前言：尋找寫作靈感？中文期刊網用心挑選的余甘子中活性成分鑒定與提取工藝優化，希望能為您的閱讀和創作帶來靈感，歡迎大家閱讀并分享。
摘要：研究余甘子鮮汁沉淀物的化學組成與資源化物質鞣花酸的提取純化工藝。方法：收集余甘子鮮汁沉淀物，采用能譜儀、傅里葉變換紅外光譜儀和超高效液相色譜與串聯四極桿飛行時間質譜聯用技術（ＵＰＬＣＱＴＯＦＭＳ）分析余甘子鮮汁沉淀物的化學成分；以鞣花酸含量為指標，分別采用醇提法、酶提法、堿溶酸沉法對鞣花酸進行提取純化，且通過單因素實驗優化篩選提取工藝。結果：紅外分析表明，余甘子鮮汁沉淀物具有Ｃ、Ｏ元素，苯環、酚羥基等基本結構；ＵＰＬＣＱＴＯＦＭＳ結果表明，沉淀物的主要成分為鞣花酸、鄰苯二甲酸二丁酯等，且鞣花酸占比最高，為３９９１％；提取工藝優化結果顯示，堿溶酸沉法為較優工藝，進一步優化后得到最佳工藝參數為料液比１∶４０、ＮａＯＨ濃度２％、超聲提取時間２０ｍｉｎ，該條件下得到的提取物中鞣花酸含量為４７３８％，純度為９４２２％。掃描電鏡觀察表明，鞣花酸提取物粉末中有大量柱狀結晶，推測為鞣花酸分子平面聚合形成。結論：余甘子鮮汁沉淀物中鞣花酸天然豐度高，可作為鞣花酸天然來源途徑之一。所得到的鞣花酸提取純化工藝步驟簡單、可操作性強、成本較低、含量及純度較高，適宜用于余甘子鮮汁固廢物中鞣花酸的富集。
關鍵詞:余甘子；固廢物；鞣花酸；提取純化；工藝優化；含量測定；質譜分析；綠色生產
余甘子ＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓｅｍｂｌｉｃａＬ是大戟科葉下珠屬植物，其成熟果實余甘子，亦稱油柑子、滇橄欖、山油甘、庵摩勒等［１］。余甘子風味獨特、營養豐富、保健功能顯著，具有清熱涼血，消食健胃，生津止咳等功效，在降糖、調節血脂代謝、預防牙齦炎等方面作用突出［２３］，是極具特色的中藏藥傳統藥材及藥食同源品種，具有較高的大健康產品與食品開發價值［４］。余甘子鮮汁系余甘子鮮果直接壓榨而成，是余甘子產品的重要形式，也是開發相關飲片及提取物的重要原料［５］。據余甘子相關生產企業調查，僅云南省境內，余甘子鮮汁半年生產周期產量已達３５００噸，預計次年年產量將突破１５０００噸。然而，余甘子鮮汁在貯存過程中會產生大量乳白色或灰白色沉淀，約占鮮汁總質量的５％～２０％。目前，相關保健品或飲料生產企業均對該類沉淀物缺乏相應的研究與認識，并將之視為生產固廢物，主要采用生物氧化等方式對其進行無害化處理［４］。該處理方法不僅面臨巨大的生態環境壓力，還會造成資源浪費與生產成本的增加。為進一步合理利用資源，急需尋找新的解決途徑。課題組前期研究顯示，余甘子鮮汁沉淀中除大量植物組織殘渣、雜質外，還含有大量鞣花酸，天然豐度１０％左右［６］。以此估算，沉淀物中鞣花酸資源蘊藏量極高，極具開發潛力。鞣花酸是沒食子酸的二聚衍生物，具有抗氧化、抗癌變、抗誘變、抗炎、抗菌和抗病毒等作用［７］，被廣泛應用于食品、醫藥、醫療和化妝品等領域［８９］。目前，鞣花酸主要是五倍子浸出液水解制得的，其資源有限，粗提物每噸售價２０萬元以上［１０］。而合成法因制備工藝復雜，存在雜醌類物質而較少使用［１１］。余甘子固廢物沉淀鞣花酸天然含量可達７％～１０％以上，單個藥企年產量可達數噸到數十噸，資源蘊藏量十分可觀，有望成為潛在的鞣花酸新來源。