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酒席致謝詞范文1
[關鍵詞] 歐洲花楸懸浮細胞；酵母提取物；次生代謝產物；機制
[收稿日期] 2013-12-20
[基金項目] 國家自然科學基金項目（81130070，81072989）； 國家科技支撐計劃項目（2012BAI29B02，2012BAI28B002）
[通信作者] 郭蘭萍，Tel：（010） 64011944，E-mail： glp01@126. com
[作者簡介] 黃蕾，E-mail：
歐洲花楸Sorbus aucuparia L.為薔薇科蘋果亞科花楸屬落葉喬木或小喬木，原產歐洲和亞洲西部溫帶高山區域[1]，其干燥成熟果實可食用和入藥[2]。我國花楸屬植物50余種，資源豐富，供藥用者約6種[2]。目前研究發現，蘋果亞科植物受到外界病原菌侵害時特異性地產生聯苯類化合物作為植保素[3]，Kokubun T等使用銅離子處理歐洲花楸葉片后，可以從葉片中分離出歐花楸素[4]，這種聯苯類化合物在健康的植株中并不存在，且其具有廣泛的生物活性。歐洲花楸是集藥用、食用、園林和生態價值于一身的珍貴樹種。
歐洲花楸懸浮細胞（SASC）生長速度快、周期短，可作為很好的研究材料[5]，已有研究發現用酵母提取物（YE）作為誘導子處理可使SASC迅速合成聯苯類化合物[6]。但是，目前這類具有植保素作用的化合物合成機制尚不明確，還有待進一步的研究。
本實驗以SASC為材料，通過檢測YE處理后SASC次生代謝產物的變化及其細胞培養液中pH、可溶性蛋白含量、細胞外Ca2+流等生理生化指標的變化，初步探究YE誘導SASC合成次生代謝產物的機制，尤其是從可溶性蛋白和鈣離子2個方面為機制研究提供了很好的思路和方向，為更深層次地研究打下基礎。
1 材料
歐洲花楸懸浮細胞系由中國科學院植物研究所葉和春研究員贈送。
培養箱（Conviron Adaptis CMP6010）；超大型搖床（ZYSA0351）；電子天平（Sartorius BS 2202S）；超凈工作臺（SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺）；分析型酸度計（JENWAY3510）；高效液相儀（Waters 2695_2996）；UV檢測器（T6新世紀19-1650-01-1169）；液質聯用儀（Agilent 6320 Ion Trap）；其他常規設備。
牛血清蛋白為美國MP公司產品；Yeast extract為OXOID公司產品；其他試劑均為國藥集團化學試劑有限公司產品。
2 方法
2.1 細胞懸浮培養體系的建立 誘導出的歐洲花楸愈傷組織接種于含50 mL MS固體培養基的400 mL廣口瓶中，愈傷組織每 14 d 繼代1次，經過3～5次繼代后，選擇疏松的愈傷組織轉入液體培養基中培養，每 250 mL 三角瓶中分裝 50 mL 的液體培養基，置于25 ℃培養箱中暗培養。懸浮細胞培養轉速設定為 120 r?min-1。實驗中使用的歐洲花楸懸浮細胞是將減壓過濾后的 1.4 g細胞接種于含有 20 mL MS液體培養基的100 mL 三角瓶中。
2.2 YE誘導子的配制及處理 用蒸餾水溶解酵母提取物，配制60 g?L-1的母液，高壓滅菌。參照Liu B等處理方法[6]，處理終濃度為3 g?L-1。
2.3 歐洲花楸懸浮細胞中次生代謝產物的提取和檢測 將收獲的細胞用15 mL甲醇在研缽中研碎，使用濾紙和漏斗將濾液過濾到雞心瓶中，過濾后的細胞殘渣再用10 mL甲醇提取1次，合并濾液，將雞心瓶置于旋轉蒸發儀上濃縮至干。培養基用15 mL乙酸乙酯萃取2次，用分液漏斗分離，將乙酸乙酯層倒入提取細胞后的雞心瓶中，置于旋轉蒸發儀上濃縮至干。用1 mL的乙酸乙酯定容。
將提取液中的乙酸乙酯溶液揮干，用500 μL的色譜甲醇溶解，過0.22 μm的有機濾膜后用于HPLC檢測。
