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作者：曹喜濤 陳凱 李揚 竇潔 王慧 周長林 奚濤 單位：中國藥科大學生命科學與技術學院 江蘇科技大學蠶業研究所
S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)是一種廣泛存在于生物體內并且具有重要生理功能的活性物質。它參與體內核酸、蛋白質、磷脂、體內激素和神經遞質生物合成和代謝等40多種生物反應［6-7］?？捎糜谥委熞钟舭Y［8］、關節炎［9］、肝功能紊亂等疾?。?0］、阿爾茲海默?。?1］，具有起效快，副作用小，安全可靠等特點。隨著SAM的價值逐漸被人們所認識，市場需求量也日趨增長［12］。目前美國市場常見的SAM成品藥主要為歐洲進口的硫酸對甲苯磺酸鹽雙鹽，還有部分產品為美國產穩定性更好的聚丁基磺酸鹽。而國內盡管進行了很多研究，但一直未能實現工業化生產。釀酒酵母是常見的真核生物，并且其全基因組序列已經測定完成，被美國食品與藥品安全管理局(FDA)認證為安全的微生物(GRAS，Generallyrecognizedassafe)［13］。利用釀酒酵母生產SAM已有的研究主要集中在高產菌株的篩選和誘變［14-17］、發酵條件的優化［18-24］、SAM2的過表達和DNAShuffling［25-31］、CBS基因敲除［32］等，但是這些研究主要集中在單個基因的過表達或者敲除的研究，同時也未見商業化應用的報道。本文采用gtme技術，通過對RNA聚合酶II轉錄起始復合物的TATA結合蛋白之一的SPT15和TATA結合蛋白相關因子之一TAF25編碼的基因進行易錯PCR，建立突變文庫，構建重組釀酒酵母菌株，研究了gTME對釀酒酵母sam代謝的影響，為獲得工業化生產菌株建立基礎。
1材料與試劑
1.1質粒和菌種pMD18-TVector克隆載體購自Takara公司，質粒pFA6a-GFPS65T-kanMX6由天津大學王靜宇惠贈，質粒pYES2.0由中國科學院上海生命科學研究院趙云坡博士惠贈，大腸桿菌E.coliDH5α、釀酒酵母S.cerevisiaeCGMCC2846由中國藥科大學微生物教研室保存。
1.2試劑限制性內切酶EcoRI、BamHI、NheI、T4DNA連接酶、Taq酶、PCR相關試劑、質粒提取試劑盒均購自Takara公司。限制性內切酶AgeI、凝膠回收試劑盒購自Fermentas公司，氨芐青霉素鈉鹽、Geneticin(G418硫酸鹽)購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。易錯PCR試劑盒為藍罡生物購自北京柏萊斯特科技發展有限公司。引物合成、DNA測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。1.3培養基大腸桿菌用LB培養基培養(g/L):酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl10，轉化子培養時添加50μg/mL氨芐青霉素。釀酒酵母用YPD培養基培養(g/L):酵母提取物10，蛋白胨10，葡萄糖20，固體培養基加入2%瓊脂粉和120μg/mLG418。篩選高產SAM菌株時采用O-medium(g/L)［33］:葡萄糖50，蛋白胨10，酵母提取物5，KH2PO44，K2HPO42，MgSO4•7H2O1.5，L-met3，pH6.0。
2方法
2.1釀酒酵母S.cerevisiaeCGMCC2846基因組的提取根據參考文獻［34］采用玻璃珠破碎的方法提取釀酒酵母基因組，作為擴增SPT15和TAF25基因的模板。
