時清除能力最大，達到40.5％。當濃度大干10mg／m1時其對羥自由基的清除率開始降低。
2.味蛋白酶水解“白s”絲膠蛋白質清除超氧自由基(?02－)能力
圖3表明，不同濃度的絲膠樣品均具有一定的清除?O2－能力，其清除能力均隨樣品濃度的增大而增強，呈現一定的量效關系。當絲膠濃度達到10mg／ml時，清除能力達到31.08％。
三 結論
3.1風味蛋白酶通過內切方式切斷多肽內部的肽鍵，形成短鏈肽，其中一些含有疏水氨基酸，使用外切酶每一次從多肽鏈的末端切斷釋放一個氨基酸，從而長鏈蛋白質水解為氨基酸。本文比較多種蛋白酶相對抗氧化活力，以水解物中風味蛋白酶水解物的相對抗氧化活力最大，與多篇論文的結論一致，說明風味蛋白酶不僅對植物蛋白水解物抗氧化性強，對動物蛋白水解也具有同樣的作用。
水解蛋白范文5
【關鍵詞】腦蛋白水解物不良反應
【中圖分類號】R472.2【文獻標示碼】B【文章編號】1007-8517(2008)12（B）-0032-01
2008年9月，我們治療1例注射用腦蛋白水解物致不良反應患者，經精心護理，效果滿意。報告如下。
1病例資料
患者男，63歲。因腦出血入院，于9月20日在全麻下行右側去骨瓣減壓腦內血腫清除術，術后入我科。9月24日神志轉清，雙瞳孔等大等圓，直徑2毫米，光反應靈敏，雙肺呼吸音清，言語清晰。右側肢體活動好，肌力六級，左側肢體無自主活動，肌力一級?；颊咭郧盁o藥物過敏史。9月29日早晨七點測體溫36.5攝氏度，脈搏98次/分，呼吸18次/分，血壓120/80mmHg。下午一點十分開始靜脈注射腦蛋白水解物60mg入生理鹽水500ml液，滴速40滴/min，在滴入約50ml時，突發寒戰，心悸，呼吸急促，訴胸悶.憋氣，后言語不清。呼吸42次/分，測血壓140/90mmHg，心率150次/min，全身皮膚未見紅斑皮疹?？紤]為注射腦蛋白水解物后不良反應，立即停止輸入。給予氟美松10mg靜推，10%葡萄糖酸鈣10ml靜推。測體溫39.3℃，給予安通定2ml肌注。30分鐘后患者胸悶.心悸癥狀消失，寒戰停止，測體溫38.4℃，血壓130/80mmHg，呼吸18次/min，心率110次/min。未再輸入腦蛋白水解物。
水解蛋白范文6
【關鍵詞】 水通道蛋白1 鼻息肉 免疫組織化學
［ABSTRACT］ Objective: To explore the expression and distribution of aquaporin1(AQP1) in the formation and development of nasal polyps. Methods: Thirty cases of normal inferior turbinates and sixty cases of nasal polyps were enrolled in this study. In the nasal polyp group， there were 10 cases of type II phase 1， 15 cases of type II phase 2， 25 cases of type II phase 3， and 10 cases of type III. Expression of AQP1 in both groups was determined by the Elivision plus immunohistochemistry technique. Results: (1) Positive AQP1 cells in the epithelial cell layer of nasal polyps were significantly fewer than those of the inferior turbinate (P＜0.01) and positive AQP1 cells of nasal polyps of the type Ⅱ phase 1 were significantly more than those of the type Ⅲ or type Ⅱ phase 3 (P＜0.01). (2) Positive AQP1 cells in both the vessel endothelium and the glandular epithelium from the type Ⅲ， type Ⅱ phase 3 of nasal polyps were significantly more than those from the type Ⅱ phase 1 nasal polyps and the inferior turbinate (P＜0.01). Conclusion: AQP1 might play an important role in the formation and development of nasal polyps. Exploration of the regulation of AQP1 contributes toward evaluating the pathogenesis of nasal polyps.
