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紫外線(ultravioletradiation，UV)波長范圍為10～400nm，依據其波長可將其分為短波紫外線(UVC200～280nm)、中波紫外線波長(UVB280～315nm)和長波紫外線(uva315～400nm)3個區段。UVA、UVB和UVC在紫外輻射總量中的比例為12∶3∶1(聶穎等，2010)。由于近一個世紀全球快速的工業發展導致臭氧空洞的產生，加劇了紫外線，尤其是長波紫外線對地球上生物體的輻射(翟興禮和史本林，2000;柯惟中和周殿鳳，2004)。雖然適量的紫外線可以促進機體的新陳代謝，然而過量的紫外線照射對生物體是極其有害的，尤其是UVA與UVB。目前，對紫外輻射的生物效應已有大量的報道，但主要集中在UVB的生物學效應方面(王靜等，2009;趙海濱等，2009)，對UVA的生物學效應則大多見于植物學方面的研究，動物方面的研究則大多集中于對離體細胞培養材料的研究，偏重其機理的探討(Araielal．，2000;Lielal．，2007)。對于UVA照射后，在體器官的損傷鮮有報告。暴露于紫外線照射中的動物，其腎臟不僅同樣受到紫外輻射的損傷，而且還需要承擔機體在損傷后產生的異常代謝物的排泄以及由此引起的再次損傷，因此使得腎臟成為機體損傷程度的重要檢測組織之一(謝妮等，2002;白咸勇和諶宏鳴，2007)。然而，紫外線對兩棲動物腎臟組織學結構的影響目前尚未見報道?；ū丑蛤苁潜狈降膹V布種，成體平均體長在60mm左右。在遼寧省一般于10月中下旬開始逐漸進入冬眠期，在第二年的4月底出蜇;5月初開始產卵，產卵期一般在15d左右。近年來，已有很多學者利用花背蟾蜍進行了大量的研究，并認為花背蟾蜍是很好的生物學實驗材料(柳殿均，1986)。由于照射儀器空間的制約，故選取了亞成體作為照射實驗動物。本文旨在通過對花背蟾蜍(Buforaddei)腎臟組織學和組織化學的觀察，揭示其在一定劑量長波紫外線處理后的結構變化，為分析紫外輻射對兩棲動物種群衰減的機理積累科學依據。 1材料與方法 實驗用亞成體花背蟾蜍，于2010年6、7月采自沈陽北陵公園。實驗室適應養殖3～4d后，選取體長在33.7mm±9.8mm的57只花背蟾蜍，雌雄兼用，隨機分組，共分19組，每組3只。用WD-9403B型紫外儀進行照射處理，UVA照射波長為365nm，輻射量為352μW•cm－2，照射時間為150、300及450min3個時間段。完成照射后，不同照射組各取出一組進行立即取材，即立即取材組。其他組繼續正常飼養3、6、9、12和15d后，分別再各取一組進行取材，即恢復組。同時，設置空白對照組，每組3只。將亞成體花背蟾蜍用乙醚麻醉后，剖開腹腔，立即取出腎臟固定于10%中性福爾馬林24h。常規石蠟切片，腎臟橫切，厚度7μm，HE、PAS染色。O-LYMPUS-BX50顯微鏡下進行觀察、OLYMPUSDP71拍照，運用Image-ProExpress6.0圖像分析軟件進行測量。間隔3～5張組織切片選取一張進行測量，且僅測量切片中切面較大的腎小體及管腔呈圓形的腎小管，測量數據均以平均數±標準差(mean±SD)表示。采用SPSS16.0軟件包對實驗數據進行單因素方差分析(one-wayANOVA)。