前言：尋找寫作靈感？中文期刊網用心挑選的反硝化菌株TGR30的特征，希望能為您的閱讀和創作帶來靈感，歡迎大家閱讀并分享。
隨著農業經濟的迅速發展，灌溉面積和灌溉用水量不斷增加，化肥施用量也不斷增加，由于灌溉技術落后和化肥的有效利用率較低，農田灌溉退水污染成為亟待解決的問題(曹仁林和賈曉葵，2001)。寧蒙灌區地處黃河中上游，年退水30億m3，主要污染物為氮、磷和COD，其中造成超標污染物主要為氮(張愛平等，2008)，對灌區水環境和黃河水安全構成了嚴重影響。 人工濕地利用基質-微生物-植物這個復合生態系統，具有獨特而復雜的凈化機理(潘麗娟和陽小成，2008)，與傳統的污水處理法相比具有基建、運行費用低，操作與維護簡單等優點(梁繼東等，2003)。微生物在人工濕地氮素的去除過程中發揮著關鍵作用，張列宇等(2010)認為，氨化-亞硝化-硝化-反硝化是濕地中脫氮的最主要途徑。反硝化細菌的反硝化反應則是使硝酸鹽氮重新回到大氣的主要途徑(方芳和陳少華，2010)，因此高效反硝化細菌的獲得對人工濕地的構建，解決農灌退水污染具有重要意義。 研究表明，好氧反硝化細菌克服了傳統的反硝化細菌只能在缺氧條件下進行反硝化作用的缺點，有氧生長，生長周期短，對高濃度的氮耐受力很強(Jooetal．，2005;周立祥等，2006)，好氧反硝化細菌的發現，為生物脫氮技術注入了新的活力。但是現在發現的好氧反硝化細菌為數不多(Patureauetal．，2000;黃運紅等，2007;王弘宇等，2007)，而高效的好氧反硝化細菌則更少(朱曉宇等，2009)。已發現的菌株中假單胞菌屬最為常見(李衛芬等，2011)，關于芽孢桿菌屬的報道相對較少。本研究涉及的人工濕地示范基地建在內蒙古自治區巴彥淖爾市烏拉特前旗境內，所在環境條件惡劣，鹽堿化程度較高，有關能夠適應此環境的高效好氧反硝化芽孢桿菌的研究鮮見報道。 因此，本研究在天然濕地底泥中分離出高效好氧反硝化芽孢桿菌，對其進行生物學鑒定，確定其在分類學上的地位，并在實驗室條件下對細菌反硝化特性進行系統的研究，充分認識濕地系統優勢好氧脫氮芽孢桿菌的脫氮特性，為今后工程實踐及強化微生物脫氮技術提供參考。 1材料與方法 1.1樣品來源 2010年6月采自內蒙古巴彥淖爾市烏梁素海底泥，風干，保存于紙袋中。 1.2培養基 菌株分離培養基(NA):牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，瓊脂20.0g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。硝酸鹽還原產氣培養基:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，KNO31.0g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。種子培養基:葡萄糖10.0g，CaCl20.2g，MgSO4•7H2O0.5g，(NH4)2SO42.0g，KCl0.2g，乙酸鈉3.32g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。反硝化基礎培養基:KNO32g，MgSO4•7H2O1g，KH2PO40.5g，葡萄糖10g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。菌株生理生化鑒定培養基參照文獻的方法(東秀珠和蔡妙英，2001)。 1.3芽孢桿菌的分離 稱取1g樣品放入裝有9mL無菌水的試管中，80℃水浴20min，充分振蕩混勻，取1mL到下一個同樣的試管中，依次稀釋得到各種濃度的菌懸液。分別取10－5～10－73個稀釋梯度的稀釋液0.1mL涂布于NA平板上，然后倒置于37℃培養箱中培養24h。挑取不同形態的單菌落轉接至NA斜面上，37℃恒溫培養24h，置于4℃冰箱保存備用。所挑取菌落同時在NA培養基平板上劃線檢驗純度。 1.4反硝化芽孢桿菌的篩選 將1.3分離得到的菌株進行硝酸鹽還原試驗，具體方法參照文獻(東秀珠和蔡妙英，2001)。