據此，本研究首先采用超高效液相色譜與串聯四極桿飛行時間質譜聯用技術（ＵｌｔｒａｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｔｏＱｕａｄｒｕｐｏｌｅＴｉｍｅｏｆｆｌｉｇｈｔｍａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＵＰＬＣＱＴＯＦＭＳ）結合傅里葉變換紅外（ＦｏｕｒｉｅｒＴｒａｎｓｆｏｒｍＩｎｆｒａｒｅｄ，ＦＴＩＲ）光譜儀、掃描電鏡等，對余甘子鮮汁沉淀物的物質基礎進行分析。其次，基于沉淀物的物質構成以及鞣花酸的性質，采用醇提、酶提、堿溶酸沉法提取鞣花酸。以鞣花酸的含量、純度、外觀為指標，對鞣花酸的提取方法、提取工藝進行了優化與評價。上述研究旨在基于精細高值資源化模式，辨識余甘子鮮汁沉淀物的化學構成，優化鞣花酸富集工藝，在實現其潛在價值的同時有望降低因處理加工固廢物所產生的碳排放。為構建余甘子高品質、超循環的全產業鏈產品體系，實現開源節流、綠色生產，推進余甘子全產業鏈發展提供一定參考。
１儀器與試藥
１.１儀器
十萬分之一分析天平（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司，德國，型號：ＢＴ２５Ｓ），萬分之一分析天平（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ公司，德國，型號：ＢＳＡ２２４Ｓ），高效液相色譜儀（島津公司，日本，型號：ＬＣ２０ＡＴ），ＭｉｌｌｉＱ超純水儀（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司，美國，型號：ＵＰＲ１１５Ｔ），掃描電鏡（賽默飛公司，美國，型號：ＦＥＩＩｎｓｅｐｅｃｔＦ５０），ＥＤＡＸＯＣＴＡＮＥＳＵＰＥＲ能譜儀（依達克斯有限公司，美國，型號：ＳＥＭ５０００），數控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，型號：ＫＱ５００ＤＥ），傅里葉變換紅外光譜儀（賽默飛Ｎｉｃｏｌｅｔ公司，美國，型號：ＩＳ５０），高分辨飛行時間質譜儀（Ｗａｔｅｒ公司，美國，型號：ＳＹＮＡＰＴＸＳ），高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司，型號：ＴＧＬ１６）。
１.２試劑
鞣花酸對照品（四川維克奇生物科技有限公司，批號：ｗｋｑ２１０１０４０３，質量分數≥９８％），纖維素酶（上海源葉生物科技有限公司，貨號：Ｓ１００４１５ｇ，５００Ｕ／ｍｇ），果膠酶（上海源葉生物科技有限公司，貨號：Ｓ１０００７５ｇ，５０Ｕ／ｍｇ），甲醇（Ｓｉｇｍａ公司，美國，貨號：ＷＸＢＤ７３６１Ｖ），磷酸（Ｓｉｇｍａ公司，美國，貨號：ＷＸＢＤ２０６０Ｖ），氫氧化鈉（成都市科隆化學品有限公司，批號：２０１１０７１５），鹽酸（四川西隴科學有限公司，批號：２１０６０８１），乙醇（成都市科隆化學品有限公司，批號：２０２１０８２３０２）。
１.３分析樣品
余甘子鮮汁沉淀物（成都市三勒漿藥業集團四川華美制藥有限公司提供），經真空干燥后粉碎過三號篩備用。
２方法
２.１沉淀ＦＴＩＲ分析
取溴化鉀于瑪瑙研缽中，在紅外烤燈下研磨成細粉；轉移至壓片模具中，將模具置于壓片機中壓實，得半透明薄片，即溴化鉀空白片。取余甘子鮮汁沉淀物粉末適量，與溴化鉀在瑪瑙研缽中研磨，壓片制成樣品片，將樣品片置于紅外光譜儀中，掃描得到樣品片的一維紅外光譜。
２.２沉淀ＵＰＬＣＱＴＯＦＭＳ分析