文中運用到的計算公式:腎小體相對面積=(腎小體面積/對應腎臟橫切面積)×100%腎小球相對面積=(腎小球面積/對應腎臟橫切面積)×100%近、遠曲小管管徑和細胞相對高度=(近、遠曲小管管徑和細胞高度/對應腎小體長徑)×100% 2結果與分析 2.1花背蟾蜍腎臟的一般結構 花背蟾蜍腎臟呈暗紅色，長橢圓形，位于體腔背壁、脊柱的兩側。腎單位為腎臟的結構和功能單位，由腎小體和腎小管構成。腎小體呈飽滿的圓形，一側可見清晰的“彎月”狀的腎小囊腔，其囊壁扁平細胞連續而光滑(圖1-1)。腎小體主要分布在腎臟中央和腹緣，背緣和兩側緣則分布較少，其平均面積為6278.03μm2±1694.90μm2。近曲小管上皮細胞胞體飽滿，細胞界限不清，胞質嗜酸性，核圓形，位于細胞近基底部，腔面具刷狀緣，管腔小或無，基部有縱紋。遠曲小管上皮細胞染色較淺，細胞界限較為清晰，胞核為圓形或橢圓形，位于細胞近中部;腔面無明顯刷狀緣，基部縱紋明顯。PAS染色顯示近曲小管管腔面呈強陽性;腎小球內部也呈陽性反應(圖1-8)。 2.2UVA照射后腎臟結構的變化 2.2.1腎小管 UVA照射后立即取材，花背蟾蜍腎小管損傷主要表現為小管管徑和上皮細胞均出現明顯收縮;管壁細胞間出現明顯縫隙，細胞基膜也呈間斷性破損，導致小管管壁的破裂;部分管壁細胞出現胞核外排和局部核聚集的現象。同時，胞核有較為明顯的縮小和變形，失去原有的圓形或橢圓形的規則形狀，呈不規則狀。近曲小管PAS陽性反應區，均有向管腔面和胞質內擴展的現象，且擴展區域著色在原腔面兩側逐漸減弱。與對照組相比，300min組腎小管組織學結構的完整性損傷程度最為嚴重，由于腎小管管徑的收縮，導致各管間距明顯增加(圖1-3);而150min組整體損傷程度介于300min組與450min組之間(圖1-2、1-4)。 在恢復期中，近曲小管組織學結構的損傷，如管壁的完整性、胞核形態的不規則、胞核丟失或聚集現象等，在6d或9d有一個明顯的加劇趨勢，隨后又逐漸恢復，即結構的恢復呈現“U”型現象。在15d時，150min組近曲小管管壁結構基本恢復，僅在個別區間的上皮細胞間仍存在有裂隙，少數胞核的分布仍略微雜亂胞核形態已大部分得到恢復(圖1-5)。300min組管壁形態較為完整，但由于細胞高度恢復不一而使腔面呈凹凸狀，胞核仍有缺失和散亂的現象(圖1-6)。450min組僅處于腎臟外圍的近曲小管管壁仍有局部的斷裂現象，大部分基本恢復，胞核形態和分布也趨于正常(圖1-7)。各組近曲小管的基膜結構在恢復15d后都已接近完整，僅局部存在裂隙。對近曲小管的PAS染色所示，隨著恢復時間的延長，近曲小管上皮細胞游離面陽性染色的面積增大充滿管腔，也呈現向胞質內部擴散的趨勢。但300min組恢復12d時，不僅陽性區域明顯減小，且靠近游離面邊緣的染色明顯變深(圖1-15) 。 遠曲小管在恢復期中，150min組在3d后，部分遠曲小管上皮細胞之間界限變得清晰，胞核分布趨于正常;12d時管壁細胞基膜基本恢復完整;15d時遠曲小管管壁組織學結構基本恢復正常(圖1-5)。300min組是損傷程度最嚴重的一組，在經歷了15d恢復后，上皮細胞基膜局部仍有斷裂，部分細胞間裂隙仍存在，胞核也沒有恢復正常大小，且還有大量的形態異常胞核(圖1-6)。450min照射組恢復程度介于150與300min照射組之間，在15d時僅有少數核缺失與移位現象存在，管壁細胞基膜與管壁結構已趨于正常(圖1-7)。