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摘要：脫氧核酶（deoxyribozymes，DNAzymes）是一類具有催化活性的人造脫氧核糖核酸（DNA），因其在生物傳感領域存在巨大潛力而受到廣泛關注。這些功能性寡核苷酸不僅可以作為特異性的分子識別元件，還能直接通過本身的酶催化活性來報告或者傳遞信號。近年來，基于DNAzyme的生物傳感技術在食品安全領域的研究和應用得到了迅速發展。本文重點關注了近三年來的文獻資料，綜述了DNAzyme的催化機制和生物傳感策略以及它們在食品安全快速檢測中的研究進展，并討論了該生物傳感技術在食品樣品分析物檢測中可能的未來趨勢和發展方向。
關鍵詞：脫氧核酶（DNAzymes）；生物傳感；食品安全；檢測技術；生物傳感器
脫氧核酶（deoxyribozymes，DNAzymes）是一類特殊的功能性寡核苷酸，其依賴于特定的核酸二級構象來發揮酶催化活性，正作為高效的功能元件廣泛應用于生物傳感領域[1,2]。DNAzymes元件經過巧妙設計后，能夠發揮分子識別、信號轉導、信號放大等一種或多種功效，已形成了多種類型的智能生物傳感策略[3]。近年來，DNAzymes生物傳感在食品安全檢測領域展現出了較好的應用前景，已引起眾多研究者的廣泛關注[1]。這些功能性寡核苷酸具有酶的特性，能夠催化各種化學反應，包括對DNA和RNA底物的裂解、連接和磷酸化等。一些DNAzymes的催化活性高度依賴于特定分子的存在，如金屬離子和蛋白質，由于這一特性，這些DNAzymes可以用于開發能夠檢測這些特定分子的生物傳感器。許多DNAzymes顯示出較好的目標選擇性，已被證實能夠有效區分目標物和其他類似物，這使得它們能夠被開發成為具有高特異性的低成本檢測方法。本文對DNAzyme生物傳感主要原理和策略進行了歸納，對食品安全領域中DNAzyme生物傳感技術的相關研究進行了綜述，重點關注了近3年來DNAzyme在食品安全檢測的常見應用，并討論了這種生物傳感技術在未來發展的趨勢和值得探索的方向。
1.基于DNAzyme的生物傳感策略
1.1催化性核酸和DNAzyme的來源
自然界賦予了核酸（包括DNA和RNA）能夠折疊成復雜三維結構的特性，這也是核酸功能多樣性和反應性的重要分子基礎。催化性核酸的發現來自于20世紀80年代末西德尼?奧特曼（SidneyAltman）教授團隊和托馬斯?切赫（ThomasCech）教授團隊關于“RNA具有催化活性”的開創性工作。這類具有催化活性的RNA分子被稱為核酶（ribozymes），打破了“酶的化學本質都是蛋白質”的傳統觀念，奧特曼教授和切赫教授也因相關杰出貢獻而分享了1989年諾貝爾化學獎[4]。在1994年，杰拉爾德?喬伊斯（GeraldJoyce）和羅納德?布瑞克（RonaldBreaker）首次人工篩選出了具有催化活性的DNA分子，這是催化性核酸研究歷史上的另一項重大突破[5]。相較于本質為RNA的核酶可利用酶活位點的核糖核苷酸2'羥基（2'-OH）作為親核基團來發揮催化作用，DNA分子因脫氧核糖核苷酸不含2'羥基而更為化學穩定，也需要依靠更特定的活性中心和分子機制來催化化學反應。事實上，迄今為止自然界中尚未發現具有催化活性的DNA分子。但自1994年以來，研究人員已從人工合成的DNA文庫中成功獲得了大量具有催化活性的DNAzymes[3]。DNAzymes的篩選得益于指數富集的配體系統進化技術（SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)，該技術也被廣泛用來體外篩選適配體、核酶等功能性核酸。雖然SELEX在過去一直是一個較復雜的過程，但多年來這類篩選方法已得到優化，使該過程更為高效[6]。一旦DNAzyme序列被鑒定出來，之后可以很方便地以低成本大量合成產品，這也使得基于DNAzyme的生物傳感器成為商業用途的理想選擇。
1.2基于DNAzyme活性中心構象調控的傳感策略
