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反硝化作用是生態系統氮循環過程中一個重要的組成部分，能夠導致農田土壤氮素損失，降低土壤肥力，促進溫室氣體N2O排放。但是從生態學的角度考慮，反硝化作用能夠把生態系統固定的氮和人為活化氮以N2的形態返回到大氣氮庫中，是活性氮最終以惰性氮離開土壤、水體等內部生物循環而回到大氣的唯一自然途徑[1]。因此，反硝化過程能夠去除水體中的硝態氮，調節水體質量，平衡生物固氮輸入通量，減少活性氮對環境和氣候變化的影響。雖然有關反硝化的研究已經取得了很大進展，但是迄今為止仍然沒有一種合適的方法來量化反硝化速率[2]，主要原因有：（1）大氣和水體中氮氣的環境背景值很高，從而使得測定反硝化產生的微量氮氣存在很大困難；（2）反硝化過程具有很大的時空變異性；（3）目前所采用的方法大都是改變了底物濃度，或者破壞了樣品的物理環境，從而不能獲得真實的反硝化速率；（4）不同研究者在反硝化測定方法上缺乏交流，從而阻礙了反硝化的研究進展。因此，本文綜述了目前在陸地和水體生態系統中幾種常用的測定反硝化速率的方法，并針對這些方法的優缺點進行討論，以期為今后反硝化測定方法的進一步研究提供參考。 1目前常用的反硝化測定方法 1.1乙炔抑制法 采用乙炔抑制法來研究反硝化是基于高濃度乙炔能夠抑制硝化作用以及N2O向N2的還原[3]，從而使得N2O成為反硝化的終產物。由于N2O在大氣中的濃度很低，因此很容易測得N2O的產生量，從而間接推算出反硝化速率。乙炔抑制法主要包括箱法和土柱方法。最早使用的乙炔抑制法是向原位箱下的土壤中灌注乙炔[4,5]，但是這種方法費力，難于操作?；谶@個缺點，研究者們開始采用土柱方法。土柱法包括動態土柱法和靜態土柱法，所謂動態土柱法是指使用通氣泵促使乙炔和土壤空氣在土壤大孔隙中循環，然后在2小時之內連續測定N2O的濃度變化以計算反硝化速率[6]。但是由于氣體是采用強制泵入的方式，容易導致土柱中壓力的變化，進而破壞土壤結構、影響氣體擴散。靜態土柱法則是把乙炔注入到一個密封的容器中，經過一定時間均衡后測定N2O的積累速率[7]。與動態土柱法相比，靜態土柱法不存在氣體循環過程，并可進行大量樣品測定，但是乙炔擴散進入土柱以及N2O擴散出土柱都有一定的限度[8]。用乙炔抑制法測定反硝化速率操作簡單便捷，成本低，可以進行大批量樣品的同時測定。其主要不足之處是乙炔抑制了硝化作用，當NO3-成為反硝化的限制因子時，將低估反硝化損失量[9]，從而影響測定結果的準確度。此外還存在一些其它問題：（1）在粘土或者飽和沉積物中，乙炔擴散速率很慢，對硝化作用抑制不完全[10]；（2）長期反復使用乙炔會導致反硝化微生物對乙炔的適應，將乙炔作為一種碳源，消耗乙炔，從而導致濃度降低，抑制效果下降[11]；（3）在土壤碳含量較高而NO3-濃度較低時（<10μmolL-1）可能促進N2O的還原而削弱乙炔的抑制效果[11,12]；（4）乙炔中的雜質氣體（如丙酮）會影響反硝化過程[13]。最近還有研究表明，在有氧氣存在的情況下，高濃度乙炔（大于0.1kPa）會促進反硝化產生的NO分解或者催化NO的氧化，從而低估反硝化速率[14]。雖然乙炔抑制法存在很多問題，但由于迄今為止還沒有一個令人十分滿意的測定反硝化的方法，所以這種方法仍被廣泛使用[2]。如目前對于反硝化潛勢和反硝化酶活性的測定，普遍采用的都是乙炔抑制法[13]。低濃度乙炔能夠抑制硝化作用，高濃度乙炔不僅能抑制硝化作用，還能抑制反硝化作用過程中N2O向N2的還原。因此，Kester等[15]通過向土壤中添加不同濃度的乙炔，量化了林地、草地、河水底泥中硝化作用和反硝化作用對N2O排放的貢獻。Ullah[16]采用乙炔抑制法研究了農業流域內不同利用類型土壤的反硝化能力及其影響因素，并估算了反硝化作用對流域內硝態氮的去除能力。雖然這種方法可能低估了反硝化能力，但仍使人們認識到了反硝化作用對于去除活性氮的重要作用。 1.215N同位素示蹤法 同位素示蹤法包括15N平衡差值法和15N示蹤氣體直接測量法。