#p#分頁標題#e# 從近曲小管管徑，遠曲小管管徑和遠曲小管上皮細胞高度的相對數值看，在UVA照射后0d組中均出現顯著的收縮現象。在恢復15d后，300min照射組的3項指標恢復程度最低(表1)，且近曲小管管徑和遠曲小管管徑的相對值與150min照射組間呈極顯著性差異(P=0.000)。 如表1所示，150min組的近曲小管雖然在0d管徑收縮程度較大，但在隨后的恢復期中呈快速的恢復狀態，在9d略高于對照組，12d和15d略有下降，此3個數值與對照組均沒有顯著性差異，可以認為是基本恢復正常狀況。300min組和450min組管徑雖然分別在3d和9d有所恢復，但隨即又出現回落，直至15d仍然與對照組間呈極顯著性差異，且300min的最后恢復數值在本組中呈最低值。 450min照射組遠曲小管相對管徑在0d時收縮程度最小，且與150min組和300min組間呈極顯著性差異。在恢復期中表現出較大的起伏波動，在12d時至最低值(37.78%±2.90%)，與其他兩組呈極顯著性差異，但在15d迅速回升至本組的最高恢復值(52.30%±2.61%)，與15d的150min無顯著性差異，與15d的300min之間呈極顯著性差異。300min，0d的收縮程度是本組中最嚴重的，與450min呈極顯著性差異。在恢復期中表現為先升后降，在15d僅略高于0d，兩者間無顯著性差異，但與對照組間呈極顯著性差異。150min組在0d收縮程度介于450min組和300min組之間，其在恢復中呈較好的恢復趨勢，僅在12d出現一個明顯回落，15d的恢復值已高于其0d的數值，與其呈極顯著性差異。 遠曲小管上皮細胞相對高度的變化趨勢與管徑基本相似，但在15d時，不同照射時間組的恢復值明顯不同，依次為450min＞150min＞300min(圖1-5，1-6，1-7)，前者和后者之間分別呈顯著性差異(P450～150min=0.015)和極顯著性差異(P450～300min=0.000)。 2.2.2腎小體的結構 經UVA照射立即取材組，腎小體呈現明顯的塌陷和收縮現象，同時腎小囊腔消失。在腎小體區域細胞呈無序狀態，且可見大量的紅細胞彌漫性的充斥在腎小體區域。由表1可見，除150min組的腎小球相對面積外，腎小體和腎小球的相對面積在實驗組和對照組間均呈極顯著性差異。從數值上看，300和450min兩組間的相對面積幾無差別，150min組腎小體收縮程度略小于前兩者，但仍與對照組間且呈極顯著性差異。腎小體結構在恢復期主要表現為腎小囊的恢復、腎小球和腎小體圓潤度及大小的恢復。在15d的恢復中，腎小球相對面積表現出顯著的起伏波動?？煽偨Y以下幾點:1)在6d時3個實驗組的腎小球相對面積恢復數值彼此接近，與對照組間呈極顯著性差異(表1);2)15d時150min組和300min組已恢復接近0d數值，且兩者無顯著性差異(P150～300min=0.895)，而450min組仍遠低于0d，其與兩者間均呈極顯著性差異(P450～150min=0.001，P450～300min=0.000);3)150min組和450min組均在9d腎小囊腔恢復，但300min組到12d腎小囊腔才出現。雖然450min組在12d時腎小囊腔有部分消失，但在15d又重新恢復，且明顯大于9d的腎小囊腔。 3討論 3.1UVA照射對腎臟結構的影響 UVA對生物體的損傷是由細胞的內源性光敏劑吸收其能量，進而誘導生成了過量的氧自由基而引起(Araietal．