前言：尋找寫作靈感？中文期刊網用心挑選的紫菜的無菌培養體系優化，希望能為您的閱讀和創作帶來靈感，歡迎大家閱讀并分享。
紫菜是中國沿海重要栽培品種和主要經濟藻種之一［1］。紫菜和紫菜藻際微生物之間存在著復雜的相互作用關系［2］。以往關于紫菜及其附生菌的研究多是集中在紫菜附生菌的分離、純化和具有特殊作用微生物的培養與鑒定等方面［3－5］，為了進一步研究紫菜和其外生菌的關系，獲得紫菜的無菌培養體系是非常必要的。本文借鑒國內外用抗生素排除藻類外生微生物的方法對紫菜進行無菌處理，并在此基礎上研究紫菜附生菌對紫菜生長的影響。 1材料與方法 1.1材料 1.1.1材料及材料預處理 本研究選用的紫菜葉狀體為寧波象山鶴浦栽培品種(為壇紫菜)，于2008年11月采集，清洗晾干后，－20℃冰箱密封保存。將材料從冰箱中取出，放入消毒海水中，于室溫復蘇24～36h［6］，復蘇后挑選健康的紫菜，在消毒海水中用棉球反復洗刷3遍，將清洗好的紫菜葉片打成直徑6mm圓片，放入0.7%KI溶液中浸泡10min，經滅菌海水清洗3遍后，再放入0.1%(w/v)的氨芐青霉素溶液中浸泡10min，再經滅菌海水清洗3遍后，將紫菜葉片移入滅菌海水中光照培養2h。紫菜培養液為加入Ⅲ號營養母液的滅菌海水(營養母液∶滅菌海水=1∶1000)，海水取自寧波市奉化湖頭渡，過濾后，121℃，20min高壓濕熱滅菌。Ⅲ號營養母液:100g/LKNO3、10g/LKH2PO4、2.5g/LFeSO4、0.25g/LMnSO4和20g/LEDTA-Na2，經0.22μm微孔濾膜過濾除菌。紫菜培養條件:溫度為18℃，光照強度40～50μmoL/m•s，光周期(12h∶12h)。 1.1.2菌種來源 紫菜外生細菌對抗生素的敏感性試驗菌株:為分離自不同地區的紫菜上的具有較強抑菌活性的菌株，見方文雅(2009)［7］。回染實驗菌株為:13株從健康紫菜分離的Pseud-oalteromonas，6株從溫州病爛壇紫菜及條斑紫菜周圍海水分離的Bacillus和7株從溫州病爛壇紫菜及周圍海水分離的真菌。 1.2主要試劑 氨芐青霉素溶液(Ampicillin，100mg/mL，γ射線滅菌)，硫酸鏈霉素溶液(StreptomycinSulfate，30mg/mL，γ射線滅菌)，硫酸慶大霉素溶液(GentamycinSul-fate，15mg/mL，γ射線滅菌)，硫酸卡那霉素溶液(Ka-namycinSulfate，30mg/mL，γ射線滅菌)，硫酸新霉素溶液(neomycinSulfate，10mg/mL，γ射線滅菌)，均購自上海捷瑞生物工程有限公司。 1.3抗生素的選擇 1.3.1待除菌紫菜葉狀體對抗生素的耐受性試驗 將1.2所述5種抗生素分別加入到200mL待除菌紫菜葉狀體培養液中，每種抗生素的濃度梯度分別為10、100、300、500、1000μg/mL。各種抗生素每個濃度做3個平行，以未加抗生素的紫菜葉狀體為對照，每2d更換一次培養液，并追加相應抗生素到相應濃度。每天搖動培養液數次并觀察紫菜葉狀體的生長狀況，連續培養6d，每次更換培養液都進行紫菜葉狀體的無菌檢測，選擇對紫菜葉狀體生長無明顯影響的抗生素及濃度進行下一步實驗。 1.3.2紫菜外生細菌對抗生素的敏感性試驗 將已分離活化的紫菜外生細菌用無菌海水配制成107cfu/mL的菌懸液，將10μL菌懸液和90μL培養液移入96孔板，根據1.3.1實驗結果分別加入選定的抗生素及濃度，每組設3個平行，以不加抗生素的菌液作對照，36℃培養18h使其達到對數生長期，加MTT(噻唑藍)液10～20μL/孔(終濃度0.5～1mg/mL)，36℃溫育4h后棄去培養液，加入二甲基亞砜(DMSO)或乙醇(100μL/孔)，稍振蕩待沉淀充分溶解，置酶標儀波長570nm，測定OD值，每組3個孔的OD平均值表示各組的細菌生長狀況。選取對紫菜外生菌有明顯抑制作用的抗生素作為除菌工具。 