15N平衡差值法是基于微區試驗中不存在徑流損失，氮的當季淋洗損失又極低，而把所有的氮素損失都作為氣態損失的基礎上建立的。廖先苓等[17]把從15N微區試驗中測得的氮素總損失量扣除氨揮發損失量后作為硝化-反硝化損失量，其優點是15N的豐度和氨揮發量可準確測定，其主要缺點是測定結果是硝化和反硝化的共同氣態損失，不能區分兩個過程對氮轉化的具體貢獻[18]。此外，李振高等認為[19]微區施入的15N與土壤原有15N進行交換，土壤中氣體逸出受阻使測定值偏低，再加上氮總損失量、氨揮發量等各個環節的測定，使得最終的測定誤差很大。15N示蹤氣體直接測量法是向土壤中添加15N標記的NO3-，然后測定產生的N2和N2O的15N來量化土壤的反硝化速率[20]。這種方法出現于50年代末，80年代廣泛應用于旱地，近年來才被用于測定稻田土壤和沉積物的反硝化損失。Petersen[21]向原狀沉積物柱樣中分別加入15NO3-和15NO2-，通過測定15N2的量，不僅計算出反硝化速率，而且還量化了厭氧銨氧化對N2排放量的貢獻，并指出沉積物中銨態氮硝化產生的NO3-是反硝化的主要氮源。雖然15N示蹤氣體直接測量法也存在氣體擴散受阻、標記不均勻等缺點，但因其具有較高的靈敏度使得此種方法仍然得到了廣泛應用并推動了反硝化過程的研究。使用15N同位素示蹤技術是建立在假定施入到土壤中的15N能夠和土壤本底15N快速均勻混合的基礎上。理論上講，由于土壤結構不均一、存在擴散障礙物、生物擾動、同位素分餾等因素使得在靜態土柱中很難達到這種快速均勻混合的狀態。但Steingruber等認為[22]，同位素的非均勻混合對反硝化測定結果的影響很小，所導致的誤差不超過10%。其他研究表明[23]，即使土壤中的NO3--N標記是不均勻的，仍能對反硝化產生的N2作出準確的估計，因為非均勻混合所導致的誤差可能遠遠小于實驗系統誤差。值得注意的是，有報道指出土壤微生物傾向于利用輕質同位素，從而使得該方法低估了反硝化的發生程度[19]。此外，向氮源缺乏的生態系統中添加15N標記的NH4+、NO3-可能會增加可利用的氮源，從而高估反硝化速率，因此這種方法最好用在氮素含量較高的生態系統中[23]。 1.3N2直接量化法#p#分頁標題#e# 大氣中的N2含量高達79%，在這樣高的背景值下，很難直接測定土壤反硝化產生的微量N2。1956年，Nommik最先提出用密閉系統培養原狀土、沉積物和土壤植物生長系統來直接測定反硝化產生的氮氣[24]?；谶@種密閉體系，廣泛用來測定反硝化的方法是氣體流動培養技術[25,26]，即在密閉系統中，使用連續流動的He或者Ar來清除N2背景含量，在不添加抑制劑的情況下，培養原位土柱來測定反硝化產生的N2和N2O。因為室內培養比較容易控制環境條件，所以N2直接量化法被廣泛用于反硝化作用的影響因素研究。早在1978年Wickramasinghe[25]就用這種方法研究了不同氮濃度（0,30,100,300kgNha-1）對土壤反硝化的影響，結果表明氮施用量為100kgNha-1時氣態氮損失最大，大約有59%的硝態氮以N2和N2O的形式損失掉。Scholefield[26]采集了英格蘭西南部草地土壤原狀土柱，用氣體流動培養技術研究了氮濃度、水分、pH、溫度對反硝化排放的N2O和N2O/N2比的影響，使人們對反硝化氣態產物的排放比例有了更深的認識。氣體流動培養技術有很多優點：（1）采用非擾動土，可以真實的反映土壤反硝化速率；（2）不需要加入氮素示蹤劑，對土壤氮素底物沒有干擾；（3）不需要添加抑制劑，這對于自然環境下的反硝化研究非常重要。而且，一旦建成了密閉系統，這種方法應用很簡單，可以用來測定土壤、沉積物、水中的反硝化速率以及進行參數模擬試驗。但是Nommik指出[24]，建立密閉系統，無論在設計上，還是建造過程方面都非常復雜。此外，完全清除系統中的氮氣需要一定的時間，很難保證系統的密閉性，在保證氣體取樣的精確性和無污染方面也存在一定困難。