DNAzyme的酶催化活性高度依賴其催化活性中心的三維構象。以“8-17DNAzyme”這種經典的RNA切割型脫氧核酶為例，其遵循酸堿催化機制，活性中心為DNA單鏈借助非常規的堿基配對而卷曲形成“假結”狀結構，其中G13鳥嘌呤可充當“堿性基團”并通過去質子化作用激活核苷酸的2'羥基[2]。此外，其活性中心內含有二價金屬離子結合口袋，而Pb2+、Mg2+或Mn2+等金屬離子的結合能夠輔助酸堿催化反應。常見的一類DNAzyme生物傳感策略是利用輸入信號來調控DNAzyme催化活性中心的構象變化，包括核酸鏈構象和酶輔助因子結合構象[3]。一些DNAzyme是按照兼具適配功能和催化活性的要求而被篩選獲得，能夠通過結合目標小分子或蛋白所產生別構效應來特異性激活催化活性，它們也因此被稱為適體酶（aptazyme）或別構效應脫氧核酶（allostericdeoxyribozyme）。在更為通用的設計中，額外的核酸適配體或其他功能核酸都可通過堿基互補配對作用來阻止DNAzyme關鍵核酸鏈構象的形成，在輸入信號后可通過適配體競爭反應或核酸鏈置換反應[7,8]來激活DNAzyme的催化活性中心。隨后，響應信號的輸出可很方便地由DNAzyme催化的RNA切割效果來實現（以RNA切割型DNAzyme為例），而被切割的RNA片段也可設計成下一步傳感的啟動端[9]。此外，由于金屬離子是DNAzyme常見酶輔助因子，其金屬離子依賴的催化活性使得DNAzyme很適合用于各種金屬離子的檢測[10]。
1.3G四聯體型DNAzymes作為報告分子
G四聯體（G-quadruplex）與血紅素結合后可以形成一種模擬過氧化物酶的DNAzyme，而G四聯體不像其他類型的DNAzyme那樣序列特異，通常不必要經過精密的體外篩選過程來獲得。其結構基礎是，富含鳥嘌呤(G)的DNA可以通過Hoogsteen氫鍵形成G四分體環狀平面，而兩個或更多的G四分體在陽離子（尤其是鉀）配位作用下，可通過π-π堆疊形成G四聯體結構[11]。G四聯體-血紅素復合形成的類過氧化物酶DNAzyme應用廣泛，在各種各樣的測定中都能被用作比色式信號報告元件。此外，G-四聯體也能與一些熒光染料（包括卟啉類、噻唑橙類、硫磺素類等）結合形成熒光式信號報告元件[12]。
2.DNAzyme生物傳感器在食源性致病菌檢測中的應用
據估計，全世界每年有數億人因食用受污染的食物而患病，造成數十萬人死亡，并在低收入和中等收入國家造成巨大的經濟損失[13]。食源性疾病主要由致病性微生物引起，尤其是大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌等食源性致病菌。此外，隨著耐藥型食源性病原體的出現，抗生素耐藥的食源性感染給食品安全和公共衛生造成巨大威脅，并進一步加重了經濟社會發展的負擔。針對食源性感染開發快速檢測策略是至關重要的，大量基于DNAzyme的生物傳感器已被成功應用于食源性致病菌快速檢測。
2.1大腸桿菌檢測
大腸桿菌作為最常見的食物污染物之一，基于DNAzyme的生物傳感器也被較早地開發用于檢測這種食源性致病菌。TohidF.Didar研究團隊報道了一種食品包裝上的DNAzyme生物傳感器（圖1），通過將能特異性檢測大腸桿菌的熒光DNAzyme探針微陣列共價連接到一層薄的、靈活的、透明的環烯烴聚合物膜上，實現對食品大腸桿菌污染的實時監測[14]。當這種RNA切割型DNAzyme結合大腸桿菌菌體或粗裂解混合物中的目標蛋白時，會活化其催化活性中心的特定三維構象，進而切割熒光-淬滅DNA底物的單個核糖核苷酸位點，使得修飾有淬滅基團的片段分離以產生熒光信號恢復。這種“哨兵式”的食品包裝能夠在不同的pH條件下(pH=3~9)至少穩定14天，可以檢測出肉類和蘋果汁中濃度低至103CFU/mL的大腸桿菌。許文濤研究團隊[15]建立一種基于磁珠、DNAzyme和光致發光三重信號放大的熒光傳感器，用于解決食源性致病菌檢測中靈敏度低的問題。在檢測過程中，大腸桿菌O157:H7特異性RNA切割DNAzyme可以在結合目標蛋白后切割靶RNA，并誘導滾環擴增反應(rollingcircleamplification，RCA)，進而增強銅納米簇發光效應。該生物傳感器在10CFU/mL~103CFU/mL范圍內具有良好的線性關系，檢出限為1.57CFU/mL。
2.2沙門氏菌檢測
沙門氏菌是腸桿菌科的一員，是一種革蘭氏陰性菌。沙門氏菌是食源性疾病暴發的主要原因之一，在有癥狀的食物中毒感染中極為常見[16]。沙門氏菌的檢測是防止其傳播的關鍵，近年來多種DNAzyme生物傳感器也被開發用于沙門氏菌檢測。許文濤研究團隊結合DNAzyme和一種超聚合酶鏈式反應(superpolymerasechainreaction，S-PCR)，構建了一種快速、通用的沙門氏菌視覺檢測方法[17]。通過目標基因啟動S-PCR擴增反應而釋放暴露的G四聯體（G-quadruplex），與血紅素結合后能形成DNAzyme功能結構而發揮類過氧化物酶活性，進而催化底物發生顯色反應。