1.3.3組合抗生素排除紫菜外生菌 根據1.3.1及1.3.2選擇合適抗生素以最佳終濃度(表1)對紫菜進行無菌化處理。1)抗生素逐種加入法:將待除菌紫菜葉片加入青霉素終濃度為300μg/mL的無菌培養液培養2d;然后用無菌鑷子將紫菜葉片移入慶大霉素濃度為100μg/mL的新鮮無菌培養液，培養2d;再轉入卡那霉素濃度為100μg/mL的新鮮培養液，培養2d;然后將紫菜葉片用無菌海水清新3次，轉入新鮮的紫菜培養液中培養，進行無菌檢測。2)抗生素混合加入法:按照表1所示抗生素組合組別分別對待除菌紫菜葉片進行無菌處理，每組設3個平行，以未進行無菌處理的紫菜葉片為對照，無菌處理18h后，用無菌海水清洗紫菜葉片3次，轉入新鮮紫菜培養液培養3h后更換新鮮培養液，以徹底去除殘留抗生素，再次轉入新鮮培養液繼續培養，觀察紫菜生長狀況，期間每2d更換一次培養液，每次更換培養液后均進行無菌檢測。 1.4無菌檢測 1.4.1培養基檢測法 1)取已排除抗生素影響的紫菜培養液0.1mL，涂布2216E平板和PDA平板，分別以30℃培養2d、29℃培養5d，每組做3個平行，觀察有無細菌及真菌菌落出現。2)取0.1mL紫菜培養液分別加入1mL液體2216E培養基和1mLPDA培養基內，分別以30℃培養1d、29℃培養5d，每組做3個平行，以未加培養液的培養基為對照，觀察培養液是否渾濁。1.4.2熒光和掃描電子顯微鏡檢測1)熒光顯微鏡鏡檢:將待檢測紫菜葉片用0.22μm微孔濾膜過濾的0.1%(w/v)吖啶橙溶液染色10min后，用熒光顯微鏡(日本Olympus公司，型號BX－60)觀察。根據熒光顏色區別菌體與紫菜細胞(紫菜活細胞發紅色熒光而細菌發綠色到橙色熒光)。2)掃描電子顯微鏡觀察:取已排除抗生素影響和未經無菌化處理的紫菜葉片，切成1mm2的小片，經清洗、化學固定、干燥、噴鍍金屬及日本日立公司型號S-3400N的掃描電子顯微鏡拍攝，觀察有無微生物附著。 1.5紫菜外生菌對無菌處理后的紫菜葉片的人工感染 1.5.1細菌懸液及真菌孢子液制備 將培養到對數期的紫菜細菌用滅菌海水制備成初始濃度為106/mL的細菌懸液，將活化好的紫菜真菌用滅菌海水制備濃度為108/mL的真菌孢子母液，置4℃備用。#p#分頁標題#e# 1.5.2低濃度菌液回染正常紫菜 取上述無菌紫菜組織片，用滅菌烘干的濾紙吸干紫菜表面培養液，吸取適量105/mL濃度的芽孢桿菌、假交替單胞菌菌液和真菌孢子液回染3h，用無菌海水清洗3遍，除去紫菜表面微生物，將接菌的各紫菜組織片分別置于6孔細胞培養板(COSTAR，ComingInc．USA)中，每孔加人10mL紫菜無菌培養液，置于光照培養箱，按紫菜最佳培養條件培養，定期觀察其生長狀況，每組設3個平行，以不加菌的無菌紫菜為對照。 1.5.3高濃度真菌孢子液回染不同狀態的紫菜 配制108/mL真菌孢子液分別回染健康紫菜、穿刺紫菜(用滅菌刀片在紫菜表面劃1～2mm的傷口)，分別在18℃、28℃和35℃條件下培養，光照強度為40～50μmol/m•s，光暗比為L∶D=12h∶12h，每組設3個平行，以不加菌的無菌紫菜為對照。 2試驗結果與分析 2.1抗生素的選擇 紫菜葉狀體對抗生素的耐受性實驗表明，硫酸鏈霉素對紫菜細胞毒害較大，對紫菜的生長具有一定的抑制作用，紫菜葉片培養4d后100μg/mL濃度組的存活率僅有50%，培養到第9d時基本上紫菜葉片全部變白死亡。氨芐青霉素、新霉素、卡那霉素和慶大霉素的性質相對溫和，對紫菜葉片影響較小。紫菜外生菌的藥敏測試結果(見表2)表明，氨芐青霉素、慶大霉素及卡那霉素均可明顯抑制紫菜外生菌。氨芐青霉素對78.9%外生菌的抑菌率達80%以上;慶大霉素對73.7%外生菌的抑菌率達80%以上，卡那霉素對73.7%外生菌的抑菌率達80%以上，而新霉素的抑菌作用則相對較弱，僅對34.2%的外生菌的抑制率達80%以上。因此，最終選擇氨芐青霉素(終濃度300μg/mL)、卡那霉素(終濃度100μg/mL)、慶大霉素(終濃度100μg/mL)用于紫菜無菌化處理?？