前言：尋找寫作靈感？中文期刊網用心挑選的維氏氣單胞菌致病性與耐藥性，希望能為您的閱讀和創作帶來靈感，歡迎大家閱讀并分享。
維氏氣單胞菌隸屬弧菌科(Vibrionaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，為革蘭陰性桿菌，兼性厭氧型。氣單胞菌廣泛存在于各種水體生態系統中，比如淡水、沿海水域以及污水中［1］，能夠經常從腹瀉的人類［2］以及出血性敗血癥的魚類中分離到［3］。研究表明，嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌以及維氏氣單胞菌為3種主要的致病性氣單胞菌，涵蓋了氣單胞菌中85%的臨床病癥來源［4］。目前在水產動物養殖上，對于氣單胞菌致病性的研究主要為嗜水氣單胞菌［5］，對維氏氣單胞菌的致病性及分布關注并不多。團頭魴(MegalobramaamblycephalaYih)隸屬硬骨魚綱鯉形目鯉科鳊亞科，是我國重要的草食性經濟魚類之一，具有味美、生長快、抗病力強等特點，是江蘇省南部地區的主要淡水養殖品種。出血病是團頭魴養殖過程中危害最嚴重、造成經濟損失最大的病害，通常認為由嗜水氣單胞菌引起［6］，使用抗生素進行防治［7］。然而，隨著養殖密度的擴大、養殖水體的惡化以及抗生素的濫用，團頭魴出血病呈常發、難治的態勢。本研究在江蘇省常州市武進區某團頭魴養殖塘剛剛出現出血病后，即對該塘口的不同生態位進行細菌分離、鑒定及人工感染試驗，同時分析菌株的毒力基因及耐藥性，以期為團頭魴出血病的發病機理及分子流行病學研究提供基礎數據，為該病的防控提供一定的理論基礎。 1材料與方法 1．1發病塘口及菌株 2010年7月11日常州武進某團頭魴池塘出現大批團頭魴死亡的情況。塘口檢查發現病魚游動緩慢，攝食減少，腸道內食糜少或無，體表腹部、尾鰭以及鰓部有出血點，部分有大面積的皮膚潰爛。解剖檢查發現一部分病魚肝臟發白、腫大，一部分有溶血性腹水。采集該池塘病魚21尾，利用選擇性培養基分離細菌，分離位點包括魚的腸道、體表黏液、鰓、腹腔、肝臟、腎臟等。同時采集該池塘的水樣、底泥，利用選擇性培養基分離水體、浮游生物和底泥中的細菌。 1．2主要試劑及培養基 細菌生化鑒定管、藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司，細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，RS培養基［8］、LB培養基為本課題組配制。 1．3細菌的分離、篩選 病魚腸道、體表黏液、鰓、腹腔、肝臟、腎臟等位點用接種環劃線RS固體培養基;將池塘水經25μm的膜或者濾紙過濾后，水體位點的菌株用過濾后的水涂RS培養基;浮游生物位點則是將濾紙浸入無菌生理鹽水、振蕩后，劃線RS固體培養基;底泥經無菌生理鹽水稀釋后涂RS培養基。RS培養接種后，28℃培養24h。隨機挑選5個單菌落劃線接種LB固體平板。用氧化酶、接觸酶、O/F、鳥氨酸脫羧酶對單菌落作進一步篩選，鳥氨酸脫羧酶陽性為維氏氣單胞菌區別與其他氣單胞菌的主要生化特性［9］。對4個生化指標都為陽性的菌株接種LB液體，28℃培養24h后，用15%液體甘油－80℃保存備用。 1．4維氏氣單胞菌鑒定 1．4．1細菌DNA模板的制備 將保存在－80℃中的菌株，接種LB液體培養基，28℃培養18h，離心收集菌體，參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌總DNA，作為DNA模板。 1．4．2維氏氣單胞菌管家基因測序與系統發育樹的構建 根據氣單胞菌16SrDNA和管家基因gyrB，通過構建系統發育樹鑒定細菌菌株。16SrDNA引物為AER－F(5'－CTACTTTTGCCGGCGAGCGG－3');AER－R(5'－TGATTCCCGAAGGCACTCCC－3')［10］由上海生工合成。