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中醫醫生事跡材料范文1
[關鍵詞]異種材料；生物相容性
[中圖分類號]R318.08Q813[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）05-0787-04
Experimental studies on biocompatibility of xenogenic tendon matrix materials in vitro
CHEN Yuan-Liang1,JIANG Ping1,XIA Xue-ying1,CHEN Wei1,ZHANG Wei2
(1.Department of Plastic Surgery,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,Guangdong,China;2.National Engineering Laboratory for Regenerative Implantable Medical Devices,Guangzhou 510663,Guangdong,China)
Abstract:ObjectiveTo evaluate the biocompatibility of novel manufactured xenogenic tendon matrix materials and to provide basis for further experimental study and clinical application.MethodsAccording to the standard for the biological evaluation of the medical devices,the acute toxicity test,sensitization test,skin stimulating test,cellular toxicity test,and genotoxicity test were carried out to evaluate the biocompatibility of the prepared implants.ResultsNo animal died and no toxicity symptom or adverse effects were shown within 72 hours. No obvious sensitivity were observed.Skin stimulating reactions were not found in the experimental groups and negative control group by intradermal stimulation test. The toxicity of materials leaching liquor was graded from 0 to 1,which means the material has no cytotoxicity.Ames test,chromosome aberration test,and micronucleus test of bone marrow cells in mice were negative and lacked toxicity.ConclusionThe new xenogenic tendon matrix material has good biocompatibility,and it may be served as a promising implant material.
Key words:xenogeneic material;biocompatibility
臨床上因各種原因所造成的軟組織缺損的修復是整形修復外科面對的主要問題，而材料充填是畸形缺損修復的重要手段之一。目前臨床常用的材料如固體硅橡膠、膨體聚四氟乙烯都不同程度存在一些問題而不能完全滿足臨床治療的要求。來源于動物組織的天然生物材料，其結構與人體組織相似，是制造人工組織、器官的理想材料之一。前期我們以動物(豬)肌腱為原料，應用組織固定、去抗原等系列專利技術，研制出了異種肌腱基質材料，并對其理化性能進行了初步檢測，證實該材料具有良好的理化性能[1]。在此基礎上，我們擬通過體外試驗評價該材料的生物相容性，研究評價其作為組織修復材料的生物安全性。以期獲得理想的組織填充物，為今后的研究及臨床應用提供依據，現報道如下。
1材料和方法