該方法可在基因組提取樣本中可檢出濃度低至1.5拷貝/微升（copies/μL）的沙門氏菌基因組，肉眼即能觀察到這種顏色變化。G四聯體-血紅素結合形成DNAzyme在比色式生物傳感器中常充當酶催化型信號放大元件，也在一項利用TiO2納米顆粒增強重組鏈置換擴增效率的沙門氏菌檢測技術中發揮這類作用[18]。近期，黃加棟研究團隊利用基于雜交鏈式反應(hybridizationchainreaction，HCR)自組裝G四聯體型DNAzyme介導等離子體耦合，建立了一種簡便、快速的鼠傷寒沙門氏菌表面增強拉曼（Surface-enhancedRamanspectroscopy，SERS）檢測策略[19]。此技術通過等溫擴增自組裝DNAzyme作為生物催化劑，將L-半胱氨酸氧化為半胱氨酸，進而實現SERS信號轉導。該檢測方法顯示出較寬的線性范圍(5~105CFU/mL)和較低的檢測限(4CFU/mL，n=5)，其加標回收率為93.1~117%。
2.3金黃色葡萄球菌檢測
金黃色葡萄球菌是一種廣泛存在于食品中的重要致病菌，攝入被金黃色葡萄球菌污染的食物可以導致菌血癥、肺炎，甚至死亡[20]。近期干寧研究團隊開發了一種基于攪拌棒富集和DNAzyme輔助點擊化學反應的超靈敏微流控免疫傳感器，能實現對金黃色葡萄球菌的即時檢測[21]。該方法利用4-巰基苯硼酸（4-mercaptophenylboronicacid）功能化攪拌棒富集細菌，繼而將卵黃抗體(免疫球蛋白Y)和銅標記的聚多巴胺納米顆粒與被捕獲的菌體特異性結合。在酸性條件下能釋放的二價銅離子，使得經炔基修飾的DNAzyme和經疊氮修飾的鏈霉親和素-生物素復合物之間進行基于銅催化的疊氮-炔基環加成(Cu(I)-catalyzedazide-alkynecycloadditions，CuAAC)反應。最后，通過微流控芯片檢測DNAzyme-鏈霉親和素復合物來定量檢測金黃色葡萄球菌。在最佳條件下，該免疫傳感器對金黃色葡萄球菌的檢測限為3CFU/mL，檢測范圍在10~2.5×104CFU/mL之間。
2.4副溶血性弧菌檢測
副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，是蝦、魚、蟹、貝類等海產品中常見的主要病原體之一，食用被副溶血性弧菌污染的食物可能導致人類胃腸道紊亂[22]。近年來已開發出一些DNAzyme生物傳感器，能夠及時、靈敏、準確地檢測副溶血性弧菌。一種檢測副溶血性弧菌的比色型適配體傳感器已被報道[23]，其利用核酸適配體偶聯磁性納米顆粒捕獲副溶血性弧菌，并因競爭作用而釋放含有G四聯體成分的cDNA，借助G四聯體-血紅素形成的DNAzyme催化過氧化物酶底物產生顏色信號。該檢測方法在最佳條件下，線性范圍為102~107CFU/mL，檢出限可低至10CFU/mL，可被應用于污染三文魚樣品中副溶血性弧菌的檢測。此外，張芳團隊在等溫擴增G四聯體比色傳感器中引入CRISPR技術，通過CRISPR/Cas12a特異性識別環介導等溫擴增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）產物而反式切割G四聯體，進而阻斷DNAzyme以及相應的類過氧化物酶活性的形成[24]。該級聯方法被報道具有檢出蝦樣品中6.1×102CFU/mL副溶血性弧菌的能力。干寧研究團隊則將等溫擴增生成G四聯體的比色策略與微流控技術相結合，建立一種現場雙模式快速檢測方法，能夠實現對副溶血弧菌的裸眼篩查和定量分析[25]。
2.5單核增生李斯特菌檢測
單核增生李斯特菌是最常見的食源性致病菌之一，可以導致腹瀉、敗血癥和腦膜炎[26]。其具有低溫抗性，可以在低至0~4℃的冷藏溫度下生長[27]，是凍肉、冰淇淋、即食食品等冷凍食品的重要污染風險。劉戰民團隊結合LAMP等溫擴增和DNAzyme級聯催化作用開發了一種原位信號放大電化學技術，用于無標記檢測單增李斯特菌[28]。其陽性結果可通過顏色變化進行判讀，并可通過電化學方法進一步定量分析，其檢出限為6.8CFU/mL，對52.5~5.25×104CFU/mL的細菌具有良好的靈敏度。
3.DNAzyme生物傳感器在真菌毒素檢測中的應用