，2000;Takaoetal．，2002)。正常情況下，細胞中存在著一套完善的抗氧化酶體系能及時的清除過多的氧自由基，維護細胞的內穩態。但當生物體在應激狀態下，產生了超過自身清除能力的氧自由基時，就會導致細胞結構和功能的極大損傷(李培峰和方允中，1994;高斌和高洪，2002;邱秀芹，2007)。對于細胞功能來說，質膜的完整性是極其重要的，它不僅可以保證細胞內環境的穩定，還為細胞之間的連接和通訊提供了結構基礎(汪堃仁等，1998;陳譽華，2008)。氧自由基可使細胞質膜中不飽和脂肪酸發生過氧化產生丙二醛，降低膜結構的穩定性(符移才等，2000;王寧等，2007)。若氧自由基積累過多，可使膜脂發生脫脂化作用，最終導致細胞膜結構的破壞，胞核的溢出，改變了正常細胞胞核對質膜完整性的依賴(王冬梅等，1998;覃鵬，2004)。本實驗結果顯示，經過UVA照射后的腎小體區域出現大量的散亂聚集的胞核，也印證了上述結論。 細胞質膜上存在有大量的整合蛋白及黏多糖等，它們對細胞與外界環境之間的物質代謝、能量轉換、信號通訊等起到重要作用。另外，上皮細胞基底膜上表達的特定黏著分子則在細胞與細胞、細胞與胞外基質連接的介導及組織形態構建過程中具有重要的指導作用(翟中和等，2008)。作為腎小球濾過膜結構中復雜的細胞連接保證了對血液有效的濾過作用(佐中孜，1991;姜春玲，2003)。但機體中過量的氧自由基可引起包括細胞骨架成分如帶Ⅲ蛋白、整聯蛋白、Ca2+通道蛋白等膜結合蛋白的光敏損傷，不僅影響了質膜結構穩定，降低膜功能，同時也導致了細胞連接的松散(李靜，2006;聶穎等，2010)。本實驗結果也顯示出了相同的現象，即經UVA照射后，腎小體結構均出現了結構的異常，即由于細胞連接中的相關蛋白結構的變化，使得由毛細血管上皮細胞與腎小囊臟層上皮細胞之間的有序連接、腎小囊壁層上皮細胞與周圍細胞及結締組織之間的有序連接和腎小管管壁細胞之間的有序連接受到嚴重的損傷，最終導致了腎臟整個器官組織學結構的損傷，降低了腎臟的功能。另外，本實驗還觀察到，在相同照射條件下，近曲小管管壁結構的損傷程度大于遠曲小管的損傷程度。從近曲小管和遠曲小管生理功能分析，近曲小管主要是對原尿中的絕大部分水、葡萄糖、氨基酸、磷酸鹽、重碳酸鹽、鈉、鉀等進行重吸收，而遠曲小管則是在調節電解質和酸堿平衡方面起重要作用(成令忠等，2003)。實驗結果顯示的兩種腎小管損傷的差異，是否是由于其功能差異所致，還需要進一步從生理學角度進行研究證明。 3.2UVA照射對腎臟細胞遺傳物質的影響 由于UVA的能量更低，故其對細胞遺傳物質的損傷不像UVB那樣直接作用于DNA引起嘧啶二聚體的產生，而是通過氧自由基的間接作用引起DNA的氧化損傷(Araietal．，2000;Takaoetal．，2002)，使其形成雙鏈斷裂、堿基修飾、DNA與蛋白質相交聯等現象(Araietal．，2000;Maedaetal．，2000)。而對懸浮于Tris-HCl緩存液中的白來杭幼雞肝臟細胞核給予65W•m－2的UVA照射后，肝臟細胞核內RNA合成量明顯低于正常組RNA的合成量。Arai等(1997)研究指出，UVA照射誘導產生的氧自由基損傷了RNA合成相關的重要酶，從而抑制了RNA合成。其他研究也證實，UVA照射后產生的氧自由基可以增強Akt，p70s6k及MAP激酶的磷酸化，從而活化Erk、JNKs及p38激酶信號轉導途徑(Dingetal.