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海洋雪花是海洋生態系統中獨特的現象，在能量流動和物質傳遞過程中具有重要的作用［1-2］。浮游植物凝聚體是海洋雪花的主要貢獻者［3-4］。凝聚體的形成一般發生在海洋藻華發生的中后期，浮游植物細胞彼此粘合在一起，并且通過吸附細菌、生物碎屑和無機顆粒等物質，組成較大的凝聚體［3-4］。浮游植物凝聚體的形成顯著影響了海洋生態系統的有機物質通量，據估算深海區域每年有36%的初級生產力以凝聚體的方式沉降出真光層［2］。室內研究同時發現，浮游植物細胞在衰退期時最易形成凝聚體，此時細胞分泌更多的糖類物質，細胞表面粘性顯著增加，有利于細胞彼此連接［5］。浮游植物細胞的凝聚過程需要提高細胞互相碰撞的機會，布朗運動，水體攪動和細胞沉降方式等物理因素均增加了凝集體形成的幾率［6-7］。浮游動物的攝食行為同樣能夠增強浮游植物的凝集效率，例如浮游動物產生粘性更強的糞球，可粘合更多細胞;浮游動物通過游泳行為增加細胞的碰撞機會，提高細胞凝聚的幾率;但是某些浮游動物過快的游泳速度則可能減少凝聚體的形成［8］。因此浮游動物對凝聚體形成的影響還存在爭議。 棕囊藻(Phaeocystis)廣泛分布于從熱帶到兩極的廣大海區，在全球碳和硫循環過程具有重要的調控作用［9-10］。棕囊藻屬于有害藻華物種，其產生的藻華經常導致嚴重的生態災難和經濟損失［11］。1997年，我國南海首次爆發球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa)藻華，此次藻華面積覆蓋3000km2海域，時間持續6個月，導致鄰近海域養殖魚類的大量死亡，直接經濟損失達到750萬美元［12］。棕囊藻具有特殊的異型生活史，包含游離單細胞和囊體兩種生活史狀態［13-14］。游離單細胞3—9μm，囊體直徑一般為幾百微米，中國南海發現的球形棕囊藻囊體直徑則可達到3cm，為目前世界上發現的最大棕囊藻［12］。囊體結構為中空球狀，球體外被為一層具有彈性的凝膠質半透膜，囊體細胞均勻包裹于凝膠質外被之下［15］。囊體外被的主要成分為粘多糖［16］，具有粘性，因此囊體經常能夠粘附在一起，形成凝聚體［17］。凝聚體的形成加速了有機物質的垂直沉降。在歐洲北海南部，棕囊藻藻華衰退時，囊體互相聚合并粘附其它有機碎屑以及無機顆粒形成凝聚體沉降到水層底部，約有60%的初級生產力被沉入海底［4］。 棕囊藻的凝聚和沉降也被認為是棕囊藻藻華消退的主要原因之一［17］。但是，海區中極少發現棕囊藻單細胞形成的凝聚體［4］。棕囊藻囊體較大的體積導致浮游動物無法有效攝食囊體內細胞［18］，有效減少了攝食死亡率［19-20］。攝食壓力的存在提高了囊體體積和囊體的形成率［18，20］。因此囊體的形成和體積的提高成為棕囊藻重要的生態競爭策略［20］。棕囊藻單細胞聚合成凝聚體同樣提高了體積，最大直徑可達到10cm［4］，遠遠超過浮游動物的攝食粒徑范圍。但是目前為止，依然不清楚單細胞凝聚體的形成同攝食壓力的關系。本文選擇中國南海球形棕囊藻為研究對象，通過添加高密度攝食者，引入攝食壓力，研究棕囊藻單細胞凝聚體形成和攝食壓力之間的關系，闡明攝食在棕囊藻藻華消退期間的功能和意義。本次研究的結果為闡明球形棕囊藻的競爭策略及其生態效應提供了理論支持，同時增強了對于浮游植物凝聚體形成機制的理解。 1實驗方法 1．1藻種的培養 本研究所用球形棕囊藻取自廣東汕尾沿海藻華發生現場，囊體直徑范圍為500μm到1cm，小心挑選健康完整的囊體，培養于暨南大學赤潮與水環境研究中心藻種室。球形棕囊藻培養在鹽度為30psu的f/2培養基中［21］，溫度保持為20℃，光照強度為100μmol光子m－2s－1，光暗比為12h∶12h。但是待第2次接種后，囊體全部消失，只有游離單細胞存在，而且70%以上的單細胞均帶有鞭毛，可以自由運動。本次研究中采用的攝食者為異養甲藻-海洋彎曲甲藻(OxyrrhismarinaDujardin)，購自美國西華盛頓大學ShannonPoint海洋中心。已有研究證實海洋彎曲甲藻能夠以較高的速率攝食棕囊藻的單細胞［22］。 1．