真菌毒素是真菌產生的有毒次生代謝物，會污染各種食物，包括干果、谷物和葡萄酒[29]。大量研究表明，許多真菌毒素具有致癌性、肝毒性、腎毒性和免疫毒性?？紤]到其潛在的毒性作用，谷物中幾種真菌毒素的最高可接受濃度已確立，如黃曲霉毒素B1(aflatoxinB1，AFB1)為2μg/kg，赭曲霉毒素A(ochratoxinA，OTA)為5μg/kg，玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)為100μg/kg[30,31]。目前，真菌毒素監測的常規分析方法主要有高效液相色譜、氣相色譜串聯質譜和高效液相色譜串聯質譜、薄層色譜、毛細管電泳等[32]。近年來研究者已經成功地設計了幾種DNAzyme適配體生物傳感器，用于對真菌毒素的快速檢測。3.1黃曲霉毒素B1檢測黃曲霉毒素是黃曲霉菌和寄生曲霉菌產生的強毒性次生代謝產物，其中以黃曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）毒性最強、分布最廣，已被國際癌癥研究機構列為1類致癌物[33]。陳曉青團隊近期開發了一種基于適配體和G四聯體型DNAzyme催化探針，配合基于磁性氧化多壁碳納米管（magneticoxidizedmultiwallcarbonnanotubes，Fe3O4@oMWCNTs）的樣品前處理技術，建立了食品樣品中AFB1檢測平臺[34]。該探針在血紅素和鉀離子存在下能夠高效催化底物發生顏色反應，而通過磁性氧化多壁碳納米管的連續吸附和磁分離，可以有效地弱化過量血紅素相關的高信號背景問題。該檢測方法對AFB1具有較高的選擇性和靈敏度，其檢測限為0.02ng/mL。
3.2赭曲霉毒素A檢測
赭曲霉毒素是由曲霉屬、青霉屬真菌產生的有毒次級代謝產物，其中以赭曲霉毒素A(ochratoxinA，OTA)毒性最大，具有致畸性、致癌性和致突變性，被歸類為2B類致癌物[35]。近期，馮亮團隊將金納米團簇生長在由ZIF-8金屬有機框架（metal-organicframeworks，MOFs）衍生的多孔碳上，形成納米固相載體，并相繼通過金硫鍵修飾和核酸雜交在納米載體固化OTA特異性適配體和cDNA，這樣的核酸雜交雙鏈結構還對血紅素起到“看門人”作用[36]。當OTA存在的情況下，雙鏈雜交“看門人”結構被破壞，并裸露出大量G四聯體結構，結合血紅素后能原位形成DNAzyme。此“看門人”策略簡化了DNAzyme封裝過程，減少了非靶標響應性探針泄漏。由于DNAzyme具備電子傳遞功能和類過氧化物酶活性，該團隊建立了一種雙模式紙基分析裝置，在1pg/mL~500ng/mL和50pg/mL~500ng/mL范圍內，可實現對OTA的高靈敏電化學檢測和可視化檢測。
3.3玉米赤霉烯酮檢測
玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一種常見的真菌毒素，廣泛存在于玉米、大麥、小麥等谷物中，其具有雌激素樣分子結構，能擾亂生物體生殖激素平衡，引起生殖功能障礙[37]。王周平研究團隊近期利用刺激響應型適配體功能化MOFs納米材料和復合DNAzyme探針，建立了一種用于ZEN檢測的高效比色傳感器[38]。該傳感器集合了ZEN特異性適配體的良好親和力、MOFs的超高負載能力以及G四聯體型DNAzyme優異的催化能力，對多種真菌毒素和常見食品成分的干擾具有良好的特異性，在最佳條件下，對ZEN的檢測線性范圍為0.01~100ng/mL,最低檢出限為0.36pg/mL，能夠有效應用于實際樣品中ZEN的定量檢測。
3.4真菌毒素多重檢測
在當前食品安全領域，針對多種真菌毒素混合污染的多重檢測仍是一個重要挑戰。如圖2所示，陳俊華研究團隊基于催化發夾自組裝（catalytichairpinassembly，CHA）和DNAzyme切割活性建立了真菌毒素檢測傳感系統[31]，在最佳條件下，對OTA、AFB1、ZEN的檢出限分別為0.2pM、0.13pM和0.17pM，并具有較好的特異性和靈活性。該團隊進而以OTA、AFB1、ZEN作為輸入元件，以0和1編碼真菌毒素，通過“AND-INHIBIT”、“INHIBIT-OR”、“OR-AND”和“OR-INHIBIT”邏輯運算，構建了多串聯分子邏輯門。該分子邏輯門具有多種功能，為真菌毒素的多重檢測提供了一種通用的傳感策略。
4.DNAzyme生物傳感器在食品中重金屬檢測的應用