，2002;Hellwegetal.，2007)。本實驗結果顯示，在腎單位中出現了大量的胞核大小和形態的異常，并有部分胞核內出現了染色質邊緣化等現象。但實驗用照射劑量的UVA對腎臟及腎小體細胞內的遺傳物質損傷的程度還需要進一步深入探討。#p#分頁標題#e# 3.3UVA照射對腎臟糖原的影響 Mekkawy等(2010)實驗顯示，UVA照射會導致鯰魚早期胚胎發育中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與乳酸脫氫酶濃度及活性異常，而這兩種酶通常作為鑒定可能存在的環境污染的生物標記。本實驗結果也證明了上述結論，不同照射組及恢復組中的糖原染色均存在變化，尤其是300與450min照射組糖原在近曲小管腔中變化較為明顯，這可能一方面與近曲小管管腔中刷狀緣結構的質膜損傷有關，導致質膜表面的黏多糖分散至管腔，形成腔內PAS淺染。另一方面可能與上皮細胞自身結構恢復需要糖原提供能量有關，形成部分細胞質呈PAS淺染。 3.4UVA照射與兩棲動物對其的適應 近年來對輻射適應性的研究指出，由于最初的照射導致了細胞內氧化還原體系的失衡，從而激活細胞內某些信號途徑，致使機體內的防御體系被激活，使細胞對隨后的照射產生輻射適應性反應(Mar-tinez，2007;Tapio＆Jacob，2007;袁德曉等，2009)。300min照射組對腎臟結構損傷程度最為嚴重，且在恢復期中也較其他兩個照射組恢復緩慢?？梢酝茰y，300min照射時間雖然引起了花背蟾蜍在體腎臟的極大損傷，但還未達到激活花背蟾蜍體內抗氧化酶系活性的峰值，而450min的照射時間，可能在一定程度上激活了花背蟾蜍體內的抗氧化酶系，產生了較強的輻射適應性，有效地保護了腎臟組織結構，并促進了其在恢復期的修復。 3.5UVA與兩棲類種群的衰減 紫外輻射的增強，是兩棲動物種群大幅度衰減的可能原因之一(武正軍和李義明，2004;韓九皋，2007;饒定齊，2008)。在本實驗的恢復期，雖然腎單位的結構均有明顯的恢復，胞核的分布也趨于規則，但各項指標與對照組的正常值之間還存在一定的差距，這已經顯示出花背蟾蜍在漫長的演化過程中，腎臟已經具備了非常強的自我修復功能，以適應各種不良環境。但從15d之后的恢復指標也可以看出，花背蟾蜍腎臟的自我修復能力是有限的，如果外部環境長期處于不良狀態，就會嚴重損傷腎臟本身的內在調節機制，甚至導致腎臟功能的衰竭。這種情況一旦發生，花背蟾蜍的代謝產物就會逐漸積累在其體內，導致中毒現象的發生，嚴重影響機體的正常新陳代謝，最終勢必導致個體的死亡。另外，在5—7月花背蟾蜍正處于產卵和完成胚胎發育及變態發育期間，測的環境中UVA的光照強度在晴天高達949.8μW•cm－2，即使是雨天也在339.1μW•cm－2(此數值與實驗用強度非常接近)，只有在草叢下UVA的照射強度略減弱，為248.1μW•cm－2。雖然蟾蜍類大多在旁晚出來覓食，可以很好地躲避白天強烈的紫外照射，避免對其的損傷，但蛙類多以白天為最佳覓食時間，難免會受到大劑量UVA的照射。如果再由于人為的因素，使得水域附近的樹木、草叢大量減少，蛙類缺少了可用來“避難”的自然掩體，就會引起蛙類個體的無名死亡現象，進而導致種群數量的衰減。本實驗的結果提供了初步的實驗證據，UVA對花背蟾蜍腎臟生理功能的影響以及蟾蜍和蛙類腎臟對UVA照射后的自我調節功能的差異等還有待于后續研究。