對于能利用硝酸鹽并且產氣的試驗菌株接種到反硝化基礎培養基，37℃，200r•min－1，搖床震蕩培養，離心取上清，測定總氮含量。根據氮含量的變化進一步確定優勢菌株。總氮的測定采用過硫酸鉀氧化紫外分光光度法(魏復盛等，2002)。 1.5菌株tgr30的鑒定 1.5.1形態與生理生化鑒定菌株的形態學鑒定 與生理生化鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》(東秀珠和蔡妙英，2001)進行。 1.5.2基因組DNA的提取及16SrDNA鑒定 參考Kim等(1995)和Rainey等(1996)的方法提取細菌基因組DNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。擴增引物為通用引物(Claudiaetal．，2002)，正向引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;反向引物1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應體系、擴增程序以及產物的檢測參照胡朝松等(2009)方法。純化后的PCR產物送寶瑞通生物技術(北京)有限公司測序分析。將測序結果用BLAST軟件與GenBank中已登錄的16SrRNA基因序列進行同源性比較，通過CLUSTALX和BIOEDIT等軟件進行多重序列比對分析，并以Neighbor-joining法構建系統發育樹(Sai-tou＆Nei，1987)。1.6反硝化細菌TGR30的反硝化特性測定方法 1.6.1碳源 主要考察醋酸鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸三鈉、可溶性淀粉、琥珀酸鈉、甘露醇、麥芽糖、乳糖對菌株反硝化特性的影響。將不同碳源分別以2%的添加量代替反硝化基礎培養基中的葡萄糖，同時有不加碳源的培養基作對照。將試驗菌株經純培養18h后按8%的接種量加入到添加不同碳源的發酵培養基中，37℃，200r•min－1搖床振蕩培養66h后取樣測定總氮含量。 1.6.2碳氮比 試驗中C/N均以碳源與氮源的質量比計算。反硝化基礎培養基中KNO3濃度始終為2g•L－1，添加1.6.1小節中的最優碳源，碳源添加量根據試驗調整，其他成分不變。菌株培養方法以及取樣測定方法同1.6.1。 1.6.3鹽濃度 培養基中的鹽濃度以NaCl的含量計，設0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%8個梯度，將試驗菌株經純培養18h后，按8%的接種量接入培養基中，37℃，200r•min－1搖床振蕩培養66h后取樣測定總氮含量。#p#分頁標題#e# 1.6.4pH將試驗菌株經純培養18h后，按8%的接種量分別接種于初始pH為4、5、6、7、8、9、10、11、12的改良后的反硝化培養基中，37℃，200r•min－1下搖床振蕩培養66h后取樣測定總氮含量。 1.6.5培養液DO 在上述試驗的基礎上，選擇最適碳源、碳氮比以及pH的反硝化培養基，通過改變搖床轉速的方式調節培養液DO的變化，分設150、180、210、240r•min－14個梯度，37℃培養66h后取樣測定總氮含量，比較菌株在不同溶解氧下的反硝化性能。 1.7數據處理 試驗結果用平均值±標準方差(n=3)表示。運用SPSS11.5軟件進行統計分析。 2結果與分析 2.1菌株篩選和鑒定 2.1.1菌株篩選 應用加熱富集芽孢桿菌的方式從樣品中共分離得到56株芽孢桿菌，通過硝酸鹽還原產氣試驗確定28株具有硝酸鹽還原活性，通過搖瓶發酵培養的方式對其反硝化活性進行檢測，發現菌株TGR30的反硝化活性最高，96h時脫氮率為56.6%，最終選取TGR30為后續試驗的研究對象。 2.1.2反硝化芽孢桿菌TGR30的鑒定 1)菌落和菌體形態特征。觀察在NA培養基中生長24h的菌落，菌落成乳白色，個體較大，圓形，不透明，邊緣整齊，表面濕潤有光澤，無褶皺，無隆起。菌株TGR30經結晶紫染色后顯微鏡下觀察菌體呈桿狀散在或成串分布，革蘭氏染色呈陽性，芽孢呈橢圓形，中生。 