由于很多情況下DNAzyme的催化活性高度依賴特定的金屬離子，DNAzyme生物傳感器很早就被用于金屬離子的檢測，特別是針對容易引起慢性中毒的鉛（Pb）、汞（Hg）等重金屬。水和土壤等環境中鉛、汞污染往往容易富集到食品中，可對人體健康造成嚴重威脅，對其進行高效、高靈敏的檢測至關重要。近年來，為了提高DNAzyme生物傳感器檢測重金屬的靈敏度，研究人員的開發了多種信號放大方法來滿足相應的實際檢測需求。段憶翔團隊結合DNAzyme介導的RNA切割策略和退火加速DNA雜交鏈式反應(annealing-acceleratedhybridizationchainreaction)，建立了針對Pb2+的無標記、無酶比色法檢測方法[39]。DNAzyme的底物核酸鏈作為一種觸發DNA，可以有效地啟動雜交鏈式反應。然而，當Pb2+存在時，DNAzyme將底物核酸鏈切割而導致雜交鏈式反應效率顯著下降，并最終引起膠體金納米粒子的顏色變化。該方法對Pb2+的檢測可在30分鐘左右完成，肉眼可直接識別出顯著的顏色變化。鄧銳杰團隊報道了一種無標簽、雙擴增的DNAzyme生物傳感方法，用于鉛污染的高靈敏“一鍋法”檢測[40]。該方法采用外切酶I介導的結構響應DNA切割來監測Pb2+輔助DNAzyme催化的無標記底物裂解過程，從而進一步放大響應信號。此方法可以檢測低至0.12nM的Pb2+，檢測范圍為0.1nM至30nM，并能夠準確檢測自來水、牛奶和魚肉中的Pb2+。針對DNAzyme易受環境中核酸酶消化以及生物穩定性不足等問題，研究人員通過將核酸底物和DNAzyme整合到單鏈序列中，并進行環化改造形成閉環的DNAzyme[41]。這種環狀DNAzyme由于其穩定的分子內雙鏈形成和封閉的結構對核酸酶消化具有優異的抗性，并可以在更寬的溫度、鹽濃度和pH范圍內發揮切割活性。該研究將這種環狀DNAzyme配合末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)生成G四聯體，建立了一種用于Pb2+定量檢測的無標記比色傳感平臺（圖3），檢出限為0.085nM；進一步引入酶切循環擴增以提高信號放大效率，可使傳感器的檢出限達到0.0015nM。近期，研究人員還報道了一種基于鏈置換擴增(stranddisplacementamplification，SDA)和雜交鏈式擴增(HCR)級聯信號放大的DNAzyme熒光超靈敏傳感器[42]，其對Pb2+的檢測范圍為16.8pM，在50pM到500nM范圍內具有良好的線性關系，且具有良好的選擇性。另有一種結合DNAzyme和CRISPR系統的高靈敏度鉛離子檢測方法也在近期被開發出來[43]，當鉛離子被識別，其激活的DNAzyme會催化底物鏈斷裂，導致單鏈DNA的釋放，并與Cas蛋白/前導RNA結合形成功能復合物，進而激活CRISPR系統的反式切割活性以實現信號放大。
5.DNAzyme生物傳感器在抗生素檢測中的應用
抗生素具有良好的藥代動力學特性，在人和動物的醫療領域已廣泛應用多年。由于濫用抗生素治療疾病和催促禽畜生長，存在于復雜環境和食品基質中的抗生素殘留已對公眾健康構成嚴重威脅[44]。因此，開發有效的方法，對食品樣品中可能存在的抗生素殘留進行準確、方便的檢測，對其質量監測具有重要意義。
5.1氯霉素檢測
氯霉素是一種廣譜抗生素，作為一種低成本、高效的藥物被廣泛應用于食用動物的治療。因此，微量的氯霉素可在肉類或牛奶中聚集，并可能通過食物鏈在人體內積聚，對人體健康造成潛在風險[45]。現有的氯霉素檢測方法，如色譜、免疫學等，可能需要復雜的樣品制備、昂貴的儀器和繁瑣的檢測程序[46]。李根喜研究團隊將DNA/金屬離子相互作用和銀離子依賴DNAzyme介導的信號擴增相結合，建立了檢測氯霉素的新方法[47]。當氯霉素被DNA適配體特異性識別后，DNA適配體中C-Ag+-C堿基錯配形成的二級結構會發生改變，釋放出預先捕獲的Ag+。隨后，游離的Ag+作為輔助因子可以激活Ag+依賴的DNAzyme，使其在電極表面進行底物DNA的快速切割，實現高效的信號放大。
5.2四環素檢測
四環素類抗生素在畜牧業領域常被用于治療細菌感染和促進動物生長，然而，四環素的濫用易導致其在許多動物性食品如牛奶、雞蛋、蜂蜜和豬肉中殘留，可通過食物鏈進一步進入人體，引起一些嚴重的疾病，如肝損傷、過敏反應、腸道菌群紊亂等[48]。此外，濫用四環素也可能促進細菌的耐藥性，從而降低藥物的治療效果。吳遠根研究團隊提出了一種基于G四聯體型DNAzyme的超靈敏比色生物傳感器，用于四環素(tetracycline)、土霉素(oxytetracycline)、金霉素(chlortetracycline)和多西環素(doxycycline)等四環素類抗生素的高靈敏快速檢測[49]。由于血紅素和G四聯體組成的DNAzyme具有類過氧化物酶催化活性，而四環素可以與血紅素結合形成穩定的絡合物，降低DNAzyme催化活性，使得顯色反應受到抑制。該比色型生物傳感器對四環素的檢測限為3.1nM，在實際樣品中對四環素的平均回收率為89%~99%。另有研究結合Mg2+依賴的DNAzyme和催化發夾組裝(CHA)等溫擴增技術，建立了乳品中四環素的無酶雙擴增高靈敏檢測方法[50]。通過四環素與特異性適配體競爭性結合，使得DNA1釋放并與DNA2雜交形成DNAzyme結構，隨后裂解底物而引發CHA反應，不斷釋放G四聯體結構，在配合血紅素形成DNAzyme催化后續的比色反應。在最佳條件下，該方法對四環素的檢測范圍在1pM~10nM之間，檢出限為0.89pM，對四環素有較高的選擇性。