1.1 試驗動物、主要試劑及材料：健康6周齡昆明小鼠 60 只，雌雄不限，體重18～22g；成年新西蘭白兔3 只，雌雄不限，體重2.5～3.0kg；白化豚鼠30只, 雌雄不限，體重300～500g。以上實驗動物均由南方醫科大學實驗動物中心提供。四甲基偶氮唑鹽（MTT）及二甲基亞砜( DMSO)（上海碧云天公司）,小鼠成纖維細胞( NCTC L929，中山大學醫學院細胞庫)，DMEM( Hyclone公司，美國)，小牛血清( Gibco公司，美國)。鼠傷寒沙門氏菌TA 97、TA 98、TA 100 及TA 102,中國倉鼠肺成纖維細胞，絲裂霉素-C、秋水仙素、環磷酰胺（中國藥品生物制品檢定所）。
異種肌腱基質材料由再生型醫用植入器械國家工程實驗室研制并提供，取新鮮豬肌腱，進行以下脫細胞處理: ①應用高反應活性環氧化物作動物組織的交聯固定劑,進行膠原交聯固定；②應用化學方法,封閉免疫基團和特殊位置的基團,改變膠原、多肽的特異構象；③應用復合酶(胰蛋白酶等)、表面活性劑(曲拉通等)化學方法脫細胞。經上述處理后的材料經裁剪后鈷60 照射滅菌，備用。
1.2 材料浸提液的制備：使用極性溶劑生理鹽水作為浸提介質。將鈷60照射滅菌的材料按樣品質量與浸提液體積比為 0.2g/cm2，使材料全部浸入其中，在 37℃ 無菌條件下浸提 72h 作為材料的浸提液。
1.3 急性全身毒性試驗：昆明種小鼠10只，隨機分為2組，每組5只，雌雄分籠喂養，各組小鼠標記編號，稱重并記錄。每只小鼠從腹腔內按50ml/kg 劑量，實驗組注射材料浸提液，對照組注射生理鹽水。注射后1、2、3、7天 觀察各組小鼠的一般狀態、毒性表現及死亡動物數。7 天后處死小鼠，觀察小鼠腹腔有無粘連，各組取兩只動物肝、腎、脾行組織學檢查，記錄注射部位出現的其他異常情況。
1.4 致敏試驗：健康初成年的白化豚鼠30只, 雌雄不限，體重 300～500g。采用最大劑量法。先用材料浸出液 0.1 ml 進行注射誘導, 注射區用上述實驗液貼附,然后進行激發。陽性對照采用5% 甲醛溶液, 用生理鹽水作為陰性對照。
1.5 皮內刺激實驗：取新西蘭白兔3只，每只動物脊柱左側5個點注射生理鹽水各0.2 ml作為空白對照，每點間隔0.2cm，右側5個點注射材料浸提液各0.2ml，注射后24、48和72 h觀察記錄各注射部位狀況。按皮膚反應評分系統對每個注射部位的紅斑和水腫組織反應進行評分，計算局部原發刺激指數（primarily stimulation index，PII）。
1.6 體外急性細胞毒性試驗
1.6.1培養基浸提液制備：浸提介質為含10% 小牛血清的DMEM 細胞培養液，然后按樣品質量與浸提液體積比為 0.2g/cm2，在37℃無菌條件下浸提72h作為材料浸提液。
1.6.2 細胞培養及分組：采用96孔培養板,各組均加入 5×103/ml L929 小鼠成纖維細胞懸液 200μl,37℃、5% CO2 培養箱孵育,待細胞貼壁后，分別按照以下分組定期更換培養液(100μl/次) :①陰性對照組( n=8),正常培養液；②實驗組 (n=8)，10% FBS+DMEM 與材料浸提原液各 50% ；③陽性對照組(n=8)，含0.64%苯酚的10% FBS+DMEM；每組材料8個平行樣，置于37℃、5%CO2培養箱中培養72h。
1.6.3MTT 法檢測細胞活性：分別于培養 24h、48h 和 72h 取 出 1 個 96 孔 板，按照 20μl/孔、加入 5 mg/ml MTT,37 ℃、5%CO2下培養 4 h； 吸出培養液, 再加入DMSO( 150 μl/孔),室溫下振蕩至結晶物溶解,在酶標檢測儀上( BIO-RAD Mode 680,波長為 570nm) 測定吸光度( OD 值),計算細胞增殖率(RGR)=(實驗組 OD 值/陰性對照 OD 值)×100%。細胞毒性判斷標準[1]：0 級為≥100%，1 級為75%～99%，2級為50%～74%，3 級為25%～49%，4級為1%～24%，5 級為0。
1.7 遺傳毒性試驗
1.7.1 Ames試驗：所用菌株為組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA 97、TA 98、TA 100 及TA 102, 采用標準平板滲入法, 在加和不加代謝活化系統(S9) 條件下進行材料浸出液按3 cm2/ml 雙面表面積之和的比例用生理鹽水配置。70℃條件下, 持續24 h, 過濾后備用。樣品的5 種濃度各作 3 個平行樣,計數各皿菌落數。生理鹽水注射液為陰性對照。陽性對照采用9-氨基吖啶、疊氮鈉、2, 7-二氨基芴、2-二氯基芴。
1.7.2 染色體畸變試驗：細胞株為中國倉鼠肺成纖維細胞(CHL)。以DMSO作為陰性對照。陽性對照采用絲裂霉素-C、秋水仙素、環磷酰胺。