2攝食實驗 將球形棕囊藻單細胞接種至12個透明培養瓶中(BDBiosciences，USA)，接種體積為250mL，初始濃度為4000個/mL。將海洋彎曲甲藻投入到其中6個培養瓶中作為攝食組，初始密度為0．2個/mL，剩余6個培養瓶中只包含球形棕囊藻作為對照組。3個無攝食培養瓶和3個攝食瓶置于搖床上(VWRScientific，USA)，搖床轉速為10RPM，保持細胞均勻分布，并提高細胞的相遇率［23］。其余3個攝食瓶和3個無攝食瓶置于靜止平臺上。培養溫度為20℃，光照強度為100μmol光子m－2s－1，光暗比為12h∶12h。 1．3取樣與測定 每4d取樣1次，每次取2mL樣品，加入酸性Lugol's溶液固定。利用Sedgwick-Rafter計數框(SPISupplies，USA)計數游離單細胞數量，計數的細胞數量不少于200個［18］。凝聚體形態與數量，凝聚體包含細胞豐度以及海洋彎曲甲藻數量的測定在24孔細胞培養板中進行，計數的凝聚體/海洋彎曲甲藻數量不少于30個。為了研究的便利，將凝聚體的形態簡化為球體(見結果2．1及圖1)，采用以下公式計算凝聚體的細胞數量(Na):式中，ragg為凝聚體直徑，rcell為單細胞直徑。 2結果 2．1單細胞凝聚體的形態 無論有無攪動，攝食組中均發現了棕囊藻單細胞凝聚體。細胞緊密附著在一起，形成近似圓球結構，體積大于攝食者———海洋彎曲甲藻。在凝聚體形成初期，細胞聯系較為松散，細胞之間有凝膠狀物質存在，凝聚體中包裹的纖維等物質清晰可見，且凝聚體細胞均無鞭毛。隨著聚集體體積逐漸提高，細胞彼此之間聯系愈發緊密，凝膠狀物質不可見，細胞之間無縫隙，整個凝聚體呈不透明的球體，無法觀察到凝聚體的內部結構(圖1)。對照組中并無凝聚體的出現。無攪動攝食組中凝聚體體積逐漸提高(P＜0．01)，從第16天的(43．4±7．7)μm增長至第36天的(98．0±27．8)μm(圖2a)。而攪動攝食組中凝聚體直徑在第36天達到最高，只有(61．97±15)μm(圖2b)。無攪動攝食組中，棕囊藻凝聚體包含的細胞密度逐漸提高(P＜0．01)，從16天的(97．5±89．8)提高到(1367±823．62)個/凝聚體(圖2c)。而攪動攝食組中在第36天時達到最高，為(193．2±170．3)個/凝聚體(圖2d)。凝集體包含細胞密度同凝集體體積線性相關(P＜0．001)。#p#分頁標題#e# 2．2單細胞和凝聚體數量 海洋彎曲甲藻有效攝食了球形棕囊藻單細胞。攝食組中細胞豐度顯著低于對照組(P＜0．001;圖3a)。在16d和20d時，游離單細胞幾乎被攝食殆盡。直到28d，細胞豐度才稍有提高，然后再次減少到幾乎為0。攪動攝食組中單細胞濃度變化同樣顯著低于對照組(P＜0．001;圖3b)，攝食組中球形棕囊藻承受著較大的攝食死亡率。無攪動攝食組中，凝集體在第16天時大量形成，凝聚體數量達到(43．8±2．4)凝聚體/mL，第20天達到最高值為(53．7±0．4)凝聚體/mL。第24天開始囊體密度下降，實驗結束時(36d)，凝聚體數量只有(28．0±3.3)凝聚體/mL。攪動攝食組中于24d發現凝聚體，28d達到最高值(23．0±2．0)凝聚體/mL，之后凝聚體數量迅速下降(圖4)。 2．3攝食者的密度 海洋彎曲甲藻的初始密度只有0．2個/mL，但是其數量迅速提高且出現較大的波動。在無攪動攝食組中，海洋彎曲甲藻的密度于12d后達到(1．06±0．02)×104個/mL(圖5)。由于凝聚體的出現，海洋彎曲甲藻的密度出現波動并于24d后顯著下降(P＜0．01)，到實驗結束時，海洋彎曲甲藻在無攪動攝食組中密度只有(0.36±0．05)個/mL。攪動組中由于凝聚體的出現，攝食者密度同樣出現了波動，在32d后顯著下降(P＜0.05)。 3討論 藻華末期，浮游植物細胞互相連接形成凝聚體是海洋生態系統中常見的現象。盡管棕囊藻經常引發大規模的藻華，但是目前關于棕囊藻單細胞凝聚體的報道只有一例［4］。由于囊體是藻華發生期間的優勢形態［12-13］，單細胞豐度很少，因此導致單細胞間接觸機會少，降低了凝聚體的形成幾率。本次研究中，對棕囊藻培養體系施加了攪動，有效增加了細胞的碰撞與結合幾率;并促使棕囊藻細胞更快的進入衰退期［24］;分泌更多的多糖類物質，使得細胞表面黏性增強［16］。