5.3卡那霉素檢測
卡那霉素是一種典型的氨基酸類抗生素，因其對革蘭氏陰性菌具有較強的抑制作用而在畜牧業中被廣泛應用?？敲顾卦谌梭w內累積可引起聽力損傷、腎功能紊亂等多種副作用。目前，在動物類食品中檢測卡那霉素主要依靠高效液相色譜法、氣相色譜法、酶聯免疫吸附法、表面等離子體共振法等方法。但這些方法仍存在一些不足，如耗時、操作復雜、設備昂貴等，特別是檢測生物樣品中極低含量的卡那霉素[51]。唐盛團隊報道了一種多重級聯擴增DNAzyme比色式傳感器，用于卡那霉素的超靈敏檢測[52]。該方案通過兩個卡那霉素適配體觸發的競爭反應，使得Ni-Fe層狀雙氧化物(layereddoubleoxides，LDO)上形成G四聯體和DNA發夾（hairpin）結構，進而依靠靜電作用自組裝成三維G4/LDO框架結構，形成一種具有增強型類過氧化物酶催化活性的新型DNAzyme，用于卡那霉素的比色法檢測。在最佳實驗條件下,該方法顯示出高靈敏度,其檢測范圍在10fM至10nM之間(R2=0.992)，檢測限為3fM(S/N=3)。蔣炳英團隊開發了基于引物交換反應(primerexchangereaction，PER)信號放大技術和Mg2+依賴DNAzyme的無標記、高靈敏度的牛奶樣品中卡那霉素熒光檢測平臺[53]。當卡那霉素與適配體結合，暴露了DNA發夾模板上的引物結合位點，隨后引發PER反應，借助Bst-DNA聚合酶催化作用在恒溫條件下自組裝Mg2+依賴的DNAzyme結構。不斷生成的大量DNAzymes在Mg2+輔助下能夠切割發夾底物的rA位點，釋放大量暴露的G四聯體片段，后者在與有機染料硫黃素(thioflavinT)結合后會產生顯著增強的熒光。該方法對卡那霉素的檢出限為0.36nM，對卡那霉素和其他抗生素表現出良好的選擇性。賴國松研究團隊將核酸外切酶III催化的Zn2+依賴DNAzyme釋放與DNAzyme驅動的鏈置換反應(SDR)相結合，建立了一種用于卡那霉素檢測的新型比色生物傳感器[54]。當卡那霉素與DNA發夾（hairpin）發生特異性識別反應時，含有DNAzyme結構的核酸鏈可以被外切酶III催化釋放。隨后DNAzyme能催化兩個寡核苷酸發生連接反應并觸發SDR反應，導致兩種修飾有DNA連接子的金納米顆粒發生聚集。該方法顯示了5個數量級的寬線性范圍，檢測限可達8.1fg/mL，具有良好的選擇性、重復性和可靠性。
6.DNAzyme生物傳感器在農藥檢測中的應用
有機磷農藥（organophosphoruspesticide，OPs）是一大類含有磷元素的有機化合物農藥，由于其成本低、易合成、殺蟲效率高，因而被廣泛應用作殺蟲劑和除草劑。然而，有機磷農藥在各種環境(水、土壤和大氣)中的殘留對生態系統和食品安全構成了重大風險[55]。特別是OPs可以使乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)磷酸化，不可逆地抑制AChE活性，在造成中毒時可導致乙酰膽堿在神經系統、肌肉和腺體中積累，嚴重危害人體健康并可能造成致命后果[56]。當前檢測OPs的氣相色譜和氣相色譜-質譜聯用方法雖然具備高靈敏度和高特異性，但需要復雜和昂貴的設備、熟練的操作人員和較繁瑣的前處理步驟，而傳統酶抑制法對OPs的檢測難以滿足靈敏度方面的需求。為了克服這些缺點，近年來基于DNAzyme生物傳感器已被開發用于超靈敏檢測有機磷農藥。基于核酸外切酶輔助的雙信號級聯擴增和DNAzyme自組裝，研究人員構建了一種用于馬拉硫磷超敏檢測的無標記化學發光傳感器[57]。該方案將G四聯體/血紅素形成的DNAzyme巧妙地編碼到核酸發夾探針中，進而控制催化化學發光信號的輸出。其所設計的雙信號放大策略利用外切酶I和外切酶III，分別實現了目標物和次級目標物的循環利用，大大提高了適配體傳感器的檢測靈敏度。在最佳實驗條件下，該DNAzyme傳感器對馬拉硫磷具有良好的線性響應能力，檢出限為0.47pM，相對標準偏差為4.2~6.9%。