２.２.１色譜條件色譜柱ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｃｃｕｃｏｒｅＣ１８柱（１００ｍｍ×２１ｍｍ，２６μｍ）；流動相０１％甲酸水（Ａ）乙腈（Ｂ），梯度洗脫（０～１ｍｉｎ，２％Ｂ；１～２ｍｉｎ，２％～５％Ｂ；２～４ｍｉｎ，５％～７％Ｂ；４～６ｍｉｎ，７％～２４％Ｂ；６～１０ｍｉｎ，２４％～４２％Ｂ；１０～１２ｍｉｎ，４２％～５４％Ｂ；１２～１５ｍｉｎ，５４％～７６％Ｂ；１５～１８ｍｉｎ，７６％～１００％Ｂ）；流速０２ｍＬ／ｍｉｎ；柱溫３０℃；進樣量５μＬ［１２］。２２２質譜條件采用加熱電噴霧離子源（ＨｅａｔｅｄＥｌｅｃｔｒｉｃＳｐｒａｙＩｏｎ，ＨＥＳＩ），在正、負離子模式條件下進行檢測。具體參數設置如下：噴霧電壓３５ｋＶ（＋）／３０ｋＶ（－），離子源溫度３５０℃，鞘氣流速３５ａｒｂ，輔助氣流速１０ａｒｂ，離子傳輸管溫度３２０℃，離子掃描范圍ｍ／ｚ１００～１５００，碰撞能量梯度為２０、４０、６０ｅＶ。２.２.３供試品溶液制備鮮汁沉淀物：精密稱定干燥后的沉淀物粉末１０ｍｇ，置于２５０ｍＬ棕色容量瓶中并用甲醇定容，稱定質量，超聲３０ｍｉｎ（３００Ｗ，４０ｋＨｚ），放冷，加甲醇補足減失的質量，搖勻，過０２２μｍ微孔濾膜，即得。２.２.４數據分析及成分分析將采集得到的原始數據導入ＣｏｍｐｏｕｎｄＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒ３１質譜數據處理軟件中，建立未知化合物鑒定的工作流程，設置一級及二級質量偏差＜５×１０－６，進行峰提取、峰對齊。根據一級準分子離子峰質荷比獲得精確質量數及化合物分子式，結合二級碎片離子信息、ＭａｓｓＦｒｏｎｔｉｅｒ軟件、ｍｚＣｌｏｕｄ網絡數據庫、ｍｚＶａｕｌｔ本地中藥成分數據庫、文獻報道及部分對照品比對，進行化合物的分析鑒定。
２.３沉淀物中鞣花酸的提取純化工藝優選
２.３.１醇提法精密稱定沉淀物粉末２０ｇ，配置６０％乙醇溶液，按照料液比１∶３０（ｇ／ｍＬ），于６０℃條件下回流提?。福埃恚椋睿崛。炒?，于５０℃水浴中用旋轉蒸發儀蒸干溶劑，取沉淀，水洗３次后干燥粉碎。２.３.２酶提法精密稱定沉淀物粉末２０ｇ，配置質量濃度為２％的復合酶（纖維素酶與果膠酶質量比為２∶１）水溶液，設置料液比１∶３０（ｇ：ｍＬ），酶解溫度６０℃，并使用１ｍｏｌ／Ｌ鹽酸溶液調節ｐＨ值至４，放入恒溫振蕩箱中（８０ｒ／ｍｉｎ），酶解反應４ｈ，離心取沉淀，水洗３次后干燥粉碎。２３３堿溶酸沉法精密稱定沉淀物粉末２０ｇ，以料液比１：５０（ｇ：ｍＬ）加入１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液，超聲（３００Ｗ，４０ｋＨｚ，３０ｍｉｎ）并離心（３０００ｒ／ｍｉｎ，離心半徑６ｃｍ，離心５ｍｉｎ），取上清液，加入１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ調節ｐＨ值至３，離心（３０００ｒ／ｍｉｎ，離心半徑６ｃｍ，離心５ｍｉｎ），取沉淀，水洗３次后干燥粉碎。
２.４鞣花酸含量測定
２.４.１色譜條件色譜柱ＷｅｌｃｈｒｏｍＣ１８柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流動相０２％磷酸水溶液（Ａ）甲醇（Ｂ），梯度洗脫（０～６ｍｉｎ，５％Ｂ；６～１５ｍｉｎ，５％～７％Ｂ；１５～２０ｍｉｎ，７％～１５％Ｂ；２０～２５ｍｉｎ，１５％～２１％Ｂ；２５～３１ｍｉｎ，２１％～２２％Ｂ；３１～４１ｍｉｎ，２２％Ｂ；４１～４７ｍｉｎ，２２％～２８％Ｂ；４７～５１ｍｉｎ，２８％～３２％Ｂ；５１～５７ｍｉｎ，３２％～３８％Ｂ；５７７０ｍｉｎ，３８％～４５％Ｂ；７０～８０ｍｉｎ，４５％～６５％Ｂ）；檢測波長２７０ｎｍ；體積流量１０ｍＬ／ｍｉｎ；柱溫２５℃；進樣量１０μＬ［１３］。