HPLC測定條件為：液相色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸水-甲醇（50∶50）流速0.7 mL?min-1；紫外檢測波長為280 nm。
質譜條件為：離子源為ESI；正離子模式；霧化氣壓力206.85 kPa；干燥氣為氮氣，干燥氣溫度300 ℃，流速10 L?min-1；毛細管電壓4 000 V；相對分子質量掃描范圍100～600；柱尾分流 2∶1。
2.4 歐洲花楸懸浮細胞生物量測定 將培養的懸浮細胞真空抽濾至不滴水后，直接稱量細胞鮮重即為生物量，用鮮重（FW）表示，每個處理設置4個生物學重復。
2.5 細胞懸浮液pH測定 采用分析型酸度計直接測定培養基中的pH，每個處理設置4個生物學重復。
2.6 細胞中可溶性蛋白質含量的測定 用考馬斯亮藍G-250法測定[7]，以牛血清蛋白作標準曲線，單位為mg?g-1（鮮重），每個處理設置4個生物學重復。
2.7 細胞外Ca2+流變化的測定 采用非損傷微測技術（NMT）[8]，用多聚賴氨酸玻片固定細胞，加入測試液穩定15 min，在顯微鏡下找到直徑約200 μm的細胞簇，測定時間為10 min，每個處理設置5個生物學重復。
3 結果與分析
3.1 酵母提取物對歐洲花楸懸浮細胞次生代謝產物的影響 細胞經YE處理后，在其細胞提取物中檢測到5種聯苯類化合物，分別推斷為2′-OH-aucuparin（1），3，5-dihydroxy-biphenyl（2），noraucuparin（3），aucuparin（4），eriobofuran（5）。隨著誘導時間的延長，SASC合成的聯苯類化合物總量呈上升趨勢，但5種聯苯類化合物在細胞中的含量則分別呈現出不同的積累規律見圖1。
化合物1在YE誘導24 h后方可檢測到，在48 h時該化合物的含量達到峰值，隨著誘導時間的延長含量逐漸減少，但是在156 h時，其含量又呈現增加趨勢。
化合物2在YE誘導24 h時濃度達到峰值，在其他檢測時間點上該化合物的含量都較低。
化合物3是YE誘導后最先檢測到的化合物，其含量表現出周期性波動的趨勢，12～36 h其含量顯著增加，36 h時出現峰值，36～96 h含量又顯著下降，108～168 h含量再次緩慢增加。
化合物4含量相對其他化合物較高，在YE誘導24 h之后其含量逐漸增加，132 h含量達到最大值，132～168 h其含量呈現緩慢下降趨勢。
YE處理后檢測到化合物5的時間最遲，直到36 h該化合物才積累到一定的濃度。隨著處理時間的延長，該化合物的含量呈波動性增加的趨勢，168 h時其含量達到最大值。
由以上結果可知YE誘導子對SASC合成聯苯類化合物的影響是一個動態的變化過程，隨著處理時間的變化，SASC合成不同的聯苯類化合物的組分及其組分間的配比都發生了改變。
3.2 酵母提取物對歐洲花楸懸浮細胞生物量的影響 YE對SASC生物量的影響見圖2中的實際值，為了解YE誘導后細胞生物量與CK組的變化，根據已得到的SASC生長曲線的擬合函數：f（x） =0.369 9/[1+10.77 exp（-0.329 2x）][5]。
將取樣時間點代入函數，得到了細胞在正常生長條件下生物量的理論值（圖2中的理論值），用得到的理論值減去實驗中測得的實際值，得到了理論值和實際值之間的差值（圖2中的差值）。
在添加YE誘導子后（如圖實際值），細胞生物量呈現出緩慢的先增加又減少的過程，其變化幅度并不是很明顯。在取樣時間段內，細胞生物量變化不大。
分析理論值、實際值之間的差值，說明在YE的影響下，SASC增長曲線偏離了細胞增長模型的曲線，YE對SASC的影響整體表現為抑制作用。隨著YE對SASC誘導時間的增加，YE對SASC的抑制作用也逐漸增大。
3.3 酵母提取物對歐洲花楸懸浮細胞細胞懸浮液中pH的影響 隨著處理時間的增加，細胞懸浮液的pH也越來越小。細胞懸浮液的pH變化大致為2個階梯式下降，見圖3。48 h至108 h，pH緩慢下降，在108 h時降至6.445，至此第1階段結束；在120 h時細胞懸浮液pH降至6.045，在120 ～168 h，pH處于另一個下降階段，但下降的幅度較上個階段要大。