反應條件:94℃變性2min;接著30個循環:94℃30s，58℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。取2μLPCR產物，用1．2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統拍照，片段大小953bp。有目的片段則判斷該菌株為氣單胞菌屬。管家基因gyrB擴增引物:gyrB－3F(5'－TCCGGCGGTCTGCACGGCGT－3')和gyrB－14R(5'－TTGTCCGGGTTGTACTCGTC－3')［11］由上海生工合成。反應條件:94℃變性2min;接著30個循環:94℃30s，59℃30s，72℃90s;最后72℃延伸10min。取2μLPCR產物，用1．2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統下拍照，片段大小為1100bp。PCR產物純化后送上海生工序列測序。系統發育樹的構建:將測序菌株的gyrB序列用Blast軟件與GenBank數據庫中相關的親近物種進行相似性分析，并用Mega4．1中的Neighbor－Joining法構建系統進化樹。 1．4．3維氏氣單胞菌的生化特性 將菌株接種生化培養管后，28℃培養24h，觀察并記錄結果。生化特性包括賴氨酸脫羧酶、苯丙氨酸轉氨酶、硝酸鹽(還原)、硫化氫、明膠、葡萄糖、乳糖、β－半乳糖苷(ONPG)、山梨醇、赤鮮醇、衛矛醇、丙二酸鹽等。 1．5維氏氣單胞菌的人工感染 對確定為維氏氣單胞菌的菌株進行人工感染試驗，驗證其致病性。具體方法為:將菌株單菌落接種LB液體培養基，28℃培養20h，將細菌濃度稀釋為109CUF/mL。每個菌株腹部肌肉注射5尾魚，魚體重(100±3)g，注射劑量為每100g魚體重0．5mL菌株。然后觀察魚的發病、死亡情況，統計24h、48h的死亡率，并對人工感染后具有典型癥狀的死魚進行拍照、解剖以及優勢菌的分離鑒定。 1．6維氏氣單胞菌毒力基因的檢測 用PCR檢測氣單胞菌的2種主要毒力基因。溶血素基因hly，片段大小597bp。引物為hly－F(5'－GGCCGGTGGCCCGAAGATACGGG－3')和hly－R(5'GGCGGCGCCGGACGAGACGGG－3')［12］。反應條件:94℃變性3min，接著30個循環:92℃30s，65℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。細胞興奮性腸毒素基因alt，片段大小442bp。引物為alt－F(5'－TGACCCAGTCCTGGCACGGC－3')和alt－R(5'－GGTGATCGATCACCACCAGC－3')［13］。反應條件:94℃變性3min;接著30個循環:92℃30s，60℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。 #p#分頁標題#e# 1．7維氏氣單胞菌的藥敏試驗 吸取28℃培養24h的維氏氣單胞菌的菌懸液100μL，均勻涂布LB平板，每個菌株藥敏做3個重復，將選取的11種藥敏紙片貼于平板上，于28℃恒溫培養24h后測量抑菌圈直徑，判斷菌株對抗生素的敏感性。 2結果與分析 2．1維氏氣單胞菌的篩選、鑒定 通過RS培養基和氧化酶、接觸酶、O/F等氣單胞菌主要生化特性的初篩選，以及鳥氨酸脫羧酶陽性等生化鑒定，得到56株疑似維氏氣單胞菌。將56株疑似維氏氣單胞菌菌株進行了管家基因的擴增，PCR產物純化后送上海生工測序，擴增片段大小1100bp(圖1)。將測序的結果在GenBank中進行同源性檢索，并將它們與部分具有登錄號的標準株進行系統發育樹分析，最終確認該56株細菌都為維氏氣單胞菌，部分菌株系統發育樹見圖2。不同生態位維氏氣單胞菌聚類在一起。 2．