［KEY WORDS］ Aquaporin1; Nasal polyps; Immunohistochemisty
鼻息肉是耳鼻喉科常見病，發病率較高，復發性強［1］。臨床上最常見的病理類型是水腫型(約占總數的85% 90%)，其具體發生機制尚不明確［2］。現認為鼻息肉的發病是多因素、多步驟的過程，涉及眾多復雜的病理機制。
AQP1是上世紀80年代末由Agre發現的第一個水通道，被稱為原型水通道。AQP1在人體內分布廣泛，存在于不同的組織器官中，如與液體被吸收和分泌有關的腎小管、髓袢降支薄壁段、脈絡膜叢、唾液腺上皮、支氣管、肺泡上皮、毛細血管內皮等。在淋巴管和黏膜下毛細血管中的AQP1能促進吸收的水迅速進入淋巴管和毛細血管床。可見AQP1參與人體內多種生理功能調節，AQP1表達和功能異常與某些疾病的分泌增多及水腫密切相關［3］。
1 材料與方法
1.1 臨床資料 本組標本取自2004至2005年北京大學深圳醫院及北京大學第三醫院住院行鼻內鏡手術的慢性鼻竇炎鼻息肉患者90例，隨機分組：①鼻息肉組60例，其中男33例，女27例，17 52歲，平均35歲，其中Ⅱ型Ⅰ期10例，Ⅱ型2期15例，Ⅱ型3期25例，Ⅲ型10例；②對照組：同一時期接受鼻中隔矯正術的患者，取下鼻甲黏膜共30例，其中男20例，女10例，18 36歲，平均31歲。
排除標準：1個月前全身或鼻腔局部使用過激素、抗組胺以及抗生素藥物；合并有變應性鼻炎、支氣管哮喘或合并有嚴重全身疾病者。
1.2 實驗方法
1.2.1 免疫組化染色材料 AQP1蛋白單克隆抗體，鼠抗人單克隆抗體為美國Santa Cruz公司產。Elivision Plus試劑盒為福州邁新公司產。
1.2.2 方法 標本經10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，連續切片，5?μm厚，HE染色和Elivision Plus二步法免疫組化染色。脫蠟、入水，3%甲醇過氧化氫液室溫處理切片，微波修復抗原，滴加一抗AQP1單克隆抗體（1∶200）于切片上，4?℃過夜，嚴格按照Elivision Plus二步法免疫組化染色操作，DNB顯色，蘇木精復染，脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。每批均以已知人腎曲小管陽性切片為陽性對照，用PBS液代替一抗同步染色作為陰性對照。
1.3 結果判斷 采用雙盲法，每張切片由兩位病理醫生分別判定計數，兩人計數相差10%以上重新計數。AQP1蛋白定位于細胞漿內，棕黃色或棕紅色顆粒為陽性細胞。每張切片在×200倍鏡下隨機選擇5個視野，計數鼻息肉中的陽性細胞，取其平均數作為陽性細胞表達數（±s）。
1.4 統計學處理 應用SPSS10.0軟件包，兩組均數比較用t檢驗，多組均數比較用方差分析。
2 結 果
2.1 病理結果 陰性對照均不著色，陽性對照片中見人腎曲小管胞漿呈明顯棕黃色。下鼻甲黏膜AQP1陽性表達主要位于黏膜上皮細胞和黏膜固有層腺體。在毛細血管內皮及血竇內皮表達較弱。在鼻息肉組織中AQP1蛋白多位于上皮下腺體及毛細血管、血竇內皮細胞胞漿中，染色較強，而在上皮細胞中則呈弱陽性表達或陰性表達（圖1 5）。根據Kakoi分型［5］：水腫型占89%，腺囊泡型占8%，纖維型占3%。
鼻息肉Ⅲ型，黏膜上皮細胞中AQP1蛋白多陰性表達，黏膜下部分嗜酸性粒細胞AQP1表達陽性（×400）
鼻息肉Ⅲ型，AQP1蛋白在較多血管內皮細胞中呈陽性表達（×200）鼻息肉Ⅱ型3期，AQP1蛋白在較多腺樣細胞中呈陽性表達（×200）
鼻息肉Ⅱ型1期，AQP1蛋白在上皮層呈陽性表達，血管腺體多呈弱陽性表達（×200）
2.2 AQP1蛋白在鼻息肉與下鼻甲黏膜中的分布 AQP1蛋白在鼻息肉與下鼻甲黏膜的表達見表1。鼻息肉組織和下鼻甲黏膜中AQP1蛋白在黏膜上皮、血管內皮以及腺體表達的陽性細胞數差異有統計學意義。
2.3 AQP1蛋白在鼻息肉不同組織類型中的表達 見表2。 水腫型鼻息肉中AQP1蛋白在血管內皮及腺體中的陽性細胞數明顯高于腺囊泡型及纖維型鼻息肉， 差異有統計學意義。
2.4 AQP1蛋白在鼻息肉不同臨床分型分期的表達 見表3。由表3可見，鼻息肉臨床分型分期中AQP1蛋白在Ⅱ型1期血管內皮陽性細胞數明顯少于Ⅱ型3期及Ⅲ型的陽性細胞數，差異有統計學意義(P＜0.01)。Ⅱ型1期腺體的陽性細胞數明顯少于Ⅱ型3期，差異有統計學意義(P＜0.01)。但同Ⅲ型的陽性細胞數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。Ⅱ型1期上皮中的陽性細胞數分別大于Ⅱ型3期及Ⅲ型，差異有統計學意義(P＜0.01)。