2.2spt15和taf25基因的克隆及其易錯PCR文庫的建立本研究中所用的引物見表1。轉錄因子spt15和taf25采用PCR的方法，以釀酒酵母總DNA為模板，擴增出的基因經瓊脂糖凝膠試劑盒回收后，與pMD18-T載體連接，轉化感受態E.coliDH5α。將正確轉化的E.coliDH5α由南京金斯瑞生物科技有限公司進行DNA測序。測得的基因序列登陸NCBI數據庫，進行序列比對。以獲得的SPT15和TAF25基因為模板，依據易錯PCR試劑盒的說明進行易錯PCR，構建轉錄因子spt15和taf25的易錯PCR文庫。
2.3重組釀酒酵母表達載體pYES-KanMX的構建和重組釀酒酵母篩選根據質粒pYES2.0酶切位點的特性，選擇G418基因的插入位點。引物Kan-F/Kan-R用于擴增G418基因，在正向引物中引入NheI的酶切位點，反向引物中引入NdeI的酶切位點。以質粒pFA6a-GFPS65T-KanMX6為模板，PCR擴增G418抗性標記基因，擴增產物連接到pMD18-T載體，構建pMD18-KanMX。然后分別對pMD18-KanMX和pYES2.0進行NdeI/NheI雙酶切，凝膠回收基因片段并用T4連接酶連接。構建表達載體pYES-KanMX質粒，使pYES2.0的營養缺陷標記改變為G418抗性標記。將spt15和taf25易錯PCR的片段經相應的限制性內切酶酶切，用T4連接酶連接經同樣限制性內切酶處理的表達載體pYES-KanMX，并轉化感受態的大腸桿菌DH5α，構建表達載體的易錯PCR文庫。提取轉錄因子spt15和taf25易錯PCR表達載體突變文庫的質粒，并用醋酸鋰的方法轉化感受態的釀酒酵母S.cerevisiaeCGMCC2846，以含120μg/mLG418的YPD培養基上，28℃培養2～3d。將單菌落影印到新的含有120μg/mL的G418的YPD平板上。28℃培養3～5d。將pYES-KanMX空載體轉化釀酒酵母菌株，獲得酵母對照菌株。
2.4轉錄因子spt15和taf25突變基因轉化子的篩選和發酵性能研究將YPD-G418平板上生長的酵母菌落保存于YPD斜面培養基上，分別接種于O-medium，200r/min，28℃條件下培養48h后用HPLC的方法測定SAM含量。將獲得SAM產量高于對照的陽性重組子，按2%的接種量接種于500mL錐形瓶(內有100mLO-mediun培養基)，控制起始的OD值一致，30℃、200r/min條件下培養。定時測定菌體OD600，繪制生長曲線，并測定發酵液中SAM的產量。SAM測定采用HPLC的方法，具體是1.0mL發酵液與2.0mL1.5mol/L高氯酸混勻，40℃反應0.5h，8000g離心10min，取上清過0.45μm備用。SAM含量用HPLC測定，色譜條件:江蘇漢邦C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，檢測波長254nm;流動相:0.1mol/L甲酸銨;體積流量:1.0mL/min;柱溫:40℃;進樣體積:10μL。2.5突變體的遺傳穩定性研究突變體在YPD斜面傳代，每48h轉接一次，共傳代5次，將傳代后的菌種進行生長和發酵試驗，并與原代的菌株進行比較，研究其SAM產量的傳代穩定性。
3結果
3.1spt15和taf25基因的克隆以S.cerevisiaeCGMCC2846的基因組DNA為模板，利用設計的引物進行PCR擴增，得到的PCR產物電泳檢測在0.75kb左右(圖1)。將PCR產物經純化后和克隆載體pMD18-T連接，連接產物轉化感受態的大腸桿菌DH5α，提取轉化子質粒，將陽性克隆進行基因序列測定，測序結果登陸NCBI數據庫進行序列比對，結果表明得到的SPT15和TAF25基因的序列與數據庫中的基因序列同源性100%。
3.2spt15和taf25基因易錯PCR文庫的建立利用易錯PCR試劑盒以質粒pMD18-SPT15和pMD18-TAF25為模板進行易錯PCR，經瓊脂糖電泳檢測易錯PCR產物與PCR產物基本相同(圖2)。將spt15和taf25易錯PCR的擴增片段經瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后用于構建表達載體的易錯PCR文庫。#p#分頁標題#e#