股亟M合處理紫菜葉片結果表明:與抗生素逐種加入和兩兩合用的抗生素組合處理相比，采用氨芐青霉素(終濃度為300μg/mL)、卡那霉素(終濃度為100μg/mL)、慶大霉素(終濃度為100μg/mL)組合對紫菜的無菌化處理效果較好，并且3種抗生素組合處理紫菜外生細菌的試驗表明，3種抗生素合用對89.5%紫菜外生細菌的抑菌率達80%以上(見表2)。 2.2紫菜無菌檢測 取3種抗生素合用處理18h，轉入新鮮紫菜培養液培養3h后的紫菜，經熒光顯微鏡檢測(圖1)發現，對照有大量菌體存在(細菌發綠色到橙色熒光)，而處理后的紫菜僅看見紫菜細胞(紫菜活細胞發紅色熒光);經掃描電子顯微鏡觀察(圖2)發現未處理的紫菜表面有菌體存在，而無菌處理過的紫菜表面已經達到無菌狀態;取3種抗生素合用無菌處理一次后過夜恢復培養的紫菜培養液0.1mL分別加入1mL液體2216E培養基和1mLPDA培養基內，結果發現2216E液體培養基變渾濁，PDA液體培養基內未見真菌生長。隨機取3片未經處理的紫菜葉片和經過3種抗生素合用處理后的紫菜葉片，分別吸干表面水分，放入滅菌研缽中充分研磨，然后加入300μL滅菌海水，取100μL涂布2216E平板，30℃過夜培養，未經處理的紫菜平板內布滿細菌，濃度可達到2×105cfu/mL，而經過3種抗生素合用無菌處理的紫菜葉片其上有少量細菌，僅150cfu/mL，即經過3種抗生素合用處理后的紫菜葉片僅有0.078%的細菌存在，可忽略不計，結果見圖(圖3)。這說明雖然紫菜經3種抗生素合用無菌處理后紫菜表面能達到無菌狀態，但是并不能說明紫菜已經達到絕對無菌狀態，或許是紫菜細胞內有寄生菌，該寄生菌并不能通過外部浸泡抗生素的方法除去。實驗發現經過3種抗生素合用處理后的紫菜葉片僅有0.078%的細菌存在，可忽略不計，并且對紫菜細胞產生的影響很小。無菌處理后的紫菜葉片在無菌培養條件下初期生長狀況良好到后期紫菜葉片逐漸變白死亡，而經紫菜外生菌回染的紫菜葉片生長狀況良好，說明紫菜葉片的死亡并非由于無菌處理的化學因素所導致，而是源于其他因素。這也說明紫菜外生菌與紫菜的健康生長之間存在一定的關系。 2.3紫菜外生菌對無菌處理后的紫葉片的人工感染 用105/mL真菌孢子液和細菌菌液回染紫菜，培養22d后，實驗組紫菜生長狀況較對照組好，對照組紫菜出現褪色，結果見圖(4)。用108/mL真菌孢子液分別回染正常紫菜和穿刺紫菜，實驗結果表明高溫和穿刺均會影響無菌紫菜健康生長，正常培養條件的加菌紫菜生長良好，而加菌紫菜在高溫和穿刺條件下，則會出現明顯病斑，結果見圖(5)。該結果提示我們，低濃度菌液可能參與紫菜維持藻際微環境的平衡，并為紫菜提供了營養，從而促進其生長;紫菜病爛不一定是真菌造成的，處于惡劣環境的紫菜可能更容易受致病菌侵染而導致病爛。關于其影響原理有待進一步深入研究。 3討論 為了研究藻和藻外生菌之間的相互作用關系，獲得藻的無菌培養體系是非常必要的，先前國內外已有很多研究選擇用抗生素除菌來獲得藻的無菌培養體系。Druehl等采用較高濃度的組合抗生素(青霉素、硫酸鏈霉素和氯霉素)并配合次氯酸鈉對海帶等褐藻進行無菌處理，成功獲得了無菌孢子體葉片［8］。Cottrell等采用單一抗生素逐種加入法進行微藻除菌成功獲得了無菌微藻Micromonaspusilla藻種［9］。林偉利用青霉素、卡那霉素、鏈霉素和慶大霉素組合處理藻，獲得了除菌球等鞭金藻，三角褐指藻及小球藻，并且除菌后的藻生長情況更佳［10］。由于各種藻的藻際微環境和藻際微生物各不相同，要根據藻類的實際情況來采取不同的除菌方法。本文利用紫菜及紫菜外生菌對抗生素的敏感性實驗，最終選擇氨芐青霉素(終濃度300μg/mL)、卡那霉素(終濃度100μg/mL)、慶大霉素(終濃度100μg/mL)三種抗生素組合對壇紫菜葉狀體進行無菌處理，紫菜經0.7%KI和0.1%(w/v)氨芐青霉素預處理后，再經三種抗生素合用處理，可排除幾乎全部的紫菜葉狀體外生菌。