3 討 論
鼻息肉是一種以鼻腔局部黏膜腫脹為特征的良性病變組織，以往多認為鼻息肉的水腫是肥大細胞釋放的組胺介質的作用所致［6］; 也有學者認為是鼻黏膜血管通透性增加導致了鼻息肉組織水腫［7］。鼻息肉作為一種獨特的炎性水腫組織，其水腫的形成可能存在多種機制［8］。
目前在人類和哺乳動物身上共發現水通道蛋白有10個亞型，（AQP0、AQP19）分布于多個組織器官，其基本功能是介導自由水分子的跨生物膜轉運，活化能較低（Ea＜5?kcal·mol/L），速度快，不受質膜分子組成、溫度等的影響，只要存在滲透壓梯度或流體靜力壓不同，就可以有水分子順梯度通過水通道蛋白［9，10］。因而它對水轉運的調節作用也愈來愈受到人們的關注。
AQP1是第一個被鑒定的水通道蛋白，基因定位于7P14，其基本結構是一個單肽鏈，含有6個跨膜區域和5個環，其中B、E環含有天冬酰氨一脯氨酸一丙氨酸（AsnProAla NPA）重復關聯序列，顯著疏水。AQP1的高級結構為一個四聚體，其以4個單體聚合，每個單體允許自由水通過，每個單體單獨施行功能。這種轉運也受水通道蛋白表達水平的顯著影響，因此水通道蛋白的表達必然與機體的生理病理狀態有密切關系［11，12］。
我們的研究表明，在正常下鼻甲組織中AQP1的陽性表達主要位于黏膜上皮細胞和黏膜固有層的腺體、粘液腺細胞胞漿中，在毛細血管內皮及血竇內皮表達較弱。鼻息肉組織中強染色多位于上皮下腺體及毛細血管、血竇內皮細胞。AQP1蛋白在鼻息肉和下鼻甲黏膜組織的表達差異有統計學意義（P＜0.01)。表明在鼻息肉組織中存在AQP1蛋白的異常表達。從蛋白質水平證明了AQP1基因的異常與鼻息肉的發生密切相關。近年的研究也發現，水通道蛋白的亞型在鼻息肉組織也有分布［13］，提示水通道蛋白可能在鼻息肉中廣泛分布。與本研究相類似，Verkman等［9］發現，小鼠肺毛細血管內皮細胞或肺泡上皮缺乏AQP1時，肺泡毛細血管間水的滲透下降90%，Chanranhan等［14］也認為，AQP1參與了呼吸道黏膜下腺的液體分泌，可見AQP1蛋白的異常表達對水的轉運有重要影響。
AQP1在鼻息肉腺體和血管內皮細胞的過表達可能與鼻息肉形成有關。本組資料顯示，鼻息肉中水腫型AQP1蛋白在血管內皮及腺體表達的陽性細胞數顯著高于腺囊泡型及纖維型（P＜0.01）。提示在不同組織類型鼻息肉的發生過程中，組織水腫愈明顯，則AQP1蛋白表達陽性數越高，一定程度上反映了AQP1的基因失調與水腫型鼻息肉的產生有關。
我們在鼻息肉早期病變過程中發現，黏膜上皮多為假復層柱狀上皮，隨著病變加重，出現上皮排列紊亂，部分被復層鱗狀上皮及無纖毛的扁平上皮取代，腺體增生分泌亢進，血管增生擴張。實驗發現鼻息肉Ⅱ型3期和Ⅲ型中AQP1蛋白在血管內皮陽性細胞顯著多于Ⅱ型1期的鼻息肉組織（P＜0.01），Ⅱ型3期腺體樣細胞中陽性細胞顯著多于Ⅱ型1期（P＜0.01），說明隨著病變程度的進展，AQP1蛋白表達增加。同時也發現在黏膜上皮中隨著病變的進展，AQP1表達出現下降趨勢。因而推測早期AQP1蛋白在息肉黏膜上皮中的較多表達可能是細胞對所接受的內外致病因子的反應，使AQP1基因合成加速，促使AQP1蛋白高表達，加快水的跨膜轉運，以盡量維持組織內外的水轉運平衡，減少細胞損傷。隨著致病因子繼續作用，當上皮細胞數量損失到一定程度，同時隨著異常增殖腺體和血管內皮細胞上AQP1蛋白的過表達，使上皮殘留的AQP1無法承擔超負荷水轉運，使得組織間液大量積聚，息肉的逆轉能力下降。而Ⅲ型腺體樣細胞中AQP1蛋白的表達同Ⅱ型1期中沒有顯著性差異，可能是由于Ⅲ型患者由于多次手術，導致腺體破壞，構筑數目減少有關。故對AQP1蛋白動態觀察可預測鼻息肉的發展趨勢和程度。
AQP1在鼻息肉的發生過程中可能并非孤立地發揮作用，它有可能與Na+K+ATP酶協同，通過促進跨上皮離子的轉運，形成滲透梯度，產生對滲透水轉運的驅動力［15］。通過研制水通道蛋白抑制因子來抑制功能亢進及表達過多的水通道蛋白，或通過控制水通道蛋白來平衡液體的分泌和吸收，可能為鼻息肉治療及防止術后復發提供一種新的治療思路和手段。
【參考文獻】
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