2)生理生化試驗。按東秀珠和蔡妙英(2001)的方法進行生理生化試驗，結果見表1。綜合供試菌株TGR30的形態特征及生理生化特性，對照《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》(布坎南和吉本斯，1984)中相應屬、種的有關性狀，初步將供試菌株TGR30歸入芽孢桿菌屬。 3)16SrDNA序列分析。將測得的16SrDNA序列(1436bp)與GenBank中所有已測定的原核生物的16SrDNA序列進行比對，使用PHYLIPprogrampackage軟件處理所得數據，得到了該菌株及相應標準菌株的進化距離并構建了系統發育樹(圖1)。由比對結果可知，與供試菌株16SrDNA序列相似性較高的參比菌株均屬于芽孢桿菌屬。另外該菌與參比菌株Bacillusmegaterium的相似性最高，達到了100%，同時結合菌落形態以及生理生化試驗結果，確定該菌屬于巨大芽孢桿菌(Bacillusmegate-rium)。 2.2反硝化細菌TGR30反硝化特性的影響因素 2.2.1不同碳源對菌株反硝化特性的影響 在生物反硝化系統中，反硝化細菌可以利用碳源作為電子供體、硝酸鹽氮作為電子受體將硝酸鹽還原成氮氣，同時達到去除有機物的效果(王弘宇等，2007)，可見碳源是生物反硝化過程所必不可少的一種物質。目前發現的絕大多數好氧反硝化菌是異養菌，很多以有機碳作為能源(梁書誠等，2010)。從圖2可以看出，該菌不能利用醋酸鈉，酒石酸鉀鈉，檸檬酸三鈉為反硝化碳源，這和有些報道的菌株不同(李秀婷等，2010);以琥珀酸鈉作為唯一碳源脫氮率為15.1%;當以有機碳源為唯一碳源時，與未加碳源的對照組相比反硝化性能有明顯的提高，其中尤以可溶性淀粉效果最佳，氮去除率最高，為60.3%，蔗糖次之，同時能利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖以及甘露醇脫氮，說明該菌具有相對較廣泛的碳源譜。 2.2.2碳氮比對菌株反硝化特性的影響 不僅碳源種類對反硝化特性有影響，C/N也在反硝化過程中起著很重要的作用，Cervantes等(1999)認為C/N是在呼吸過程中獲得高效反硝化效率的主要控制參數。一些研究證實，在一個適當的范圍內，作為能源的碳源濃度越高，好氧反硝化速率越快(Robertson＆Kuenen，1983)。為了明確C/N與菌株反硝化特性的關系，試驗中以2.2.1小節中顯示的最優碳源可溶性淀粉為唯一碳源，通過改變碳源的量來調整碳氮比。由圖3分析，當C/N≤14時氮的去除率隨C/N的增高呈現明顯上升趨勢，C/N＞14時反硝化特性變化不明顯，基本維持在70%左右。由此分析可知，碳源的量對菌體生長和反硝化效率起著重要的作用。如果碳源不足，就沒有足夠的電子流來提供足夠的能源以供菌體生長，相應地反硝化效率也會變低。但是，當提供的碳源遠高于菌體的需求，此時碳源已非限制性因素，菌體的生長和代謝活性處于穩定階段，反硝化脫氮效率也增加不多。 2.2.3鹽濃度對菌株反硝化特性的影響 鑒于該菌將要應用的人工濕地系統鹽堿化程度較高，本試驗考察了鹽度對菌株反硝化特性的影響。TGR30在0～14%的鹽度范圍都表現出了生長特性，當鹽濃度低于8%時菌株都能較好的生長，當鹽濃度進一步提高，菌體生長比較緩慢，培養液中的菌密度降低，勢必造成代謝活動的減弱。而菌株的脫氮活性與菌株的生長趨勢息息相關，由圖4分析可知，菌株在鹽濃度低于6%時脫氮效率無明顯的差異，均維持在80%以上;鹽濃度進一步升高時，脫氮活性明顯降低。由此分析，該菌株具有一定的耐鹽性，同時具有相對較高的脫氮活性。2.2.4不同pH對菌株反硝化特性的影響徐亞同(1994)研究了pH值對反硝化的影響，認為pH值會顯著地影響反硝化速率。另有資料表明(方晶晶等，2010)，pH值能影響反硝化的最終產物，當pH值超過7.3時，終產物為氮氣，低于7.3時，終產物為N2O。圖5表明，pH值對TGR30菌株的反硝化能力影響顯著。