焦必寧團隊結合DNAzyme和CRISPR-Cas12a技術開發了高靈敏的酶抑制法有機磷農藥熒光檢測方法[58]。該方案設計了一種雙酶級聯反應來激活CRISPR-Cas12a系統，包括乙酰膽堿酯酶（Ache）介導的MnO2納米片降解生成Mn2+和Mn2+激活DNAzyme切割活性。DNAzyme催化產生的短DNA鏈與前導crRNA雜交，從而激活CRISPR-Cas12a系統反式切割熒光-淬滅探針。在最優條件下，該方法對氧磷、敵敵畏和內吸磷的檢出限分別為270、406和218pg/mL。得益于二氧化錳納米片的優異性能和多級聯酶促信號放大策略，此熒光分析方法在食品中有機磷農藥的檢測中具有巨大的潛力。
7.DNAzyme生物傳感器在其他食品污染成分檢測中的應用
7.1環境內分泌干擾物檢測
雙酚A(bisphenolA，BPA)是一種典型的環境內分泌干擾物，在工業上常用于環氧樹脂和聚碳酸酯等高分子材料生產，容易在食品包裝、飲料瓶、奶瓶等處存在殘留[59]。雙酚A在很低劑量下就會對人類健康產生不利影響，BPA的過量暴露可引起機體的生殖系統和免疫系統紊亂，也可能與某些類型的腫瘤相關[60]?？煽?、高靈敏的雙酚A檢測方法對保護食品安全和人類健康具有重要意義，傳統的BPA檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、液相色譜-質譜聯用法[61]。作為傳統技術的替代方案，近年來陳俊華團隊開發了基于DNAzyme生物傳感的檢測方法用于雙酚A檢測[62]。該方案采用抗BPA適配體作為特異性識別元件，通過將競爭反應激活了基于黏性末端介導鏈置換（toehold-mediatedstranddisplacement）的反應回路，并自組裝形成Mg2+依賴的DNAzyme功能結構，進而切割熒光-淬滅探針來產生信號輸出。該生物傳感器具有較高的靈敏度，檢測限為50fM，檢測線性范圍為100fM~1μM，在牛奶樣品中BPA定量檢測中顯示的回收率為94%~106.4%。
7.2細菌內毒素檢測
脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，也被稱為內毒素，是所有革蘭氏陰性細菌外膜的組成部分，是一種毒性極高的炎癥刺激物，與發燒、腹瀉和低血壓等食源性疾病密切相關。目前，鱟試劑是分析LPS的常見方法，但它對pH值、溫度以及其他干擾因素高度敏感。免疫分析法也被用于LPS的分析，但大多需要繁瑣的操作步驟。近年來，基于DNAzyme光學和電化學傳感器被開發用于LPS的快速檢測。張娟團隊設計并構建了一種腙化學（hydrazonechemistry）連接的DNAzyme，通過將DNAzyme設計為兩個分別經過醛基和肼基修飾的片段，它們可以通過腙化學反應連接在一起，而LPS的存在可以阻抑此連接反應[63]。利用這一特性結合DNAzyme切割單鏈核酸的催化能力，構建了腙化學輔助DNAzyme對軟飲料樣品中LPS和5-羥甲基糠醛的檢測方法。該團隊近期還報道了DNAzyme發揮催化作用的同時會釋放氫氧根離子的機制，設計了氫氧根離子釋放介導的比色策略，并將此策略成功地用于LPS的快速檢測[9]。該檢測方法通過將DNAzyme設計為兩個分別經過醛基和羥胺基修飾的片段，它們可以通過肟化學（oximechemistry）反應連接在一起，而LPS的存在可以阻抑此連接反應。利用這一特性配合DNAzyme氫氧根離子釋放的機制，可簡便地對LPS信號進行捕獲、輸出和放大，從而實現對LPS準確、靈敏的檢測。
7.3放射性核素檢測
放射性核素能夠嚴重污染環境，通過在土壤、地下水和海水中的遷移和累積，最終可進入食物鏈和人體[64]。環境和食物鏈中的鈾污染嚴重威脅公共安全和人類健康，攝入鈾化合物可導致機體腎臟、肝臟、骨骼、肺和神經系統造成嚴重損傷。定量檢測鈾污染的常見方法有電感耦合等離子體質譜法(Inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS)、X射線熒光法和原子發射光譜法等，但存在儀器昂貴、樣品前處理復雜等問題。鄧銳杰研究團隊報道了一種基于G四聯體型DNAzyme的無標記比率型生物傳感器，能夠精確檢測鈾污染和生物吸附[65]。該方案通過UO22+激活DNAzyme的催化作用而剪切底物鏈，并利用分裂的兩種G四聯體探針來感應DNAzyme剪切反應。隨后利用DNA雙鏈染料（SYBRGreenI）和G四聯體染料（N-methyl-mesoporphyrinIX）來測定DNAzyme探針的雙鏈結構和G四聯體結構，從而以比率法檢測UO22+。歸因于酶催化反應和熒光測定步驟的分解，該方法在較寬的溫度范圍內（18℃~41℃）都能穩定地檢測UO22+，對UO22+和Hg2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+、Pb2+、Co2+、Ni2+、Al3+等金屬離子具有較高的選擇性，并能定量且準確地檢測水體和魚類中的鈾污染。