3.3重組釀酒酵母表達載體pYES-KanMX的構建和重組釀酒酵母篩選以質粒pFA6a-GFPS65T-KanMX6為模板，PCR擴增G418抗性標記基因，其基因大小約為1500bp(圖3)，將擴增產物連接到pMD18-T載體，構建pMD18-KanMX。然后對pMD18-KanMX和pYES2.0用限制性內切酶NdeI/NheI進行雙酶切，凝膠回收1.5kb和5.7kb的基因片段并用T4連接酶連接，成功構建了pYES-KanMX質粒，質粒酶切驗證圖4。對轉錄因子spt15和taf25的易錯PCR表達文庫中進行篩選，在初篩中分別獲得6和9株SAM產量高于對照的重組釀酒酵母菌株，在錐形瓶進行發酵復篩中得到了spt15-81和taf25-36的SAM產量明顯高于對照的重組菌株。
3.4轉錄因子spt15和taf25突變株重組釀酒酵母發酵產物的檢測對照菌株和重組菌株在含50g/L葡萄糖的O-mediun培養基中，28℃、200r/min的條件下發酵48h進行發酵性能研究，由于構建的表達載體質粒啟動子為半乳糖的啟動子，需要加入半乳糖進行誘導表達。在18h時加入2%半乳糖誘導發酵48h后，由圖5A可以看出，在加入半乳糖誘導以前，對照菌株生長略好于spt15-81和taf25-36突變株，在加入半乳糖誘導后，突變株spt15-81和taf25-36的生長則明顯好于對照菌株。到發酵結束，突變株spt15-81和taf25-36的OD600分別達到了26.25和23.15。由圖5B可以看出SAM產量的變化，到發酵結束48h時，對照菌株的SAM產量為1.30g/L，而突變株的SAM產量分別為2.60g/L和2.40g/L。由圖5C看出SAM的產量與對照株相比spt15-81和taf25-36分別提高了2.0倍和1.8倍。
3.5突變體的遺傳穩定性研究將突變株spt15-81和taf25-36在YPD培養基經過5次連續傳代后初步檢測SAM產量的遺傳穩定性，由圖6可以看出突變株spt15-81和taf25-36的SAM產量經傳代比較穩定。
4討論
近年來，國內外研究進行基因操作構建重組菌株時，一般獲得重組菌株是在受體菌株中過表達或者敲除代謝有關的少數或者幾個關鍵酶的基因，僅僅在局部改變了細胞代謝網絡的平衡，很難達到人們所期望的結果。本研究利用釀酒酵母spt15和taf25基因的易錯PCR，建立隨機突變文庫，獲得了SAM產量提高的釀酒酵母重組突變菌株，并對獲得菌株進行了初步研究。構建的兩株重組菌株為后續對該菌株的進一步改良、重組構建奠定了基礎。國內外已有的全轉錄工程的研究主要集中在生產工業乙醇的研究中，并且已有的結果表明，表達不同的轉錄因子可能和酵母菌株的遺傳背景有關。如Hou等報道了在工業酵母S.cerevisiaeTH-AADY中過表達spt3和spt15突變基因提高酵母乙醇耐性的研究，其結果表明，同時過表達spt15和spt3能提高酵母菌株的耐滲透壓和乙醇耐受性［35］;而趙心清等利用spt3的定向進化不僅提高了釀酒酵母工業菌株的乙醇耐性還提高了乙醇的產量［5］。Gao等通過同源重組的方法在釀酒酵母基因組整合了一個拷貝的spt15-300，經高密度發酵后能夠顯著提高乙醇的產量，同時，他認為gTME對于全局調控的影響是多基因水平的(圖7)，其機制非常復雜［36］。本實驗過程中釀酒酵母spt15和taf25的定向進化得到的眾多重組突變菌株中，大多數突變株SAM產量沒有明顯變化，甚至個別突變株SAM產量降低的很明顯。同時，可以看出目前獲得重組菌株距離實際的商業化應用還有相當大的差距，進一步優化突變頻率、調節載體質粒的拷貝數和調節啟動子活性，同時結合轉錄體(transcriptome)、蛋白質組(proteome)或者基因芯片等技術深入闡述全局轉錄的機制［1，37］，可能能夠獲得SAM產量、耐滲透性及耐其他脅迫條件(如高溫)提高的工業重組釀酒酵母菌株，為SAM實際產業轉化奠定基礎。