1.7.3微核試驗：昆明種小鼠50 只, 6～8 周齡, 體重25～30g, 雌雄不限。用實驗材料的浸取液(分低、中、高3 個劑量組) , 喂食實驗小鼠,陽性對照組每天經口給予環磷酸胺 40mg/kg。取股骨,擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻, 常規涂片, 涂片自然干燥后放入甲醇中固定10 min, 將固定好的涂片放入Giemsa 染液染色10～15min。用pH 6～8 磷酸緩沖液反復沖洗，再用蒸餾水沖洗后晾干，油鏡下觀察。每組觀察1 000 個嗜多染紅細胞, 觀察嗜多染紅細胞的微核, 記錄微核細胞數。
1.8 統計學分析：采用 SPSS 13.0 統計軟件進行分析，數據以均數±標準差表示，試驗組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 法，P
2結果
2.1 急性全身毒性試驗：各組小鼠觀察期內進食正常，活動自如，無呼吸抑制、急促等不良反應，無驚厥、癱瘓及死亡。處死動物后解剖觀察腹腔無腹水粘連，肝脾腎大體觀察和組織學觀察未見異常。
2.2 致敏試驗：豚鼠經激發24h后去除貼附物,于24、48 和72 h分別觀察激發部位皮膚的紅斑和水腫情況, 結果顯示材料組和陰性對照組的皮膚反應指數均為0，無紅腫、水腫、致敏性。
2.3 皮內刺激實驗：注射后各時間點觀察顯示，注射材料浸提液和生理鹽水處無明顯紅斑、水腫和皮膚壞死，按皮膚反應評分系統，PII為0.01～0.02，為極輕微刺激。
2.4 細胞毒性實驗：在細胞培養 24h、48h、72h 的不同時相用倒置顯微鏡觀察，除陽性對照組細胞數量減少,細胞固縮甚至崩解外，實驗組與陰性對照組相似，細胞數量明顯增加，生長良好（見圖1）。
所測 OD 值如表1 所示，據此計算細胞增殖率。實驗材料組細胞增殖率在24h、48h、72h均大于89%，根據規定，異種材料其細胞毒性分級在0-1級，無細胞毒性，可以用作生物材料。
2.5 遺傳毒性試驗
2.5.1 Ames試驗：被測試樣品每劑量組對TA 97、TA 98、TA 100 及TA 102的菌落數, 在加與不加大鼠肝微粒體酶的條件下, 均與自發數相近, 陽性對照組出現明顯的陽性結果。在該實驗條件下, 供試品對組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌均無致突變性。
2.5.2 染色體畸變試驗：供試品的各劑量組,無論加或不加大鼠肝微粒體,染色體畸變與溶劑(DMSO)對照相比, 無差異(P>0.05)，且各劑量組畸變率均
2.5.3 微核試驗：實驗組微核出現率為2.4%,陰性對照組為2.1%,陽性對照9.2%。實驗組與陰性對照組微核細胞率無差異(P>0.05),陽性對照組與陰性對照組相比有統計學意義(P
3討論
局部植入充填材料是整形外科修復畸形缺損的有效手段之一。長期以來，研究開發安全有效、生物相容性好、來源豐富的充填材料，一直是整形外科的研究熱點。異種材料因其組成及結構與人體組織相似，與細胞親和性強，能為細胞生長、增殖、分化及功能發揮提供近似體內組織發生發育的細胞外基質支架條件，加之其來源豐富，故逐漸成為材料研究的熱點。
異種材料在植入機體前需做預處理,以解決生物來源材料的病菌傳播問題，并增強其力學強度，增進其生物穩定性并最終解決生物來源材料的儲存問題[2]。同時，通過預處理保持了生物材料的天然結構，使有利于材料與其植入的生物體融合[3]。其中，交聯處理是最重要的預處理之一。本研究采用一種高反應活性的環氧化物[4]作為交聯劑（US6106555、US62 31614B1），此種環氧化物可與蛋白質分子形成穩定的交聯鍵，大大提高材料的穩定性，且無殘留毒性，使被處理的異種材料不僅穩定性好，不引起免疫排異反應，還能誘導機體組織向其中生長，并和機體組織融為一體。采用此環氧化物交聯處理研制的異種腦膜材料已獲得SFDA認證，并在臨床廣泛應用[5-6]。
我們選取動物(豬)肌腱為原料，應用組織固定、去抗原等系列專利技術，研制了新型異種肌腱基質材料。該材料具有：①取材方便,材料來源充足；②具有一定的物理機械性能；③易于消毒滅菌處理；④可塑性好,易加工塑形等優點。但生物材料對于宿主是異物, 在體內必定會產生某種應答或出現排異現象。生物材料如果要成功, 至少要使發生的反應被宿主接受, 不產生有害作用。因此長期植入機體的材料必須進行生物相容性評價。