具備形成凝聚體的兩個必要條件，對照組中依然未發現任何凝集體，說明對照組中單細胞缺乏形成凝聚體的機制。無論是否存在攪動，攝食組中均發現了凝聚體的存在，說明攝食壓力的存在促進了單細胞凝聚體的形成。囊體形成前，超過70%的單細胞具有鞭毛，在海水中自由的游動，而形成凝聚體的細胞則均無鞭毛。這樣在凝聚體形成過程中，單細胞褪去鞭毛粘結在一起，證明了凝聚體的形成是棕囊藻主動的生理過程。凝聚體的形成有效保護了部分細胞免受攝食者的影響，凝聚體一旦出現，攝食者的數量立即減少。隨著凝聚體的體積增大，更多的細胞被凝聚體粘連在一起，導致攝食者密度持續下降。凝聚體的形成在棕囊藻生長末期成為抵御攝食的有效手段。 本研究中采用的攝食者密度較高，達到1．3×104個/mL，而這個密度在自然水體中是難以實現的，這也是浮游動物攝食研究中一個普遍的問題［18，20］。在Jacobsen等的研究中［18］，攝食者:食物的比例為1∶50(Gyrodiniumdominans:P．globosasolitarycells)，隨著實驗的進行G．dominans密度提高很快，攝食者:食物的比例達到3∶50［23］。而在本次研究中，攝食者:食物的比例最初只有1∶20000，但是在20d時，這個比例達到8，說明海洋彎曲甲藻有效攝食了球形棕囊藻的單細胞，本身的密度也提高較快。過高的攝食者密度必然導致過高的攝食壓力，從而引起浮游植物細胞特殊的生理響應［23］。本研究中，過高的攝食壓力導致了游離單細胞幾乎被耗盡，促進了凝聚體的形成。細胞被凝聚體的形成可能屬于棕囊藻的“應激”反應的結果。由于現場中以及室內培養體系中，不會出現類似的高攝食壓力，衰老的游離單細胞缺乏形成凝聚體的動力。這也解釋了單細胞凝聚體很少被發現的原因。而Riebesell等在歐洲北海發現棕囊藻單細胞聚集體時，海區微型浮游動物密度較高［25］，棕囊藻單細胞同樣面臨較高的攝食壓力，同本文的研究結果具有很好的對比性。 一般來說，藻華末期的棕囊藻囊體衰老破裂，釋放出單細胞，被微型浮游動物攝食，有機碳進入經典食物鏈繼續傳遞［13］。衰老的囊體在海洋表層被微生物侵蝕，形成大量白色泡沫［11］。而尚未破裂的囊體可形成凝聚體，但是由于囊體之間結合松散，具有較大的浮力，不利于沉降，在真光層中再礦化［4］，有機物質進入微生物食物環。如果單細胞形成凝聚體，則凝聚體不易被浮游動物攝食，而凝聚體由于結合了較多的細胞，體積和密度增加，從而快速沉降至海底［4］。因此單細胞形成凝聚體可能將更多的有機碳以沉積物的形式帶入海底，減少了食物鏈中有機物質的比例。凝聚體的形成由于體積增大，可能阻礙小型浮游動物的攝食，減少了物質和能量在食物鏈中的傳遞效率。因此棕囊藻單細胞形成凝聚體將改變有機物質的循環和流通，進而改變海洋生態系統的結構和功能。 球形棕囊藻在生長的各個階段均具有優越的競爭生存策略［19］。棕囊藻的囊體能夠調控浮力，提高在真光層中的滯留時間［26］，為生物量在水體表層的迅速積累提供了條件。當球形棕囊藻藻華爆發時，囊體堅韌的外被和較大的體積抵制了海洋細菌，病毒和浮游動物對囊體細胞的侵蝕和攝食［18，20，27］。而在藻華后期，棕囊藻囊體開始破裂，囊體內細胞被釋放出來。如果承受的攝食壓力過大，單細胞則可形成凝聚體，降低了細胞的攝食死亡率。另外，聚集體的存在可作為棕囊藻越冬的形態，在條件適合時再次增殖［19］。具備各種優越的競爭策略有利于球形棕囊藻藻華的形成，也解釋了棕囊藻成為海洋生態系統中最“成功”的浮游植物的原因。 4結論 通過添加高密度的攝食者———海洋彎曲甲藻，在球形棕囊藻培養體系中引入較高的攝食壓力，棕囊藻單細胞被大量攝食，從而誘導并刺激單細胞脫去鞭毛，互相吸附連接，形成結構緊密的凝聚體結構。棕囊藻單細胞凝聚體體積顯著高于攝食者的體積，且逐漸提高，造成了攝食者和食物之間的不匹配。凝聚體的形成有效阻止了海洋彎曲甲藻對游離單細胞的攝食，降低了細胞的死亡率。鑒于現場中很少出現單細胞凝聚體，本次研究中的凝聚體可能是球形棕囊藻面對高攝食壓力情況下而采取的“應激性”防御策略。棕囊藻成為海洋生態系統中主要的藻華物種得益于其具有的各種競爭策略。#p#分頁標題#e#