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1牙齒組織的發育來源
顱面部發育是包含了多個不同發育來源的干細胞相互作用的復雜過程。牙齒包含至少2個胚層來源的組織，外胚層來源的口腔上皮形成牙釉質，中胚層形成牙齒其余結構，如牙髓、牙本質和牙骨質。而顱面部其他骨組織（如顱骨的扁骨）則主要來源于間充質前體細胞、中胚層前體細胞及細胞基質。牙齒組織發生始于胚胎發育第5周，并持續整個乳牙替換期。胚胎5周后，原始口腔上皮帶形成并在未來牙板上下頜部增厚。上皮帶內陷形成前庭板和牙板。成釉器的形成始于牙板下方并經歷了牙齒發育3個階段：蕾狀期、帽狀期、鐘狀期。在蕾狀期，上皮細胞遷移至外胚間充質下方，外胚間充質細胞排列更加緊密包繞牙蕾。接著，在帽狀期牙蕾細胞進一步增殖形成帽狀結構。上皮細胞形成成釉器，外胚間充質細胞在成釉器下方增殖形成牙乳頭。包繞牙乳頭的地方形成牙囊。鐘狀期，成釉器內表面進一步加深，細胞開始分化。牙內皮細胞與牙乳頭通過基膜相互作用。牙內皮細胞與牙乳頭細胞停止增殖，細胞核遷移至基膜對側，細胞伸長。牙內皮細胞成為牙釉質前體細胞并釋放信號，牙乳頭成為成牙本質細胞。成牙本質細胞不斷分泌有機基質，即前期牙本質，成牙本質細胞滲出突起，胞體向牙髓中央移動。成牙本質細胞分泌羥基磷灰石及礦物質，前期牙本質成為牙本質。牙釉質前體細胞形成牙釉質，成為成釉細胞。牙根的發育與牙冠不同。內釉上皮與外釉上皮細胞層從頸環開始向下方生長形成牙根赫威特上皮根鞘。赫威特上皮根鞘誘導牙乳頭分化為成牙本質細胞形成根部牙本質。成牙骨質細胞、牙周膜纖維細胞及牙槽骨成骨細胞這3種細胞對牙齒在牙槽窩中起到支持、平衡作用，并都來自牙乳頭，統稱為牙周組織。牙周膜的干細胞和前體細胞具有多種自我更新及分化潛能。
2種子細胞在牙髓再生中的策略
2.1利用干細胞進行牙髓再生
利用干細胞進行牙髓再生的定義是將外源性干細胞植入宿主根管系統中進行牙髓再生。被移植的細胞或來源于宿主體內或來源于異體細胞。這些細胞經過簡單分離或通過培養擴增后用于牙髓再生。由于干細胞能夠對微環境變化做出反應，進行細胞分化及細胞分裂，因此干細胞治療能夠有效地修復組織缺損。有許多研究表明，體內移植牙髓干細胞或其他種類干細胞可以在異位形成牙髓樣組織。Huang等的研究報道了將根尖牙乳頭干細胞或牙髓干細胞植入牙根并埋入小鼠背部，可以觀察到牙髓樣組織形成及牙本質的沉積。Cordeiro等報道了人脫落乳牙干細胞復合凝膠植入牙片后埋入小鼠背部皮下，可以觀察到血管化牙髓樣組織形成。細胞移植有許多優點，如可控制移植的細胞數量及優化最適宜牙髓再生的干細胞亞群。經分選的細胞具有更強能力，促使在根管中形成神經、血管及牙本質。Iohara等報道牙髓細胞中CD31-/CD146-或CD105+細胞亞群，比其他前體細胞具有更高自我更新能力及分化潛能。一些非牙源性間充質干細胞，如骨髓間充質干細胞、脂肪來源的間充質干細胞也能形成牙髓樣組織。盡管獲得這些細胞會給患者造成創傷，但當牙源性間充質干細胞無法獲取時，這些細胞可成為替代的候選細胞。關于干細胞移植進行牙髓再生的研究報道，主要集中于不同種類的干細胞復合支架材料，體內移植后進行原位或異位牙髓樣組織再生觀察的基礎性工作。真正進入牙髓組織再生臨床前或臨床試驗的研究報道較少。盡管這些基礎研究工作具有科學意義，但在細胞移植技術在向臨床治療的轉化過程中仍然遇到很多問題。首先，用于治療的干細胞來源問題。如果使用的是源于非人種屬的干細胞，將會由于免疫排斥的問題受到限制。具有免疫原性的細胞移植可能會引起免疫排斥及感染。細胞冷凍儲存系統可能出現細胞流失，并增加額外花費。而傳統組織工程技術中的種子細胞來源、培養技術、對支架的復合程度、植入體內后潛在的免疫原性、細胞活性等因素都限制了該技術的實際臨床應用。