目前，氣體流動培養技術主要用于測定反硝化產生的N2和N2O。將來我們可進一步改進這種方法用于測定反硝化過程中排放的NO，這樣就可以同時測定反硝化產生的三種氣態產物，從而使我們更好地理解反硝化的發生過程。 1.4質量平衡法 質量平衡法是根據系統中氮素輸入和輸出量的差值來估測反硝化損失，這種方法一般應用在大尺度的陸地生態系統或水體生態系統中[27]。質量平衡法可表示為：氮素輸入-氮素輸出=氮素儲存+反硝化損失。陸地生態系統中氮的輸入項包括肥料投入、生物固定、干濕沉降，輸出項包括作物吸收、地表徑流、秸稈焚燒、NH3揮發等。對于陸地生態系統而言，氮存儲量的變化一般很小，可以忽略不記，因此輸入和輸出量之差即為反硝化損失量。然而David[28]用質量平衡法估算美國伊利諾伊州的氮素收支平衡時發現，農業流域中氮的存儲量很大，因此對反硝化的估測容易產生誤差。質量平衡法也可以用來估測河流或海洋的反硝化速率，如Pribyl[29]監測了美國中部普拉特河流各種氮素輸入量（干濕沉降、地下水滲入、徑流注入等）和輸出量（蒸發、滲出、流出等）的大小，然后應用質量平衡法計算出河水中反硝化對氮的去除速率為2.11gNm-2d-1。Emery[30]用質量平衡法估算出全球海洋生態系統中每年大約有70×1012g氮通過反硝化消耗掉。應用質量平衡法測定生態系統反硝化發生程度的前提是：假定所研究的系統處于穩定的狀態，并能準確量化各種氮輸入和輸出量的大小。但是Seitzinger認為[31]在大尺度的陸地生態系統中，短時間內氮素輸入和輸出量的變化都很小，很難用質量平衡法監測到微量的反硝化損失，即便測定出反硝化損失，也有很大不確定性。而在海洋生態系統中應用質量平衡法測定反硝化的主要問題是，無法確定海洋是否處于一個穩定的狀態，對結果估測的準確性很低[30]。盡管存在上述缺點，對于大尺度陸地生態系統而言，質量平衡法仍舊是量化反硝化發生程度的一個比較好的方法，而且通過多年的觀測結果可以獲得相對準確的反硝化損失量。 1.5N2:Ar比測量法 與陸地生態系統相比，測定水體中反硝化產生的N2要容易得多。因為土壤和大氣存在著自由氣體交換，而在深水飽和密閉系統中基本不發生氣體交換，而且水中的氮氣背景值很低，這使得我們能夠相對容易的測定水體中反硝化的真實速率。目前常用的方法是N2:Ar比方法，該方法使用連續流動的水體不斷沖洗沉積物柱樣以模擬水體中的動態過程，然后定期采集進水口和出水口的水樣，用膜進口質譜儀測定水中的N2:Ar比，同時測量水流速度和土柱表面積來計算反硝化速率[32,33]。因為膜進口質譜儀對N2:Ar比的測定精度很高（N2:Ar比檢測限為0.03%），而且Ar是惰性氣體，含量非常穩定，因此這種方法可以相對準確的測定非擾動水體沉積物的反硝化速率，并具有很高的時間分辨率，測量速度快（<2min），樣品進樣量?。?lt;7mL），操作簡單[34]。這種方法的主要缺點是需要建立復雜的密閉系統，而且降低N2背景值需要的時間很長。基于N2:Ar比測量法的優點，今后可以把這種方法加以改進，以應用于N2背景值很高，氣體交換量很大的陸地生態系統中反硝化作用的測定。1998年，Kana[32]最早使用N2:Ar比方法測定了河水沉積物的反硝化速率，隨后采用這種方法量化了美國切薩皮克海灣的反硝化速率[35]，并指出N2:Ar比方法可以用于大尺度水體生態系統反硝化的測定。Pribyl通過比較發現[29]，用N2:Ar比方法測定大尺度河流反硝化的精度要比質量平衡法高。使用N2:Ar比測量法測定的反硝化速率是凈反硝化速率，即總反硝化速率與總氮固定速率的差值。An等人研究表明[36]，同時使用N2:Ar比方法和15N同位素示蹤法可以用來區分環境體系內的反硝化和固氮過程。Smith等研究發現[33]，上述兩種方法的聯用同樣可以用來測定深層水體中硝化—反硝化偶聯對N2排放量的貢獻。最近Khalil和Richards[37]用N2:Ar比方法研究了黑麥草和三葉草地不同深度土壤的反硝化潛勢和反硝化酶活性，并指出用N2:Ar比方法測定旱地土壤反硝化潛勢的精度很高，但是需要去除O2對測定過程的干擾。 