不同pH值下，反硝化效率不同，pH4～8時氮去除率呈現上升的趨勢，在pH8時氮的去除率達最高為91.9%，pH9～12時氮的去除率略有降低，但均在80%以上。由上可知，在該菌在偏堿性的環境下反硝化活性優于酸性環境，同時表明該菌具有較廣泛的酸堿耐受性。 2.2.5DO對菌株反硝化特性的影響 Huang和Tseng(2001)研究指出，溶解氧是細菌進行好氧反硝化的關鍵因素。在不同轉速下，搖瓶溶液含有不同的溶解氧，對菌株TGR30的生長和代謝產生影響，從而影響了反硝化效率，其結果如圖6所示?？梢钥闯?，隨著轉速的增加溶解氧濃度增高，反硝化效率呈上升趨勢，當轉速為210r•min－1(DO為4mg•L－1)時脫氮率最高為92%;當轉速進一步增加脫氮率略有下降。#p#分頁標題#e# 3討論 本試驗采用加熱富集、平板稀釋涂布的方式進行菌株分離，結合硝酸鹽還原試驗以及總氮的定量分析，確定TGR30為篩選到的優勢菌株;經形態學觀察、生理生化試驗以及16SrDNA序列分析，確定其為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。而芽孢桿菌被公認為具有強大的生命力，抗逆性強，易于生產、運輸和保藏等特點，因此該菌株具有開發成微生態制劑的潛在應用價值。 目前，芽孢桿菌屬的一些菌種如蠟狀芽孢桿菌(B．cereus)、枯草芽孢桿菌(B．subtilis)、地衣芽孢桿菌(B．licheniform)凝結芽孢桿菌(B．coagulans)，均有文章報道其具有好氧反硝化性能(Kimetal．，2005;楊希等，2008;安健等，2010)，并未發現對于巨大芽孢桿菌有類似的報道。本研究發現，巨大芽孢桿菌同樣具有反硝化功能，并且脫氮率達到了91.9%，表現出了良好的脫氮效果，豐富了反硝化細菌的菌種資源。碳源是細菌賴以生長的重要能源，對細菌反硝化作用有重要影響，C/N在反硝化過程中也起著重要作用。由于代謝機理、電子傳遞途徑的差異，所需的碳源以及C/N呈現多樣性。王弘宇等(2007)研究表明，菌株X31以丁二酸鹽和乙酸鹽作為碳源時，其脫氮效果均要明顯好于蘋果酸鹽，最適宜的碳氮比是5～6;劉詠等(2011)通過對Klebsiellasp.DB-1的研究，發現該菌在以乙酸鈉為碳源，采用碳氮比為3時的反硝化效率最高;而本研究篩選到的菌株TGR30在以可溶性淀粉為唯一碳源，C/N為14時脫氮活性最佳。由此可見，不同反硝化細菌達到反硝化最佳效果要求的碳源以及碳氮比并不相同，呈現出多樣性。同時該菌能利用乳糖、葡萄糖、蔗糖等多種有機碳源進行反硝化活動，說明該菌具有較廣范的碳源譜。 pH同樣對細菌反硝化作用的發揮有較大影響，pH過高或過低均會抑制反硝化還原酶的活性(楊希等，2008)。另有研究表明(Gupta，1997)，細菌反硝化還原酶的最適pH為中性或微堿性，當環境pH偏離該最適范圍時，細菌的反硝化活性會相應降低。 通過對TGR30反硝化特性系統的研究發現TGR30具有廣泛的pH適應能力，pH7～12的范圍內均具有較高的反硝化活性對氮的脫除率基本都在80%以上，pH4～6的范圍內對氮的脫除率也在50%以上。于愛茸等(2005)報道的反硝化細菌W2最適pH在7.0～7.5;修海峰等(2011)的研究表明，菌株DF2的最佳活性pH在6.5～7.5;張苗和黃少斌(2011)報道的菌株TAD1反硝化最適宜的pH在7.0～9.0，當pH值升高至10時，脫氮率下降到10.47%;蔡昌鳳和梁磊(2011)篩選出的菌株F1去除硝酸鹽氮的最適pH為6.0～6.5。本研究獲得的菌株TGR30較上述報道的菌株pH適應能力廣泛的多，同時該菌在鹽濃度不高于6%時對氮的去除效果無顯著性差異，均具有較高的脫氮率，充分顯示了該菌的耐鹽耐堿特性。 烏梁素海位于內蒙古西部巴盟烏拉特前旗，是黃河流域最大的湖泊，也是地球上同經緯度地區最大的自然濕地(孫鑫鑫等，2009)。目前，針對該地鄭喜春等:反硝化芽孢桿菌的篩選鑒定及反硝化特性區進行好氧反硝化菌株篩選研究的工作鮮有報道，本研究從微生物學的角度彌補了該地區該項研究的空白;此外，本研究獲得的菌株TGR30較其他外來引入的菌株，對當地環境特征的適應能力更強，能更好地定殖于人工濕地系統中發揮作用。