2.2無細胞移植的牙髓再生治療
牙髓再生的臨床轉化，不僅要滿足安全、有效兩個基本條件，還應考慮到簡便、實用和經濟的原則。哈佛大學干細胞與再生生物學研究中心的研究發現，在多種組織再生過程中都存在體內干細胞的遷移和募集現象，稱為干細胞歸巢（stemcellshoming）。這些募集的機體自身干細胞都不同程度地參與了創傷愈合和組織再生的過程?，F已證實，機體干細胞歸巢可以通過2種完全不同的途徑來實現：一種是非血流依賴性的運動，主要是近距離的細胞募集，例如缺損組織相鄰干細胞龕中的干細胞可以感應損傷產生的信號分子，通過主動的變形蟲樣運動，到達組織缺損區域，發揮再生作用；另一種是血流依賴性遷徙，主要是遠程機體干細胞龕（例如骨髓）中干細胞的動員和歸巢，包括細胞感受信號刺激，動員機體干細胞龕中干細胞入血，隨血流（bloodflow）遠程遷徙，最后到達損傷區域局部毛細血管，穿透血管壁，參與組織修復過程。由于減少了潛在的污染、過高的成本、免疫排斥以及復雜的體外規模培養技術等缺點,利用細胞因子和趨化因子等實現細胞歸巢,可放大宿主自我修復潛能,因此細胞歸巢技術似乎比細胞移植具備更多的優勢?，F在已經證實干細胞巢/巢存在于體內很多成體組織或器官中,包括腦、骨髓、外周血、血管、骨骼肌肉、皮膚、牙齒、心臟、腸、肝、卵巢上皮和睪丸等。盡管干細胞歸巢的生物機制尚未完全闡明，但歸巢的干細胞參與組織修復再生的現象已經引起了學者的高度關注，并在動物研究中得到證實。Kim等學者通過細胞歸巢技術觀察到牙髓樣組織的異位再生。他們通過對臨床拔除的人離體牙進行根管預備，包括牙髓拔除及機械預備，通過高溫滅菌去除牙齒中的生物活性及有機成分，采用生長因子復合膠原支架植入離體牙內，經過3~6周大鼠皮下體內移植，可以觀察到全長根管內形成牙髓血管、牙本質及神經復合物。該研究首次描述了通過內源性細胞歸巢技術進行牙髓再生。他們選用一些生長因子如成纖維細胞生長因子，血管內皮細胞生長因子，神經生長因子（NGF）以及骨形態發生蛋白-7（,BMP-7）用于牙髓再生。細胞歸巢的含義來源于骨髓移植后，造血干細胞（HSC）在體內的遷移，從骨髓到外周最終到達干細胞龕內。細胞歸巢技術的最大優勢在于能夠利用宿主體內的細胞進行組織再生，從而避免外源性細胞處理過程。
3生物支架材料在牙髓再生中的應用
不論是細胞移植還是自體細胞歸巢進行牙髓組織再生，生物支架材料的選擇都是非常重要的考慮因素。使用能維持干細胞生存以及血管神經再生的支架材料，使組織工程牙髓進入臨床應用變得更為現實。牙髓組織再生的支架材料應該具有如下特征：有合適的空隙率，便于植入干細胞或前體細胞及生長因子傳遞營養物質；具有可控的生物降解性，植入機體內的支架材料可被自體組織取代；優良的生物機械性，可供軟硬組織附著的良好的生物活性；良好的生物相容性，無免疫排斥。目前牙髓組織再生的研究多集中于異位再生。天然多聚材料因含有天然的細胞外基質成分而具有良好的生物相容性及生物降解性。