對生物材料的生物相容性評價方法主要有兩類, 一是動物體內實驗, 即將材料植入體內, 分階段將植入材料與周圍組織取出, 作組織學檢查, 觀察材料及周圍組織病理變化, 評價組織相容性；另一類為體外實驗, 即用材料或材料浸提液研究材料對組織細胞生長、代謝及增殖方面的影響。Johson等(1977)認為在區別生物材料的毒性及對細胞影響方面, 體外實驗較體內植入更敏感。國內外先后制定了多種標準, 我們主要參考ISO有關生物材料和醫療器材生物學評價技術要求[7-8],選擇相關的體外實驗對材料進行生物相容性和安全性評價。
按照GB/T16886.1對外科植入器械的分類[9],本研究制備的異種肌腱基質材料屬于體內長期植入材料，選用急性毒性試驗、致敏試驗、皮內刺激實驗、細胞毒性試驗和遺傳毒性試驗屬于基本評價范疇, 符合《醫療器械生物學評價和審查指南》提出的要求[10],基本可以滿足對異種肌腱基質材料的生物學評價要求。
從檢測結果看，急性毒性實驗：各組小鼠活動正常，72h 小鼠無死亡，各組動物未見中毒癥狀或不良反應。致敏試驗顯示材料組和陰性對照組的皮膚反應指數均為0,無致敏性。皮內刺激實驗觀察顯示，材料浸提液和生理鹽水處無明顯紅斑、水腫和皮膚壞死，極輕微刺激。材料的細胞毒性結果示該材料的相對增殖度較高，細胞毒性分級在0-1級。遺傳毒性試驗指標均達到標準要求，無遺傳毒性。故該材料在急性毒性試驗、致敏試驗、皮內刺激實驗、細胞毒性試驗及遺傳毒性試驗檢測指標均達到測試要求，證明制備的異種充填材料具有良好的生物相容性，能夠滿足生物材料的應用要求。
綜上所述, 本研究應用專利技術研制的異種肌腱基質材料具有良好的生物相容性和生物安全性,最大程度的去除了動物肌腱異種蛋白的免疫原性，作為一種組織充填材料具有一定的應用前景，但其體內生物安全性及長期轉歸尚有待進一步的動物實驗研究。
[參考文獻]
[1]夏學穎,姜平,張偉,等. 新型異種充填材料的制備及性能檢測[J].南方醫科大學學報,2010,30(5):1156-1159.
[2]Schmidt CE, Baier JM. Acellular vascular tissues: Natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering[J].Biomaterials,2000,21(22): 2215-2231.
[3]Park SN, Park JC, Kim HO, et al. Characterization of porous collagen?h yaluronic acid scaffold modified by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl )carbodiimide cross-linking[J].Biomaterials,2002,23(4):1205-1212.
[4]Zhu Y,Chian KS,Chan- Park MB, et al. Protein bonding on biodegradable poly (L-lactide-co-caprolactone) membrane for esophageal tissue engineering[J].Biomaterials,2006,27(1):68-78.
[5]漆松濤,張文清,馮文峰,等. 帶生物膜跨血管包裹性動脈瘤夾的研制與應用[J].生物醫學工程學雜志,2008,25(3):699-702.
[6]鄧美海,方和平,胡啷,等.生物型補片與聚丙烯補片修補家豬腹壁缺損的對比研究[J].中華普通外科學文獻（電子版）.2008,2(5):367-370.
[7]International Organization for Standardization. Biological evaluation of medical devices-Part 12: sample preparation and reference materials (ISO: 10993212: 1996). Geneva: ISO, 1996.
[8]International Organization for Standardization. Biological evaluation of medical devices-Part 5: tests for in vitro cytotoxicity (ISO:1099325:1999). Geneva: ISO,1999.
[9]國家質量監督檢驗檢疫總局.中華人民共和國國家標準: 醫療器械生物學評價第1部分: 評價與試驗(GB/T 16886.1-2001,ISO10993-1:1997)[S] . 北京: 中國標準出版社, 2002: 3-6.
[10]國家食品與藥品監督管理局. 醫療器械生物學評價和審查指南[ EB/OL]. 2007-6-15/ [2007-11-12].