8.結語
本文綜述了基于DNAzyme功能元件的生物傳感設計策略，重點介紹了DNAzyme生物傳感在食源性致病菌、真菌毒素、重金屬離子、抗生素、有機磷農藥等食品污染成分檢測方面的最新進展。DNAzymes的催化活性依賴于核酸序列、三維構象以及相應的輔助因子，而其催化的化學反應包括RNA切割、DNA切割、DNA或RNA連接、DNA磷酸化以及基于G四聯體的類過氧化物酶反應。在巧妙設計下，DNAzyme可以通過構象變化和級聯反應完成信號的傳導和放大，使得其在作為生物傳感器時可以進行高靈敏的檢測。此外，DNAzymes還具有良好的熱化學穩定性、易于分子修飾、合成成本低廉等優點，方便與核酸擴增等信號放大手段配合，也很容易集成到比色法、熒光法和電化學法等分析報告系統。這些優勢使得DNAzyme傳感非常適合于建立簡單便攜的檢測設備，如手持式閱讀器，側流層析裝置，紙基微流控等。綜上所述，多種基于DNAzyme的生物傳感器已成功應用于食品安全檢測，其在現實應用中的靈敏度、特異性和可行性也迅速發展。為了在防衛食源性疾病和避免食物浪費之間做好平衡，開發食品包裝內傳感器有很好的應用前景，有望實現不需要打開包裝而輸出易于檢測的污染和變質信號[14]。這些柔性包裝上反映食品安全和新鮮的動態指標，將可能打破食品安全對固定、粗略保質期的依賴。在當前食品安全領域，針對多種真菌毒素混合污染的多重檢測仍是一個重要挑戰?？紤]到DNAzyme在合適設計下能夠一并發揮分子識別、信號轉導、信號放大中的數種功能，最近研究人員結合DNA邏輯門等策略開發了用于真菌毒素多重檢測的DNAzyme傳感器[31]，這些研究為實現靈活的多重檢測提供了通用方案，有望在更多目標物和更多領域擴展研究和應用。研究人員通過將DNAzyme和核酸底物整合成單鏈閉環的DNA探針，使得DNAzyme抵抗環境中的核酸酶消化[41]。將DNAzymes的結構改造成三維形式，也可能不依賴化學修飾而提高固相對DNAzymes的吸附，抑制非特異性蛋白吸附而提高信噪比。盡管近年來DNAzyme傳感取得了巨大的進步，但很少有報道這類傳感器達到酶或抗體傳感器的商業化水平[3]。為了滿足對真實樣品的實際檢測需求，DNAzyme生物傳感技術仍存在一些難點亟待解決：1）雖然DNAzymes能夠在較寬泛的條件下保存，但大多數報道的DNAzymes的實際酶活強度受離子濃度、緩沖體系、pH值和溫度等因素的影響較為顯著；2）對于需要使用有機溶劑來前處理食物樣品的檢測目標物，DNAzymes對有機溶劑的耐受性仍相對不足；3）在許多DNAzyme傳感策略中，DNAzymes需要固定在固相界面上，因而不同批次的固定化效果差異以及非特異性吸附問題等會直接影響整體催化模塊的響應性能或者產生相應的測量誤差；4）食品安全快速檢測的操作環境一般較少排除環境核酸酶的影響，耐受環境核酸酶的DNAzymes還相對較少；5）大多數DNAzymes的催化活性相對不足，難以滿足快速高靈敏檢測需求；6）對于食源性致病菌選擇性適體酶（aptazyme），選擇性區分致病菌、非致病菌甚至耐藥菌仍存在挑戰，已獲得的這類DNAzymes的數量仍難以滿足食源性致病菌的多重檢測實際需求。針對這些限制著DNAzyme傳感應用的難點問題，較為根本的解決辦法指向DNAzymes的人工篩選階段，使用更低的目標濃度和更短的反應時間以及更嚴格更先進的體外篩選體系可能是未來發展趨勢。另一方面，為DNAzyme修飾額外的官能團也可能直接提高其催化活性或其他功能。此外，針對食物樣品復雜基質的配套前處理技術和配套工作緩沖體系對于DNAzyme傳感器的商業化也至關重要。隨著對DNAzyme傳感技術和檢測裝置的不斷發展，其他如樣本采集、樣品預處理、多路復用等功能也會逐漸被集成，基于DNAzyme生物傳感小型化檢測設備有望在將來加快實現商業化。
作者:邵芙蓉 趙尊全 白家磊 曹高芳 高志賢 單位:濱州醫學院公共衛生與管理學院 事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所