1.6化學計量法 化學計量法主要用于估算水體環境中的反硝化，這種方法源于1934年Redfield觀察到海水中浮游植物和深層海水中的植物具有相同的元素組成比率（C∶N∶P=106∶16∶1），因此斷定海水中有機物質的元素組成穩定[38]?；谶@種發現，如果當一種具有已知元素比率組成的有機物在氧氣或其它電子受體（NO3-，SO42-）的參與下分解生成一系列已知的產物（CO2，H2PO4-，NO3-等），通過對電子受體的消耗量或者磷酸鹽、CO2和NO3-的生成量，就能夠計算出NO3-的生成量或消耗量，NO3-的理論值和觀測值之間的差異就是反硝化損失量。化學計量法實質上是建立在質量平衡法基礎之上的，只不過由于有機物的元素組成固定，我們可以通過其它元素通量的準確變化來計算氮素的變化。目前，化學計量法被廣泛用于測定海洋及港灣的反硝化。如Codispoti[39]用化學計量法估算出阿拉伯海域中每年大約有30×1012gN通過反硝化去除掉；Joye[40]使用化學計量法研究了美國托馬斯海灣沉積物的反硝化速率，并指出即使沉積物中存在硝化-反硝化偶聯，運用化學計量法仍能對反硝化速率做出準確的估算。然而，化學計量法在淡水中的應用較少，這是因為淡水中有機物質的元素組成沒有海水穩定[41]，由此獲得的測定結果比在海水中的誤差要大。然而Codispoti等指出[39]，在海水中，由于有機物質可能會與沉積物或者大氣發生反應，導致其分解過程中的化學定量關系存在很大的不確定性，因此用化學計量法估算全球海洋中反硝化的發生程度存在一定的誤差。盡管如此，在進行大尺度、大區域體系內反硝化的研究時，化學計量法仍不失為一種較好的估測水體（如海洋）反硝化的方法。#p#分頁標題#e# 1.7環境示蹤劑法 N2:Ar比測量法和化學計量法對于短期內水體反硝化速率的測定具有一定的優勢，但不適用于幾十年甚至幾百年內水體反硝化的研究，而環境示蹤劑法在一定程度上可以彌補這種不足。NO3-在水體遷移轉化過程中其濃度的降低可能遵循0級或1級反應速率，過程公式可以表示為：(Ct2-Ct1)=-k0×(t2-t1)或者(Ct2/Ct1)=exp[-k1×(t2-t1)]，其中Ct指t時間的NO3-濃度（t2>t1），k0是0級反應速率常數，k1是一級反應速率常數。使用此公式計算原位水體中的反硝化速率必須知道時間變化。環境示蹤劑法通過監測水中自然組分如氚（3H）、氦（3He）、碳（14C）的同位素數值，根據其質量衰變來計算時間變化，從而提供估測反硝化速率所需的時間信息。Cook和Herczeg[42]根據14C的質量衰變估算了時間的信息，研究發現深度為60m的地下水在7000年內的反硝化速率為7×10-5μmolNL-1d-1。他們同時指出，由于研究區域空間范圍大，所以變異較小，但是操作方法復雜，而且研究系統區域很難確定，對最終的結果很難解釋清楚。此外，環境示蹤劑數據不夠精確，致使對反硝化速率的估測不準確，但對于長時間尺度范圍內水體反硝化的定性研究仍具有重要意義。 2反硝化測定方法研究展望 生態系統中的反硝化過程一直是研究者所關注的熱點問題，針對反硝化測定的相關研究也取得了很大進展，但是仍舊沒有一種非常好的方法來量化反硝化速率，尤其是陸地生態系統中N2的背景值很高，導致很難定量反硝化產生的微量N2。盡管如此，近年來發展起來的一些方法如氣體流動培養技術和15N同位素示蹤技術在很大程度上促進了陸地生態系統反硝化的研究。然而反硝化研究的推進不僅取決于測定方法的改進，還與分析儀器的精密度密切相關，如能研制出測定精度更高的質譜儀和氣相色譜儀，勢必能推動氣體流動培養技術和15N同位素示蹤技術對反硝化的研究。廣泛應用于水體反硝化研究的N2:Ar比測量法其測定精度較高，具有很多優點，今后可以考慮把這種方法加以改進，用于研究陸地生態系統的反硝化過程。此外，雖然使用質量平衡法和化學計量法估算大尺度范圍內反硝化的發生程度存在很大不確定性，但是對于大尺度生態系統反硝化的定性研究仍是今后可以沿用的方法。