２４２對照品溶液的制備精密稱取鞣花酸對照品適量，置于１０ｍＬ棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度制成濃度為９９μｇ／ｍＬ的鞣花酸對照品溶液。稱定質量，超聲３０ｍｉｎ使溶解，靜置冷卻至室溫，加甲醇補足減失的質量，搖勻，過０２２μｍ微孔濾膜，即得。２４３供試品溶液的制備鮮汁沉淀物：制備方法同２２１項下。鞣花酸提取物：制備方法同２.２.１項下。２.４.４精密度實驗?。玻矗岔椣轮苽涞镊坊ㄋ釋φ掌啡芤哼m量，按２.４.１項下色譜方法條件連續進樣６次，計算相對標準偏差（ＲｅｌａｔｉｖｅＳｔａｎｄａｒｄＤｅｖｉａｔｉｏｎ，ＲＳＤ）。２.４５線性關系考察將“２.４.２”項下制備的鞣花酸對照品溶液，按照“２２１”項下色譜條件進樣，進樣體積分別為３、５、７、１０、１３、１５μＬ，以峰面積為縱坐標（Ｙ），對照品質量濃度為橫坐標（Ｘ），繪制標準曲線。２.４.６重復性實驗取同一批果汁沉淀粉末，按“２.４.３”項下方法平行制備供試品溶液６份，按照色譜方法條件進行測定，計算ＲＳＤ。２５掃描電鏡能譜儀檢測采用掃描電子顯微鏡（ＳｃａｎｎｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＳＥＭ）對余甘子鮮汁沉淀粉末、鞣花酸提取物粉末進行表面微觀分析。分別取干燥后的樣品粉末，將樣品粉末均勻分布于導電膠表面，用洗耳球吹去小顆粒，采用真空鍍膜法在４Ｐａ以下高真空、電流２０ｍＡ條件下噴鍍鉑金屬２ｍｉｎ使樣品導電。儀器的加速電壓為１００ｋＶ，工作距離為９８ｍｍ。在掃描電鏡１０００倍鏡下，聯用能譜儀對余甘子果汁沉淀進行表面元素分析。
３結果
３.１沉淀粉末元素分析
在掃描電鏡５０００倍鏡下，聯用能譜儀對供試品表面元素進行分析。見圖１。元素分析結果發現，沉淀中Ｃ元素相對含量為４３０８％，Ｏ元素相對含量為５３８５％，為主要元素，還含有少量的Ｃｌ，Ｋ等其他元素。見表１。
３.２ＦＴＩＲ結果分析
由沉淀的ＦＴＩＲ譜圖可見，在３２８８１７５０～３４１７３８７０、１７２０２６５０、１４５２１９７０～１６２１９０９０、１１１８５５８０、１０５９７３７０、９１９９１７５、６６７２７７６ｃｍ－１處檢查到主要吸收峰度，其中３２８８１７５０～３４１７３８７０ｃｍ－１是酚羥基拉伸振動吸收峰，１７２０２６５０ｃｍ－１可能為芳香酮振動吸收峰，１４５２１９７０～１６２１９０９０ｃｍ－１為苯環骨架振動吸收峰，１１１８５５８０、１０５９７３７０ｃｍ－１為ＣＯ伸振動吸收峰，９１９９１７５ｃｍ－１可能是ＯＨ彎（面內）振動吸收峰，６６７２７７６ｃｍ－１可能是ＮＨ２振動吸收峰。
３.３沉淀化合物的分析與鑒定
從余甘子鮮汁沉淀物中共鑒定出１２種化合物。見表２。由表２信息可知，余甘子原汁沉淀中鞣花酸占比為３９９１％，為沉淀中天然豐度最高的物質。其次，較高含量的為沒食子酸、檸檬酸、蘋果酸。此外，還檢測到一些氨基酸，例如脯氨酸、谷氨酸、異亮氨酸。
３.４鞣花酸提取工藝篩選與優化