正常細胞培養狀態下，細胞懸浮液中的pH隨著培養時間的延長而逐漸升高[5]。添加YE后細胞懸浮液pH呈明顯下降趨勢，說明可能是SASC產生的次生代謝產物導致pH變化，并且這種pH的改變并不利于細胞的生長。
3.4 酵母提取物對歐洲花楸懸浮細胞中可溶性蛋白質的影響 CK組細胞中的可溶性蛋白質含量表現為緩慢下降的變化趨勢，見圖4。在24，48 h時含量最高，隨著時間的延長可溶性蛋白質的含量開始下降，在120，144，168 h 3個時間點上，可溶性蛋白質的含量相差無幾。YE組SASC中可溶性蛋白質的含量呈現出緩慢下降，再趨于穩定的趨勢。24～96 h細胞中的可溶性蛋白質含量逐漸下降，96 h之后細胞中的可溶性蛋白質含量逐漸趨于穩定。
將YE組細胞可溶性蛋白含量與CK組做差，得到YE處理后細胞中可溶性蛋白含量的增量，然后與CK組對比得到細胞內可溶性蛋白質的相對增量，見圖5。從圖中可清晰得出，YE處理后細胞內可溶性蛋白質含量與CK組對比，主要經歷2個階段，第1個階段其相對增量大概在50%左右，120 h之后進入第2個階段，細胞內可溶性蛋白相對增量達到了140%左右。
3.5 酵母提取物對歐洲花楸懸浮細胞外Ca2+流的影響 YE對細胞外Ca2+流的影響，YE組與CK組細胞外Ca2+都表現為內流現象，但是YE組Ca2+流平均值顯著小于CK組。從動態流速圖中也可以得出，雖然YE組與CK組都是在測定初期Ca2+內流速度較大，隨著測定時間的延長速度逐漸減小，但YE組速度始終小于CK組。說明YE處理后導致細胞外Ca2+內流大量減少，見圖6。
4 討論
YE處理后SASC提取物中檢測到5種聯苯類化合物，而正常培養條件下細胞并沒有合成這類化合物，說明細胞合成這類化合物來應對YE誘導子的脅迫。同時，隨著處理時間的延長細胞培養液中的pH逐漸降低，細胞生物量與CK組比增長明顯緩慢，說明SASC在YE脅迫下合成的次生代謝產物可能改變了培養液中的pH，導致了細胞的生長條件惡化、影響細胞膜的通透性，使細胞不能正常進行生長、分化、增殖等生命活動，最終導致細胞的生物量下降。
有研究推測聯苯類化合物合成過程中有一定的轉化順序[9] ，本研究發現5種聯苯類化合物含量隨著處理時間的延長呈現不同的積累規律，整體表現為：1，2，3號化合物處理后12 h即可用現有方法檢測到但相對含量較低，并且積累量迅速達到峰值然后下降，推斷這3種化合物可能是聯苯類化合物生物合成途徑上的上游化合物或中間體；4，5化合物積累時間相對較晚，且呈較小波動的穩定積累狀態，其可能處于合成途徑的下游，結構相對穩定。本研究在一定程度上明確了聯苯類化合物之間存在的轉化，為明確轉化順序提供了依據。
YE組細胞中可溶性蛋白質的含量與CK組對比具有顯著性差異，在YE誘導下，可溶性蛋白質的相對含量越來越大，最高時相對增量達到了147.76%，說明細胞為了抵抗真菌帶來的傷害，對防治機制的投入也越來越多，多合成的可溶性蛋白質可能是初生生長所不需要的，用來調節催化次生代謝產物的合成。
本實驗研究發現YE處理后SASC細胞外Ca2+內流與CK組對比顯著減少，說明在細胞受到YE誘導子脅迫后，Ca2+作為信號分子可能介導細胞合成次生代謝產物的信號轉導。
本實驗通過分析生物量、細胞培養液中的pH以及細胞內可溶性蛋白含量的變化，發現YE誘導SASC合成次生代謝產物的機制與道地藥材形成的逆境效應的假說[10]基本一致。在不受外界環境脅迫的情況下，植物首先滿足的是生長和繁殖；在面對不同因素的脅迫時，植物會合成次生代謝產物抵御外界不利環境，為此需要付出相應的成本，因而會降低植物的初生生長速度。此外，細胞應對YE脅迫迅速啟動了Ca2+信號分子，說明Ca2+可能介導SASC合成次生代謝產物的信號轉導。這些為YE誘導SASC合成次生代謝產物的機制研究拓展了思路，為下一步深層次的研究打下了堅實基礎。
[參考文獻]
[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會. 中國植物志. 第36卷[M] . 北京： 科技出版社， 1974： 284.