2不同生態位維氏氣單胞菌的分布情況 從不同生態位共分離得到56株維氏氣單胞菌，其中腸道中菌株數量最多，為19株;其次為鰓、體表黏液、底泥、浮游生物，分別為13、12、6、3株;腹腔、肝臟、腎臟和水中很少，都只有1株維氏氣單胞菌。 2．3維氏氣單胞菌的生化特性 絕大部分菌株具有維氏氣單胞菌標準株的生化特性，表現為賴氨酸脫羧酶(+)、苯丙氨酸轉氨酶(－)、硝酸鹽(還原，+)、硫化氫(－)、明膠(+)、葡萄糖(+)、乳糖(－)、β－半乳糖苷(+)、山梨醇(－)、赤鮮醇(－)、衛矛醇(－)、丙二酸鹽(－)。不同生態位維氏氣單胞菌的生化指標沒有顯著差異(表1)。 2．4維氏氣單胞菌的人工感染試驗 攻毒后24h死亡率為0、20%、40%、60%、80%、100%的菌株數量分別為35、13、4、3、0株，攻毒后48h死亡率為0、20%、40%、60%、80%、100%的菌株數量分別為11、19、9、10、5、2株。2/3死魚具有發病癥狀，1/4死魚體表癥狀明顯，體表、尾鰭、腹鰭、腹部等部位具有明顯的斑塊狀出血，有的死魚腹部、下頜處具有許多點狀出血，解剖后，腹腔有不同程度的腹水，肝、脾等紅腫。死魚的病變情況與自然病例相似。表2為部分菌株人工感染死亡率。不同生態位菌株致死率沒有明顯差異。 2．5維氏氣單胞菌部分毒力基因的檢測 細胞興奮性腸毒素基因alt的檢測率為26．8%，溶血素基因hly的檢測率為48．2%，同時具有2種毒力基因的菌株占19．6%。圖3、圖4為部分菌株2種毒力基因擴增條帶。由于有的生態位菌株數量很少，單獨區分各個生態位的毒力基因進行比較，有些生態位菌株數量太少，不能進行統計。將生態位劃分為外界環境(底泥、浮游生物、水體)和魚體環境(體表黏液、鰓、腸道等)進行比較可以發現:外界環境中的alt、hly、alt+hly的檢測率分別只有10%、40%、10%，魚體環境中alt、hly、alt+hly的檢測率分別為30．4%、47.8%、21．7%，要明顯大于外界環境(表3)。 2．6維氏氣單胞菌的藥敏試驗結果 維氏氣單胞菌對氨芐西林耐藥率為100%，對復方新諾明、諾氟沙星、洛美沙星耐藥率也分別高達94．6%、94．6%、91．1%，對恩諾沙星、左氟沙星、氧氟沙星耐藥率也在70%以上。敏感性方面，維氏氣單胞菌對多黏菌素、慶大霉素的敏感率分別為64．3%、48．2%，對其他的抗生素敏感性都非常低(表4)。比較不同生態位的菌株耐藥性結果顯示:外界環境中菌株對多黏菌素、慶大霉素、阿米卡星的敏感率分別高達100%、100%、80%，而對應的魚體菌株敏感率分別只為19.6%、37．0%、10．9%。綜合11種抗生素敏感率S外環境、S魚體的比例分別為36．7%、10．7%，耐藥率R外環境、R魚體的比例分別為40%、67．2%(圖5)。 3討論 RS選擇性培養基以及氧化酶、接觸酶、鳥氨酸脫羧酶等對維氏氣單胞菌具有很好的篩選性。池塘中共分離到56株維氏氣單胞菌，分布數量腸道(19)＞鰓(13)＞體表黏液(12)＞底泥(6)＞浮游生物(3)＞腹腔=肝臟=腎臟(1)。說明維氏氣單胞菌主要寄生在腸道、鰓以及體表黏液等位點。 通過塘口病魚細菌的分離鑒定以及攻毒試驗，發現維氏氣單胞菌存在致病菌株，能夠引起團頭魴細菌性出血病，為細菌性出血病的致病菌之一。這一結果與Song等［14］、Rahman等［15］的研究結果是一致的。Song等認為維氏氣單胞菌為一種人類的條件致病菌，能夠引起腹瀉和腸外細菌感染，比如傷口感染、敗血癥等［14］。Rahman等從患有腸炎的病魚中分離得到了14株維氏氣單胞菌，證明了它們具有致病性，能夠引起魚體出血［15］。 目前對于細菌的鑒定主要為16SrDNA。但是也存在一些局限性，如由于16SrDNA的高度保守型，且包含的信息量較少，使得相似率很高的屬內物種不能得到很好的區別，又如由于16SrDNA基因橫向轉移等現象，使得由此基因計算的系統發育結果具有很大的局限性［16］。