３.４.１方法學考察１）精密度考察：各色譜峰相對保留時間的ＲＳＤ值均＜０１％，相對峰面積的ＲＳＤ均在２０％之內，表明儀器的精密度良好。２）線性關系考察：由“２４５”項下方法得到鞣花酸線性回歸方程為：Ｙ＝９１４１１Ｘ＋１３４７１（Ｒ２＝０９９９２）。結果表明鞣花酸濃度在２９７～１４８５μｇ／ｍＬ內線性關系良好。３）重復性試驗：各色譜峰相對保留時間的ＲＳＤ均＜０１％，相對峰面積的ＲＳＤ均在２０％之內，提示本方法重復性良好。３.４.２純化工藝篩選結果顯示了工藝１（醇提法），工藝２（酶提法），工藝３（堿溶酸沉法）３種工藝提取制備得到的鞣花酸粗品的色譜圖，可直觀看出工藝３對鞣花酸的提取純化效果顯著，因此確定較優工藝為堿溶酸沉法。見圖３。３.４.３堿溶酸沉法工藝優化１）料液比。設置氫氧化鈉溶液濃度為１５％，超聲提?。常埃恚椋?。設置料液比分別為１∶２０，１∶３０，１∶４０，１∶５０?？疾觳煌弦罕葘坊ㄋ岷康挠绊?。由圖４Ａ可以看出，料液比對鞣花酸含量有顯著影響。鞣花酸含量隨料液比增加呈現先增高后降低的趨勢。料液比為１∶４０時，鞣花酸含量最高。當鞣花酸完全溶出后，進一步增加溶劑體積，鞣花酸含量不但不會增加，且還可能由于體積過大，鞣花酸分子分散程度高，不利于后續酸性條件下鞣花酸結晶的析出，呈現下降趨勢。因此，確定較優的料液比為１∶４０。２）超聲提取時間。設置料液比為１∶４０，氫氧化鈉溶液濃度為１５％。設置超聲提取時間分別為１０ｍｉｎ，２０ｍｉｎ，３０ｍｉｎ，４０ｍｉｎ?？疾觳煌曁崛r間對鞣花酸含量的影響。圖４Ｂ為超聲時間對鞣花酸含量的影響。當超聲提取時間為２０ｍｉｎ時，鞣花酸含量呈最大值。因此，確定較優的超聲提取時間為２０ｍｉｎ。３）ＮａＯＨ濃度。設置料液比為１∶４０，超聲提?。常埃恚椋?。設置氫氧化鈉溶液濃度分別為１％，１５％，２％，２５％。考察不同ＮａＯＨ濃度對鞣花酸含量的影響。圖４Ｃ為ＮａＯＨ溶液濃度對鞣花酸含量的影響。鞣花酸含量隨ＮａＯＨ濃度增大呈先升高后降低的趨勢。氫氧化鈉濃度在１％～２％范圍內時，隨著濃度增加，鞣花酸得率呈增長趨勢。當ＮａＯＨ濃度超過２％時，鞣花酸得率顯著降低，這可能與ｐＨ過高導致其他不溶性沉淀溶出，使最終提取物中鞣花酸的含量降低有關。因此，確定２％的ＮａＯＨ溶液較優。３.４.４鞣花酸含量及純度分析本研究對鞣花酸的堿溶酸沉提取純化工藝進行優化，優化得到的工藝參數為：料液比１∶４０（ｇ∶ｍＬ）提取時間２０ｍｉｎ，氫氧化鈉濃度２％。由沉淀物的色譜相關數據計算可得，沉淀中鞣花酸的平均天然豐度為２０１％。以優化后的堿溶酸沉工藝對鞣花酸進行提取，通過色譜相關數據計算得到鞣花酸含量為４７３８％，純度（峰占比）為９４２２％。圖４不同工藝參數對鞣花酸含量的影響注：Ａ不同料液比；Ｂ提取時間；ＣＮａＯＨ濃度
３.５純化前后樣品表面形態分析
采用掃描電子顯微鏡對純化前后的樣品粉末進行分析。由圖５Ｃ和５Ｄ可見，沉淀物粉末顏色呈淡黃色，而純化后的粉末色澤呈深綠色。將提取前的沉淀物粉末與鞣花酸提取物分別置于掃描電鏡下（×１０００）觀察。由圖５Ｅ可見，沉淀物粉末中含有大量晶狀、纖維狀、不規則塊狀的植物組織。由圖５Ｆ可見，提取物粉末主要為柱狀晶體，且部分聚集成簇狀。推測為鞣花酸分子平面聚合形成。
４討論
近年來，我國中藥制藥行業與大健康產業快速發展，已逐漸成為部分地區社會經濟發展的重要引擎之一。但中藥工業化生產階段、生產過程中會產生大量固廢物，這些固廢物由于缺乏有效利用途徑而被廢棄，不僅造成資源的嚴重浪費，還伴隨大量的碳排放［１４］。隨著我國“３０６０雙碳目標”穩步推進，如何實現多層次的中藥生產固廢物資源化利用模
作者:李格菲 譚慶芻 林俊芝 羅傳紅 樊三虎 曹志堅 張定 黃浩洲 韓麗 單位:成都中醫藥大學藥學院 創新產業研究院 西南特色中藥資源國家重點實驗室 成都中醫藥大學附屬醫院 代謝性疾病中醫藥調控四川省重點實驗室 成都市三勒漿藥業集團四川華美制藥有限公司 楚雄州百草嶺藥業發展有限公司