[2] 趙中振， 肖培根. 當代藥用植物典. 第3冊[M]. 北京： 世界圖書出版社， 2008： 436.
[3] Kokubun T， Harborne J B. Phytoalexin induction in the sapwood of plants of the Maloideae（Rosaceae） biphenyls or dibenzofurans[J]. Phytochemistry， 1995， 40（6）：1649.
[4] Kokubun T， Harborne J B. A survey of phytoalexin induction in leaves of the Rosaceae by copper ions[J]. Z Naturforsch， 1994， 49（C）：628.
[5] 肖文娟， 楊光， 郭蘭萍， 等. 歐洲花楸細胞懸浮培養生長動力學研究[J]. 中國現代中藥雜志， 2013， 15（7）：569.
[6] Liu B， Beuerle T， Beerhues L， et al. Biphenyl synthase from yeast-extract-treated cell cultures of Sorbus aucuparia[J]. Planta， 2004， 218（3）：492.
[7] 趙英永， 戴云， 崔秀明， 等. 考馬斯亮藍G-250染色法測定草烏中可溶性蛋白質含量[J]. 云南民族大學學報：自然科學版， 2006， 15（3）：235.
[8] 印莉萍， 上官宇， 許越. 非損傷性掃描離子選擇電極技術及其在高等植物研究中的應用[J]. 自然科學進展， 2006， 16（3）：262.
[9] Hüttner C， Beuerle T， Beerhues L， et al. Differential effect of elicitors on biphenyl and dibenzofuran formation in Sorbus aucuparia cell cultures[J]. J Agric Food Chem， 2010， 58（22）：11977.
[10] 黃璐琦， 郭蘭萍. 環境脅迫下次生代謝產物的積累及對道地藥材形成的影響[J]. 中國中藥雜志， 2007， 32（4）：277.
Mechanism exploration on synthesis of secondary metabolites in
Sorbus aucuparia cell cultures treated with yeast extract
HUANG Lei， XIAO Wen-juan， YANG Guang， MO Ge， LIN Shu-fang， WU Zhi-gang， GUO Lan-ping
（State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center of Chinese Materia Medica，
China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
[Abstract] Suspension cultures cell of Sorbus aucuparia （SASC） was used as materials， the changes of physiological and biochemical indexes of SASC after treatment with yeast extract （YE） were detected， and the synthetic mechanism of secondary metabolites in SASC treated with YE was preliminarily explored. The results were as follows： under the assay conditions， SASC was induced to synthesize five biphenyl compounds， and these compounds content changed differently with induction time prolonging； YE treatment inhibited cell growth， the culture medium pH was gradually reduced after treatment； water-soluble protein content showed a trend of slow decline， which was significantly increased in YE treatment group （YE group） compared with the control group （CK group）， the maximum relative content was 147.76% in contrast with CK group； both YE group and CK group were extracellular Ca2+ flow influx， but the YE group flow was significantly slow than CK group. The results indicate that YE induced the cells in a stress state， which was not conducive to the growth of cells and forced the cells to synthesize biphenyl compounds against external stress； water-soluble protein may serve as intracellular enzymes involved in the synthesis of compounds regulation； Ca2+ may as signal molecule mediate cell signal transduction respond to YE stress.