gyrB管家基因是指所有細胞中均要表達的一類基因，其產物是對維持細胞基本生命活動所必需的，如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等。Yáńez等比較了gyrB與16SrDNA兩種方法在氣單胞菌系統發育樹構建方面的應用，得出了gyrB與16SrDNA具有相同的建樹結果;但是在種間的鑒定方面，gyrB具有更高的分辨能力［11］。本試驗通過gyrB測序，基因比對與具有登錄號的已知菌株相似率大都在98%以上，具有很高的分辨率。 維氏氣單胞菌與嗜水氣單胞菌一樣具有多種毒力因子。由于其致病機理的復雜性，沒有一種單獨的毒力因子能夠解釋。對于多種毒力因子的綜合分析已經成為檢測潛在致病菌的一種手段［17］。Yousr等對維氏氣單胞菌的hly毒力基因檢測，檢測率為67%［18］。Castilho等對不同來源(臨床、食物、環境等)氣單胞菌各個種的毒力基因的分布情況進行了研究，認為氣單胞菌各個種(包括維氏氣單胞菌)存在并表達多種毒力基因，都能夠成為潛在的致病菌［19］。Rahman等從患有腸炎的病魚中分離得到了14株維氏氣單胞菌，與水體環境、腹瀉兒童中分離到的氣單胞菌進行了生化分型、毒力基因、凝血反應等比較，結果顯示，魚體上分離到的菌株具有全部的毒力基因，環境中菌株具有部分毒力基因［15］。本研究通過對維氏氣單胞菌2種毒力基因進行了PCR檢測，檢測率分別為26．8%(alt)和48．2%(hly)。與國外維氏氣單胞菌毒力基因檢測率相比，本試驗中的2種毒力基因的檢測率明顯偏低。(alt+、hly+)、(alt+、hly－)、(alt－、hly+)、(alt－、hly－)4種毒力基因菌株型的48h致死率分別為41．8%、35%、32．3%、29．2%，說明死亡率與這2種毒力基因可能存在一定的正相關性。#p#分頁標題#e# 本試驗中不同生態位毒力基因的分布不同，魚體環境菌株的alt、hly、alt+hly檢測率都要明顯大于外界環境中毒力基因的檢測率，說明這2種毒力基因在感染魚體病原菌致病機理方面可能具有重要的意義。國外也有相關的對于不同生態位點的維氏氣單胞菌毒力基因的檢測。Rahman等［15］比較了魚體、環境和人類腹瀉物上Cytotoxin、Hly、Toxin等3種毒力基因的差異，結果顯示，魚體上的這3種毒力基因的檢測率均為100%，要明顯大于其他2個環境中毒力基因的檢測率，與本試驗的結果一致，即魚體上分離到的菌株具有更強的毒力基因攜帶率，說明魚體上菌株具有更高的潛在致病性。 Das等對15株氣單胞菌的耐藥性進行了研究，認為所有菌株對氨芐青霉素敏感，對鏈霉素耐藥，93.3%的菌株對紅霉素、磺胺嘧啶、新生霉素耐藥，而對利福平、氯霉素的耐藥率只分別為66%、20%［20］。黎炯等對1株羅非魚維氏氣單胞菌的藥敏試驗表明，分離菌株對米諾環素、鏈霉素、頭孢克洛、頭孢唑啉、氧氟沙星、恩諾沙星等抗生素敏感，對乙酰螺旋霉素、苯唑青霉素、麥迪霉素、四環素等抗生素則具有耐藥性［5］。本試驗中維氏氣單胞菌對多黏菌素、慶大霉素敏感，對其他抗生素大多表現耐藥性。說明本試驗中的56株維氏氣單胞菌耐藥譜較廣。值得注意的是，不同生態位維氏氣單胞菌耐藥性存在一個規律，即魚體(體表黏液、鰓、腸道、肝臟、腹腔)上的維氏氣單胞菌耐藥譜明顯高于外界環境(水體、底泥、浮游生物)中的菌株。說明能夠侵入魚機體使其發病的菌株大多為耐藥譜較廣的菌株。 綜上所述，維氏氣單胞菌作為氣單胞菌屬的一個種，與嗜水氣單胞菌一樣也具有致病性，能夠引起魚類出血死亡;池塘維氏氣單胞菌主要分布于魚體表黏液、鰓以及腸道中;部分維氏氣單胞菌具有alt、hly2種毒力基因，且2種毒力基因可能與致病性相關;魚體上分離到的維氏氣單胞菌的毒力基因攜帶率要大于外界環境;維氏氣單胞菌對大多數抗生素具有耐藥性，且魚體上分離到的菌株的耐藥譜要顯著大于外界環境中菌株對藥物的耐藥譜。