Zhang等使用膠原海綿、多孔陶瓷及纖維狀鈦網復合牙髓干細胞進行研究，4周后可以觀察到牙本質涎蛋白的表達，裸鼠皮下植入細胞支架材料6~8周后，可以看到支架材料表面有牙本質涎蛋白的表達及結締組織再生，而陶瓷組織則有鈣化組織形成。聚乳酸（PLA）、聚羥基乙酸(PGA)和二者共聚物，是目前組織工程領域應用最廣泛的材料之一。El-Backly等將從兔牙牙髓中提取的DPSC復合于PLGA上，并植入家兔皮下，12d后觀察到牙骨質及管狀牙本質的形成。Huang等將人SCAP及DPSC分別與PLGA復合并接種于長約6～7mm，孔徑約2.5mm的牙本質管中，一端使用三氧礦物聚合物封閉1mm后植入裸鼠皮下，3月后觀察發現，在管腔內充滿有血管化的牙髓樣組織;在牙本質管內壁上有連續的牙本質樣物質沉積。這些材料的生物相容性好，降解速率可控，具有良好可塑性，能滿足不同復合方法和置入條件的需要。膠原是一種天然的蛋白質，可從動物的皮膚、骨骼、韌帶等組織中提取，因其優越的生物相容性、生物可降解和弱抗原性而被廣泛應用于組織工程支架材料。Prescott等將DPSC聯合牙基質蛋白(dentinmatrixprotein1，DMP1)與膠原支架復合后，接種于牙本質片上并植入裸鼠皮下，6周后觀測到了牙髓樣組織生成。通過細胞歸巢技術，膠原凝膠溶液復合多種生長因子（如PDGF,FGF,VEGF等）可以觀察到牙髓組織異位再生。
4生長因子在牙髓再生中的考慮
牙髓干細胞在牙髓組織中的增殖、分化、生存及活力受到多種信號分子、受體及轉錄因素的調控。不論采用干細胞移植技術還是基于細胞歸巢技術進行牙髓再生研究，生長因子對牙髓細胞的作用均不可忽視。不同的信號通路參與調控牙髓再生的全過程，由多條信號通路交織成的調節網絡在牙髓再生過程中發揮著必不可少的作用。牙髓細胞表達多種不同的生長因子，這些生長因子協同在病理生理條件下調節牙髓的血管形成及牙本質形成。血小板衍生生長因子（PDGF）是由血小板釋放的生長因子，在血管形成及細胞增殖過程中發揮作用。有研究表明，PDGF能促進人牙髓組織中成纖維細胞增殖，并增強成骨細胞中VEGF表達并促進牙髓損傷部位血管形成。體內研究中，將根管處理后的人牙埋入大鼠背部，可以觀察到PDGF能促進牙髓牙本質樣組織形成。BMP2與VEGF是牙髓牙本質復合體中發現的生長因子，參與牙髓愈合反應過程。最近的研究表明VEGF與BMP2以劑量依賴方式相互作用，并在牙髓血管形成中發揮作用。轉化生長因子在牙齒及牙本質發育過程中發揮作用。研究表明，TGF-β1能刺激Ⅰ型膠原合成，增強堿性磷酸酶活性，促進牙髓細胞增殖。Melin等學者研究表明TGF-β1參與調節牙髓組織的細胞增殖、遷移、細胞外基質形成過程。TGF-β1對根尖牙乳頭來源及其他類型的細胞均有趨化作用。在細胞招募階段，TGF-β1這種趨化性可以吸引更多的干細胞或前體細胞至牙齒受損部位。
5結語
綜上所述，如何通過組織工程技術進行牙髓再生治療，獲得有活力的牙髓組織這一問題已經受到越來越多的關注。學者們開展了許多體內外研究，無論是干細胞移植還是無細胞移植的牙髓再生，已經獲得了一些肯定的結果，但真正做到牙髓再生的臨床轉化工作，還有許多問題亟待解決。如何通過簡單、低成本、易于操作的牙髓治療方式讓牙髓恢復活力，成為目前學者們競相思考的問題。
作者：李琳 王佐林 單位：同濟大學口腔醫學院口腔生物醫學及轉化醫學實驗室牙體牙髓教研室
